靈芝孢子粉破壁工藝優化及其抗腫瘤作用

劉春延，張國財*，程方志，張國珍*，趙 博，林連男（東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

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靈芝孢子粉破壁工藝優化及其抗腫瘤作用

劉春延，張國財*，程方志，張國珍*，趙 博，林連男
（東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以靈芝孢子粉為原料，采用高壓均質法破壁靈芝孢子，研究靈芝孢子粉破壁優化工藝及破壁孢子粉抗腫瘤作用。選取水為破壁溶劑，以均質壓力、均質次數、料液比為試驗因素，以靈芝孢子破壁率為試驗指標，通過單因素試驗及正交試驗對靈芝孢子破壁工藝進行優化。通過建立S180荷瘤小鼠模型，對破壁靈芝孢子粉的抗腫瘤作用進行研究。結果表明，最佳破壁工藝條件為均質壓力150 MPa、均質次數3、料液比1∶100（g/mL），破壁率為94.35%。抗腫瘤實驗表明，破壁靈芝孢子對小鼠S180肉瘤的抑制率為43.37%～57.59%，且肝體比和肺體比變化穩定，并可顯著提高小鼠的胸腺指數和脾指數。因此，破壁靈芝孢子粉具有良好的抗腫瘤作用。

靈芝孢子；破壁；高壓均質法；抗腫瘤作用

靈芝孢子粉（Ganoderma lucidum spores，GLS）是靈芝在生長成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細胞，具有靈芝的全部遺傳物質［1］。藥理研究表明，GLS具有抗腫瘤、增加免疫調節、保護肝臟、治療神經性疾病等多種藥理作用［2-8］。但由于GLS為雙壁結構，質地堅硬，由幾丁質和纖維素等高分子物質構成，限制了機體對孢內有效物質的消化吸收。為了充分利用靈芝孢內有效物質，破壁處理是必要的，且破壁處理可以提高GLS的生物活性［9-10］。

目前，國內外關于GLS破壁方法有超聲波處理法、酶水解處理法、離心剪切粉碎法和CO2超臨界處理法［11-13］等，但這些方法普遍存在效率低、破壁率較低的缺點，關于高壓均質法破壁GLS的工藝亦有報道，本實驗系統研究了高壓均質法GLS破壁工藝優化，并對破壁后靈芝孢子粉（broken Ganoderma lucidum spores，BGLS）的抗腫瘤作用進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLS由吉林白石山林業局培養并提供，品種為“韓芝1號”。抗腫瘤實驗中BGLS是用高壓均質機在最佳破壁工藝條件下獲得。

清潔級昆明種小鼠（雄雌各半，體質量（20±2）g）黑龍江省中醫藥大學。

小鼠實體移植肉瘤180（S180）由東北林業大學食品科學實驗室提供，液氮凍存。無水硫酸鋅、無水乙醇國藥集團化學試劑有限公司；注射用環磷酰胺（批號：20140942，200 mg/支） 江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

1.2 儀器與設備

血球計數板（25 mm×16 mm） 哈爾濱賽拓生化試劑儀器公司；TH-500BQ型超聲波儀 濟寧天華超聲電子儀器有限公司；QL901型渦旋混合器 江蘇海門其林貝爾公司；BH-2型普通光學顯微鏡 奧林巴斯公司；AH100B型高壓均質機 上海市ATS工業系統有限公司。

1.3 方法

1.3.1 GLS破壁工藝

GLS→過80 目篩→沖洗數次→抽干→烘干（60 ℃）→預處理GLS→制成懸濁液→超聲處理（1 h）［14］→振蕩（1 次/10 min數次）→高壓均質機破壁→BGLS懸濁液→減壓濃縮→BGLS

1.3.2 破壁率的測定

參考倪偉鋒［15］方法對BGLS采用血球計數板計數，并繪制標準曲線y=8 069.2x+1.694 4（y為孢子粉平均數，x為孢子粉質量，R2=0.999 5），按照（1）式計算破壁率：

式中：X為破壁率/%；Nl為從標準曲線查到的與待測樣品相同質量的未破壁GLS數目；N2為計數得到的BGLS樣品中未破壁的GLS數目。

1.3.3 單因素試驗設計

以水為破壁工藝溶劑，按照1.3.1節中的工藝對GLS進行破壁處理，通過單因素試驗考察料液比、均質壓力、均質次數對GLS破壁率的影響，單因素試驗設計見表1，固定條件為：料液比1∶100（g/mL）、均質壓力130 MPa、均質次數1。

表1 單因素試驗因素及水平設計Table 1 Factors and t heirl evels used for o ne-factor-at-a-time experiments

1.3.4 正交試驗設計

以料液比、均質壓力、均質次數為試驗因素，以破壁率為指標采用正交試驗設計法［16］對破壁工藝進行優化，正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 GLS破壁工藝正交試驗因素與水平Table 2 Factors and t heir levelsu sed for orthog on ala rray experiments

1.3.5 BGLS抗腫瘤作用

1.3.5.1 荷瘤造模

復蘇S180腫瘤細胞，腹腔接種，傳代3 次后用于實驗。無菌抽取傳代7 d、生長良好的S180荷瘤小鼠的腹水，加入生理鹽水調節腫瘤細胞分子數量濃度至1×107/mL。

小鼠60 只，雌雄各半，喂養1 周。造模時每鼠右腋皮膚消毒，于右腋皮下接種瘤細胞懸液，每只小鼠接種0.2 mL［17］。

1.3.5.2 分組給藥

接種24 h后，將小鼠隨機分為8 組，即模型對照（等容食用油）、GLS（0.5、1、2 g/kg）、環磷酰胺（75 mg/kg）和BGLS（0.5、1、2 g/kg）組。灌胃給藥，每天1 次，連續10 d［18-20］。

1.3.5.3 BGLS對S180荷瘤小鼠模型的影響

停藥次日稱質量并處死小鼠，分別稱取小鼠腫瘤質量、肝臟、肺、胸腺和脾臟質量，計算抑瘤率［21］、肝體比、肺體比、胸腺指數和脾指數［22］等，如式（2）～（6）所示：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對破壁率的影響

圖1 料液比對破壁率的影響Fig.1 Effects of solid-to-liquid ratio on the percentage of broken spores

由圖1可知，料液比在1∶50～1∶100（g/mL）范圍內，GLS破壁率隨著溶劑用量的增加而提高，當料液比為1∶100（g/mL）時，破壁率最大，達57.24%。當溶劑用量繼續增加時破壁率反而下降。然而高壓均質機處理GLS時，強大的機械力使GLS相互碰撞達到破壁的目的，當溶劑用量較小時，GLS之間碰撞距離較短，撞擊力較低，導致破壁率較低，隨著溶劑用量的增大，GLS之間的碰撞距離隨之增大，破壁率會因撞擊力變大而提高，但當溶劑用量增大到一定程度時GLS破壁率會因碰撞幾率減小而下降。故選料液比1∶100（g/mL）為最佳。2.1.2 均質壓力對破壁率的影響

圖2 均質壓力對破壁率的影響Fig.2 Effects of homogenization pressure on the percentage of broken spores

由圖2可知，GLS破壁率隨著均質壓力的增大而升高，當均質壓力在70～110 MPa時，破壁率較低且緩慢升高，當均質壓力達到110 MPa時，破壁率顯著升高，當達到高壓均質機最大均質壓力150 MPa時，破壁率達到57.38%。結果表明，利用高壓均質機對GLS破壁處理，均質壓力越大，提供的機械能越大，GLS破壁率越高。考慮到本實驗高壓均質機最大使用均質壓力為150 MPa，因此，均質壓力選擇130 MPa。

2.1.3 均質次數對破壁率的影響

圖3 均質次數對破壁率的影響Fig.3 Effects of the number of homogenization cycles on the percentage of broken spores

由圖3可知，GLS破壁率隨著均質次數增加而升高，當均質3 次時，破壁率達到89.33%，均質次數繼續增加，破壁率趨于平穩。因此，選擇均質次數3。

2.2 正交試驗結果

表3 GLS破壁工藝優化正交試驗設計與結果Table3 Orthog on alarray designlayout withexperimental results for pe rc en tag e disru pti on of G.luc idum s pores

表4 正交 試驗 結果 方差 分析Table4 Analysis of variance of theresults o for thog on alarray experiments

表4方差分析結果表明：3 個因素的主次順序為均質壓力（B）＞均質次數（C）＞料液比（A），即均質壓力對GLS破壁率具有極顯著的影響（P＜0.01），均質次數對破壁率影響顯著（P＜0.05），而料液比對破壁率的影響不顯著。

由表3、4可知，在正交試驗設計中，對于B因素，GLS破壁率在各水平間的差異顯著，B3和B1破壁率差異極顯著，以B3為最佳。對于C因素，GLS破壁率C1水平分別與C2、C3水平差異顯著，但C2水平和C3水平間無顯著差異，實踐中選取C2為最佳。對于A因素，GLS破壁率在各水平間無顯著差異，在A2水平上破壁率最大，因此，實踐中選取A2為最佳。綜合考量得出：GLS破壁工藝最優條件為B3C2A2，即均質壓力150 MPa、均質次數3、料液比1∶100（g/mL）。

2.3 驗證實驗

按照最佳破壁工藝B3C2A2采用高壓均質法對GLS進行3 次平行破壁處理，破壁率的平均值達94.35%，與正交試驗中的結果相吻合，進一步驗證了該破壁工藝的可行性。其中，GLS和BLGS的顯微結構見圖4，未破壁GLS視野范圍內孢子完整，而BGLS視野范圍內大部分孢子已被破壁，兩者差異明顯。

圖4 GLS （a）和BGLS （b）顯微鏡圖（×400）Fig.4 Optical microscope photographs of intact （a） and broken （b）G.lucidum spores （×400）

2.4 BGLS抗腫瘤功能

2.4.1 BGLS對S180荷瘤小鼠腫瘤質量的影響

表5 BGLS 對S180荷瘤小鼠腫瘤質量及抑瘤率的影響（x±s，n=6）Table 5 Inhibitory effects of broken G.luc idum sporeso nt umor gr ow th in S18 0 tum or-be ar in g mice （x± s，n=6）

由表5可知，給藥10 d后處死小鼠，剝離腫瘤后，各組腫瘤質量均低于模型對照組，且抑瘤率與給藥劑量呈一定正相關關系，當GLS給藥劑量相同時，BGLS劑量組抑瘤率均高于GLS劑量組，其中BGLS高劑量組腫瘤質量最小，抑瘤率最高，為57.59%，相比環磷酰胺組低了10.58%，相比BGLS中劑量組僅提高了0.53%。方差分析表明，GLS劑量組腫瘤質量與模型對照組差異顯著，證明GLS對S180有明顯的抑制作用，同時，BGLS劑量組與GLS劑量組差異顯著，BGLS高劑量組與BGLS中劑量組腫瘤抑制率無顯著差異，結果表明BGLS劑量組抑瘤率優于GLS劑量組。綜合考量，選BGLS中劑量組為最佳。

2.4.2 GLS對S180荷瘤小鼠肺體比、肝體比、胸腺指數和脾臟指數的影響

表6 BGLS對S180荷瘤小鼠肺體比、肝體比、胸腺指數、脾指 數的 影響 （x±s，n=6）Table 6 Effects of broken G.lucidum sporeso nl ung in dex， liver in dex，ch estg l and in d ex ， and spleen in d ex in S1 80 tum or-be ar in g m ice （x± s，n=6）

由表6可知，不同處理組肺體比和肝體比中，不同劑量組與模型對照組相比變化不大，且差異不顯著，表明GLS對小鼠肝肺影響較小；但環磷酰胺組肺體比和肝體比均高于其他處理組，且與其他處理組均有顯著差異。不同處理組胸腺指數中，BGLS劑量組胸腺指數均高于其他處理組，以BGLS中劑量組為最高，方差分析表明，BGLS劑量組胸腺指數與其他各處理組差異顯著；GLS劑量組胸腺指數與模型對照組相比變化不大且無顯著差異，環磷酰胺組胸腺指數比模型對照組下降了49.81%。分析結果表明，BGLS可以提高小鼠胸腺指數，GLS對小鼠胸腺指數無影響而環磷酰胺可以對使小鼠胸腺指數大大下降。不同處理組脾指數中，隨著GLS劑量組劑量的增加，脾指數呈上升趨勢，但BGLS高劑量組脾指數低于BGLS中劑量組，同時，BGLS中劑量組脾指數高于GLS劑量組，此外，環磷酰胺組胸腺指數與模型對照組相比下降了53.21%。方差分析表明，GLS和BGLS劑量組脾指數與模型對照組具有顯著差異，與環磷酰胺處理組差異極顯著，分析結果表明，GLS可以提高小鼠脾指數，且以BGLS中劑量組為最佳，環磷酰胺可以對使小鼠脾指數下降。

3 討論與結論

通過單因素試驗和正交試驗優化法探討高壓均質法破壁GLS工藝條件，確定最佳破壁工藝參數為：均質壓力150 MPa、均質次數3、料液比1∶100（g/mL）。高壓均質機與傳統工藝相比，高壓均質機操作簡單，更易于實現工業化生產。本研究發現，GLS平均破壁率與均質壓力呈正相關，由于受實驗裝置的構造所限不可能無限地增大均質壓力，故本實驗選擇最大均質壓力為150 MPa。

抗腫瘤實驗表明，GLS劑量組與模型對照組相比具有明顯的抗腫瘤作用，環磷酰胺組對S180荷瘤小鼠的平均抑瘤率雖然最高，但其會大大降低S180荷瘤小鼠胸腺指數、脾臟指數，出現肺體比增大和肝體比增大等現象，對免疫器官的損傷，極大降低了機體的抵抗力，同時，GLS劑量組中S180荷瘤小鼠肺體比和肝體比比較穩定，且胸腺指數和脾指數與模型對照組相比有上升趨勢，這表明GLS對小鼠不但有抑制腫瘤生長的作用，同時還可以增強小鼠的免疫功能，這與李潔［23］的白花蛇舌草對S180小鼠的抗腫瘤研究的結果相符。此外，通過比較BGLS與GLS的抗腫瘤效果，結果發現，BGLS可以更顯著提高S180小鼠的抗腫瘤活性及免疫功能，這與Liu Xin［2］、吳學謙［24］等的研究結果相符，并且腫瘤抑制率與給藥劑量的呈正相關，這與馬晶晶［25］的研究結果相符，但BGLS的抗腫瘤效果中，BGLS中劑量組作用最明顯，因此，BGLS使用時并不是劑量越大越好，而是存在最適劑量，這與林庶茹等［26］的研究結果相符。故在抗腫瘤實驗中選用BGLS中劑量組為最佳，為1 g/kg。本研究為BGLS的抗氧化、改善細胞呼吸、抑制凋亡、腸道菌群調節和刺激細胞因子等生物活性的深入研究提供了參考。

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Optimization of Disruption of Ganoderma lucidum Spores and Antitumor Effect of the Broken Spores

LIU Chunyan， ZHANG Guocai*， CHENG Fangzhi， ZHANG Guozhen*， ZHAO Bo， LIN Liannan
（College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

The purpose of this study was to investigate the optimum conditions for breaking Ganoderma lucidum spores by high-pressure homogenization using water as the solvent and to evaluate the antitumor effect of the broken spores.The optimization of three process variables including solid-to-liquid ratio， homogenization pressure， and the number of homogenization cycles for improved percentage of broken spores was conducted through one-factor-at-a-time and orthogonal array experiments.S180 tumor-bearing mice models were established for evaluation of the antitumor effect of the broken G.lucidum spores.The results showed that the optimal conditions for breaking G.lucidum spores were obtained as follows: homogenization pressure， 150 MPa； homogenization cycles， 3 times； and solid-to-liquid ratio， 1:100 （g/mL）.Under these conditions， the percentage of broken spores could be up to 94.35%.Antitumor tests showed that the percentage inhibition of tumor growth in S180 tumor-bearing mice by the broken spores was 43.37%-57.59%， and the liver index and lung index were little affected while the thymus index and spleen index were significantly enhanced.Therefore， broken G.lucidum spores possessed good antitumor effect.

Ganoderma lucidum spores； spore disruption； high pressure homogenization method； antitumor effect

10.7506/spkx1002-6630-201614009

R285.5

A

1002-6630（2016）14-0051-05

劉春延， 張國財， 程方志， 等.靈芝孢子粉破壁工藝優化及其抗腫瘤作用［J］.食品科學， 2016， 37（14）: 51-55.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614009. http://www.spkx.net.cn

LIU Chunyan， ZHANG Guocai， CHENG Fangzhi， et al.Optimization of disruption of Ganoderma lucidum spores and antitumor effect of the broken spores［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 51-55.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201614009. http://www.spkx.net.cn

2015-11-19

哈爾濱市科技局科技項目（2014FF6CJ002）；中央高校基本科研業務費專項（2572014AA08）

劉春延（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食用菌活性成分。E-mail：Lcy7621@126.com

*通信作者：張國財（1964—），男，教授，博士，研究方向為森林資源保護及利用。E-mail：Zhang640308@126.com

張國珍（1964—），女，高級工程師，博士，研究方向為森林培育資源。E-mail：Zhangguozhen60@126.com