正相高效液相色譜法測定腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過氧化物的含量

任 雙，宋 慧，耿志明，王道營，張牧焓，孫 沖，徐為民，*（1.南京農業大學 肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 10095；.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 10014；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 10095）

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正相高效液相色譜法測定腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過氧化物的含量

任 雙1，2，3，宋 慧1，2，耿志明2，王道營2，張牧焓2，孫 沖2，徐為民1，2，3，*
（1.南京農業大學 肉品加工與質量控制教育部重點實驗室，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協同創新中心，江蘇 南京 210095）

采用正相高效液相色譜法對腌臘肉制品中的磷脂酰膽堿氫過氧化物（PC-OOH）進行檢測。腌臘肉制品中的PC-OOH用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）提取，以合成的C16∶0/18∶2PC-OOH為標樣，采用正相高效液相色譜-紫外法進行檢測。色譜柱：Lichrosorb Si60（250 mm×4.0 mm，5 μm）；流動相：A為水，B為正己烷-異丙醇（3∶2，V/V），采用梯度洗脫；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：234 nm。結果表明：C16∶0/18∶2PC-OOH在20～600 nmol/mL范圍內呈現良好的線性關系（R2=0.999 9），檢出限為5.8 nmol/mL，定量限為19.4 nmol/mL，不同水平的平均回收率為79.4%～91.9%。實際樣品分析顯示，農家臘腸A、B和火腿中方樣品中PC-OOH的含量比較高，為92.4、106.4 nmol/g和102.5 nmol/g，煙熏肉中未檢出PC-OOH。本實驗建立的分析方法簡便快捷、具有較好的靈敏度和可靠性，可用于腌臘肉制品中PC-OOH的定量分析。

腌臘肉制品；1-棕櫚酰-2-亞油酰-磷脂酰膽堿；氫過氧化物；正相高效液相色譜法

在光、金屬離子、酶等存在的條件下，脂質發生氧化反應，產生初級氧化產物——脂質氫過氧化物（hydroperoxides，HPs）。脂質HPs進一步降解形成一系列揮發性和非揮發性次級氧化產物，是食品酸敗、產生異味的主要原因［1-2］。脂質氧化降低食品的營養價值和品質安全，其產物與多種疾病的形成與發展相關，如心血管疾病［3］、阿爾茨海默氏病［4］、癌癥［5］和衰老［6］。磷脂是細胞膜和血清脂蛋白的主要成分，多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）含量顯著高于脂肪酸甘油酯，因此有關磷脂HPs，尤其是磷脂酰膽堿HPs （PC-OOH）的研究，是脂質氧化的研究重點［7］。在現有的脂質HPs分析方法中，碘量法［8］、比色法［9］和硫代巴比妥酸法［10］等主要用于脂質HPs總量的測定，缺乏選擇性，不適用于PC-OOH的分析。基于谷胱甘肽過氧化物酶和環氧化酶的一些酶促反應方法［11］，具有較好的選擇性和靈敏度，但是這些酶通常都難以獲得。高效液相色譜-柱后衍生分析法和高效液相色譜-串聯質譜法，均具有優異的選擇性和靈敏度，滿足食品及生物樣本中包括PC-OOH在內的脂質HPs的定性定量分析，但前者由于衍生反應自身的局限，缺少穩定性，而后者運行費用昂貴、難以普及。高效液相色譜-紫外檢測器分析法［12-14］，利用PUFA氧化后產生的共軛雙鍵在234 nm波長處的特征吸收，對其HPs進行定性、定量分析。高效液相色譜-紫外檢測器分析法適用于含共軛雙鍵的脂肪酸HPs的分析，具有較好的選擇性和靈敏度，操作簡便且無需昂貴設備及設施。這一方法早期多用于脂質氧化模擬體系中亞油酸（linoleic acid，LA）及其甲酯的初級氧化產物LA-OOH的分析，隨后被成功應用于包括PC-OOH在內的人體紅細胞膜磷脂HPs的分析，但尚未見其應用于動物性食品中磷脂HPs分析的研究報道。

腌臘肉制品是以畜禽肉類為原料，在低溫條件下，通過加鹽（或鹽鹵）和香料進行腌制，經過長時間的自然風干成熟，形成獨特腌臘風味的傳統肉制品。動物肌肉中的磷脂（亦稱肌內磷脂）占肌內總脂肪的50%以上，肌內磷脂中PC占45%～60%［15］。磷脂中的多不飽和脂肪酸是脂質氧化反應最主要的靶標［12］，對于腌臘肉制品的生產工藝而言，脂質氧化、尤其是肌內磷脂氧化是最主要的生化反應，是風味物質的主要來源，在某種程度上決定了產品品質，因此對磷脂氧化進行必要的監測與調控至關重要［16-17］。目前通常采用過氧化值、硫代巴比妥酸、雙烯值以及羰基值等的檢測，評價腌臘肉制品中脂質氧化的程度。但對于脂質氧化產物類別、產生途徑，并在此基礎上對脂質氧化進行調控無法足夠的信息。本實驗通過自由基氧化法，制備肌內磷脂中最常見的磷脂酰膽堿分子種C16∶0/18∶2PC的氫過氧化物（C16∶0/18∶2PC-OOH），并以此為PC-OOH標樣，建立腌臘肉制品中PC-OOH的高效液相色譜分析方法。樣品中的PC-OOH經提取、濃縮后，在硅膠柱上分離，通過二極管陣列檢測器（diode array detector，PAD）在234 nm波長處進行檢測。本實驗建立的方法操作簡便、快捷，擁有良好的靈敏度。這一方法可用于腌臘肉制品生產過程中磷脂酰膽堿氧化的監測，也可用于肉制品加工過程中磷脂酰膽堿氧化途徑、及其對脂質氧化貢獻等相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

農家臘腸、蘇式臘腸、煙熏肉 市購。

磷脂酰膽堿標準品（C16∶0/18∶2PC，純度99%） 美國Sigma公司；異丙苯過氧化物 加拿大TRC公司；甲醇、氯仿、正己烷、異丙醇（均為色譜純） 美國Tedia公司；自由基誘導劑2，2′-偶氮二異庚腈（純度99%） 上海一基實業有限公司；三苯基磷化合物（1，3-bis（diphenylphosphino）propane，DPPP，純度95%）東京化成工業株式會社；水由純水儀（美國Millipore公司）制備；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

e2695高效液相色譜（PAD） 美國Milford公司；Biofuge stratos高速離心機 德國Heraeus公司；HS2060A超聲波振蕩器 常州國華電器有限公司；烘箱上海索譜儀器有限公司；RE-85C真空旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 C16∶0/18∶2PC-OOH標品的制備

［18］方法，并略做修改。稱取20.0 mg標品C16∶0/18∶2PC溶于5 mL甲醇，再加入20.0 mg自由基誘導劑2，2′-偶氮二異庚腈，在黑暗中，30 ℃條件下反應24 h。反應結束后再加入2，6-二叔丁基對甲酚（2，6-di-tertbutyl-4-methylphenol，BHT），防止C16∶0/18∶2PC-OOH進一步轉化。制得未知濃度的C16∶0/18∶2PC-OOH標準溶液，根據文獻［19-20］選擇貯存條件為-20℃，保存期：1 個月。

1.3.2 C16∶0/18∶2PC-OOH標品的定量

按參考文獻［21］，并略做修改。首先使用熒光分光光度計建立過氧化值（peroxide value，POV）標曲，取0.5、2、4、6、8 nmol異丙苯過氧化物，分別加入裝有0.8 mL 3 μg/mL DPPP溶液的試管中，最后定容為1.6 mL。60 ℃烘箱中反應1 h，冰水浴30 min，然后使用熒光分光光度計檢測，激發波長352 nm，發射波長380 nm，建立POV標準曲線。

與此同時，取100 μL上述C16∶0/18∶2PC-OOH溶液，加入裝有0.8 mL 3 μg/mL DPPP溶液的試管中，最后定容為1.6 mL。60 ℃烘箱中反應1 h，冰水浴30 min，然后使用熒光分光光度計檢測。根據上面的POV標準曲線，得到C16∶0/18∶2PC-OOH的質量濃度。

1.3.3 標準溶液的配制

取適量1.3.2節中定量的C16∶0/18∶2PC-OOH溶液，用甲醇稀釋，配制800 nmol/mL C16∶0/18∶2PC-OOH儲備液。用移液管吸取適量標準儲備溶液，用流動相B（正己烷-異丙醇，3∶2，V/V）稀釋配制物質的量濃度為20、80、240、420、600 nmol/mL的C16∶0/18∶2PC-OOH系列工作溶液，儲存于-20℃，1 個月以內使用。

1.3.4 樣品處理

根據Folch等的方法［22］，略作修改提取脂質。樣品粉碎后，取3.0 g 于80 mL離心管中，加入20 mL含有0.1% BHT的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，低速勻漿后再加入25 mL氯仿-甲醇，靜置1 h，5 000 r/min離心15 min，過濾后濾渣中再加入15 mL氯仿-甲醇，合并2 次的濾液，加入0.3 倍體積的生理鹽水（7.3 g/L NaCl，0.5 g/L CaCl2），然后3 000 r/min離心15 min，吸凈上層液體，剩余液體用真空旋轉蒸發器真空蒸干，最后加入氯仿溶解，定容至2.0 mL，在-20 ℃貯存備用。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Lichrosorb Si60（250 mm×4.0 mm，5 μ m）；流動相：A為水，B為正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）；梯度洗脫（表1），流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：234 nm；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluti on p rogram

1.3.6 重復性實驗

配制不同質量濃度的C16∶0/18∶2PC-OOH標準溶液，進行正相高效液相色譜測定，以測定的結果計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 精密度實驗

取一份農家臘腸樣品A，在1 d的不同時段對樣品進行6 次正相高效液相色譜測定，連續4 d每天測定一次，以測得的結果分別計算日內和日間的標準偏差。

1.3.8 回收率實驗

稱取3.01 g農家臘腸樣品B，根據其PC-OOH含量添加不同水平的C16∶0/18∶2PC-OOH標準品，按1.3.4節樣品處理步驟進行實驗，測定PC-OOH含量，計算回收率，樣品做3 次平行實驗。

2 結果與分析

2.1 樣品處理條件的優化

腌臘肉制品水分低，蛋白質含量高，按Folch等［22］的方法進行提取，C16∶0/18∶2PC-OOH的提取率很低。本實驗將生理鹽水的用量從0.2 倍提高到0.3 倍，同時對濾渣進行第2次萃取、離心分離，極大地提高了C16∶0/18∶2PCOOH提取率，最終C16∶0/18∶2PC-OOH的回收率達到79.4%～91.9%。

在磷脂的分離及定量分析中，常采用固相萃取（solid phase extraction，SPE）小柱（如氨丙基硅膠小柱）對磷脂進行分離、凈化、濃縮［22-23］。在本實驗中，也嘗試使用了硅膠柱、氨基柱等SPE小柱，但這些小柱并未對樣品中C16∶0/18∶2PC-OOH有顯著的凈化、濃縮作用，甚至SPE小柱的使用反而降低了回收率。圖1、2分別是C16∶0/18∶2PC-OOH標準品和樣品的色譜圖，C16∶0/18∶2PCOOH與雜質峰實現基線分離，本實驗確定的樣品處理方法具有理想的提取、凈化效果，滿足腌臘肉制品中PCOOH分析的要求。

圖1 240 n mol /m L C16∶0 /18∶2P C-O O H 在234 nm波長處的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of C16∶0/18∶2 PC-OOH （240 nmol/mL） detected at234 nm

圖2 農家臘腸樣品 B 中106.4 nmo l/g P C-O O H 的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of PC-OOH （106.4 nmol/g） in farm-made sausage B sample

2.2 色譜條件的優化

PC是一種兩性分子，由親水的頭部和疏水的尾部組成，呈弱極性，而PC-OOH的極性略強于PC。高效液相色譜法分析PC-OOH時可采用反相色譜柱分離［14，19，24］、也可采用正相色譜柱分離［12-13］。本實驗在比較了反相色譜柱（C18）、正相柱（氨基柱、硅膠柱）分離腌臘肉制品中PC-OOH的效果后，選擇以硅膠柱（Lichrosorb Si60）為色譜柱，主要是因為使用反相柱和氨基柱時，PC-OOH出峰太快，與其他磷脂類物質的氫過氧化物的分離效果不好。

為了得到最佳的分離效果，分別配制了3 種流動相體系：不同比例的乙腈-甲醇-水、正己烷-異丙醇和正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）-水，觀察三者對PC-OOH在硅膠柱上保留行為的影響。結果發現，正己烷-異丙醇（3∶2，V/V）-水組成的流動相下PC-OOH的峰形最好，流動相中水的增加有利于縮短保留時間、增加峰高，但水含量的上升影響流動相互溶，同時對硅膠色譜柱帶來不利影響。采用等度洗脫時，PC-OOH出峰太快，不能與周圍的雜質峰分離開。在綜合考慮后確定了表1中的流動相組成以及梯度洗脫方式。

PUFA氧化形成的初級產物含有共軛雙鍵，其在234 nm波長處的特征性紫外吸收為采用紫外檢測器或PAD檢測成為可能。本實驗采用PAD觀察了C16∶0/18∶2PC-OOH在190～400 nm波長范圍的吸收，結果表明合成的C16∶0/18∶2PCOOH以及樣品中的PC-OOH同樣在234 nm波長條件下有最大吸收峰，且在234 nm波長條件下基線平穩（圖1）。

本實驗還觀察了溫度、流速對C16∶0/18∶2PC-OOH在正相硅膠柱上的保留行為的影響，二者對C16∶0/18∶2PC-OOH的保留時間有一定影響，但對檢測靈敏度影響不大，最終將溫度設為30 ℃，流速1.0 mL/min。在設定的色譜條件下，C16∶0/18∶2PC-OOH出峰時間在25.3～26.8 min，樣品中的PC-OOH出峰時間為24.8～26.8 min（圖1、2）。

亞油酸含有兩個C=C雙鍵，自由基誘導的C16∶0/18∶2PC的初級氧化產物C16∶0/18∶2PC-OOH有4 個異構體［25-26］。在高效液相色譜的分析方法中，由于采用的色譜柱及流動相的差異，這4個異構體常呈現1 個色譜峰或2、3個相連的色譜峰［18，27］。在本實驗設立的色譜分離條件下，合成的C16∶0/18∶2PC-OOH標樣呈現出2 個相連的色譜峰，而在腌臘肉制品的色譜圖中，PC-OOH出峰時間比C16∶0/18∶2PCOOH有所提前，且呈現出3 個相連的色譜峰。磷脂中的多不飽和脂肪酸是脂質氧化反應最主要的標靶，反應形成的共軛雙鍵使得利用紫外檢測器或PAD在234 nm波長處檢測PC-OOH成為可能［12］。在動物肌肉內PC的sn-2上，主要是亞油酸（C18∶2），還有少量的花生四烯酸（C20∶4）；而在PC的sn-1上，除棕櫚酸（C16∶0）外，還有少量的硬脂酸（C18∶0）和亞油酸（C18∶1）［15］。正是由于動物肌內磷脂的PC分子種存在多樣性，以及腌臘肉制品加工過程中脂質氧化的復雜性（酶促氧化、自由基誘導的自動氧化同時存在），樣品中的PC-OOH為多種PC分子種的氫過氧化物的混合物［14，25，28］，它們的分子質量都大于C16∶0/18∶2PC-OOH的分子質量，經過正相硅膠柱的分離，保留時間有所提前，并且色譜圖比C16∶0/18∶2PC-OOH標樣更加復雜。雖然PC-OOH呈現出多個色譜峰相連的現象，但其總面積反應的是不同共軛雙鍵（包括不同異構體以及不同PC分子種）的總吸收。鑒于動物肌肉中PC的sn-1以棕櫚酸為主、sn-2以亞油酸為主，以合成的C16∶0/18∶2PCOOH為標樣、以nmol/g為單位定量樣品中PC-OOH的總量是合理的，也是可行的。

2.3 線性范圍及最低檢出限

配制物質的量濃度為20、80、240、420、600 nmol/mL 的C16∶0/18∶2PC-OOH系列標準工作溶液。在234 nm波長處進行正相高效液相色譜測定分析，以C16∶0/18∶2PC-OOH物質的量濃度/（nmol/mL）為橫坐標X，以對應峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。回歸方程Y=11 150X-47 379，相關系數R2=0.999 9。由此可見在20～600 nmol/mL范圍內，C16∶0/18∶2PC-OOH濃度與峰面積有良好的線性關系。

按照3 倍信噪比（RSN=3）和10 倍信噪比（RSN=10）計算方法的檢出限和定量限，檢出限為5.8 nmol/mL，定量限為19.4 nmol/mL。按1.3.4節樣品處理換算，樣品中的PC-OOH的檢出限為3.9 nmol/g，定量限為12.9 nmol/g。

2.4 重復性實驗結果

配制32、64、95 nmol/mL的C16∶0/18∶2PC-OOH標準溶液，按照1.3.5節色譜條件進行分析，每個濃度重復操作3 次，記錄峰面積，得32、64、95 nmol/mL的C16∶0/18∶2PCOOH標準溶液峰面積的RSD分別為1.1%、0.9%、0.3%，結果表明本實驗建立的方法具有良好的重復性。

2.5 精密度實驗結果

本方法的精密度通過對農家臘腸樣品A中PC-OOH的日內和日間實驗來評價的，實驗結果見表2和表3。PCOOH精密度（RSD）的范圍為1.2%～2.6%，表明本實驗所建立的檢測方法具有較好的精密度。

表2 日內精密度實驗結果Table 2 Intra-day precisi on of the method for determ in ati on of PC-OOH

表3 日間 精密 度實 驗結 果Table 3 Inter-day precisi on of the method for determ in ati on of PC-OOH

2.6 回收率實驗結果

稱取3.0 g農家臘腸樣品B于離心管中，分別加入低、中、高水平的C16∶0/18∶2PC-OOH標準溶液，然后按1.3.4節進行樣品處理，按1.3.5節色譜條件進行正相高效液相色譜檢測，計算回收率，結果見表4。

表4 C 16∶0/18∶2PC-OO H不 同添 加水 平回 收率 測定 結果 （n=3）Table 4 Recoveries of C1 6∶0/18∶2PC-OO Ha td ifferentspi ked lev els（n= 3）

由表4可以看出，樣品回收率在79.4%～91.9%之間，平均回收率為87.5%。

2.7 實際樣品分析

為了進一步驗證本實驗建立的腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過氧化物的檢測方法，本實驗分別分析了農家臘腸A、B和蘇式香腸、咸肉、火腿中方、煙熏肉的含量，結果見表5。表5表明，農家臘腸A、B和火腿中方樣品中PC-OOH的含量比較高，分別為92.4、106.4 nmol/g和102.5 nmol/g，在煙熏肉中未檢出PC-OOH。

表5 實際樣品分析結果（n=3）Table5 C on tents of PC-OOH in real samples （n= 3）

3 結 論

本實驗通過樣品處理條件和色譜條件的優化，以合成的C16∶0/18∶2PC-OOH為標樣，建立了腌臘肉制品中PCOOH的正相高效液相色譜-PAD檢測方法。腌臘肉制品中的PC-OOH經氯仿/甲醇提取、濃縮后，在正相硅膠柱上以水、正己烷、異丙醇為流動相進行色譜分離。在20～600 nmol/mL的線性范圍內，檢出限、定量限分別為5.8 nmol/mL和19.4 nmol/mL，在32～240 nmol/g的添加范圍內，平均回收率87.5%。對實際樣品的分析檢測中，農家臘腸A、B和火腿中方樣品中PC-OOH的含量比較高，分別為92.4、106.4 nmoL/g和102.5 nmoL/g，煙熏肉中PCOOH的含量太低，未檢出。結果表明，腌臘肉制品中普遍存在磷脂酰膽堿氫過氧化物，其形成途徑、影響因素及其最終歸宿值得進一步關注。本實驗方法操作簡便、具有良好的靈敏度和準確性，可用于腌臘肉制品中PCOOH的檢測，也可用于肉制品加工過程中磷脂酰膽堿氧化途徑、及其對脂質氧化貢獻等相關研究。

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Determination of Phosphatidylcholine Hydroperoxide in Dry Cured Meat Products by Normal-Phase High Performance Liquid Chromatography

REN Shuang1，2，3， SONG Hui1，2， GENG Zhiming2， WANG Daoying2， ZHANG Muhan2， SUN Chong2， XU Weimin1，2，3，*
（1.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China；2.Institute of Agricultural Products Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China；3.Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing， Nanjing 210095， China）

A normal-phase high-performance liquid chromatographic （HPLC） method was established to determine phosphatidylcholine monohydroperoxide （PC-OOH） in dry cured meat products.The PC-OOH in dry cured meat samples was extracted with chloroform/methanol （2:1， V/V）， followed by determination by normal-phase HPLC connected to a photo-diode array detector （HPLC-PAD） with synthetic C16:0/18:2PC-OOH as the standard.The chromatographic conditions were established using a Lichrosorb Si60column （250 mm × 4.0 mm， 5 μm） with a mobile phase consisting of water and n-hexane/isopropanol （3:2， V/V） in gradient elution at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 234 nm.Results indicated that the linearity ranged from 20 to 600 nmol/mL （R2= 0.999 9）， and the limits of detection （LOD）and limits of quantification （LOQ） were 5.8 nmol/mL and 19.4 nmol/mL， respectively.The recoveries from spiked samples at concentration levels of 32-240 nmol/g were in the range of 79.4%-91.9%.The contents of PC-OOH in farm-made sausage A， B and Chinese ham samples were 92.4， 106.4 and 102.5 nmol/g， respectively， while PC-OOH in smoked meat was not detected.This method proved to be of high maneuverability， excellent sensitivity and high accuracy， and could be used for quantitative analysis of PC-OOH in dry cured meat samples.

dry cured meat； 1-palmitoyl-2-linoleoyl-phosphatidylcholine； hydroperoxide； normal-phase HPLC

10.7506/spkx1002-6630-201614027

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0154-06

任雙， 宋慧， 耿志明， 等.正相高效液相色譜法測定腌臘肉制品中磷脂酰膽堿氫過氧化物的含量［J］.食品科學， 2016，37（14）: 154-159.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614027. http://www.spkx.net.cn

REN Shuang， SONG Hui， GENG Zhiming， et al.Determination of phosphatidylcholine hydroperoxide in dry cured meat products by normal-phase high performance liquid chromatography［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 154-159.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614027. http://www.spkx.net.cn

2015-10-10

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401560）；江蘇省農業科技自主創新資金項目（CX（13）3081）

任雙（1990—），女，碩士研究生，研究方向為肉品加工與質量控制。E-mail：2013108049@njau.edu.cn

*通信作者：徐為民（1969—），男，研究員，博士，研究方向為肉品加工與質量控制。E-mail：weiminxu2002@aliyun.com