柱前衍生化-高效液相色譜法測定地溝油中的脂肪醛

沈衛陽，王潔瓊，王 婉，于清峰，肖 瑩*（中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198）

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柱前衍生化-高效液相色譜法測定地溝油中的脂肪醛

沈衛陽，王潔瓊，王 婉，于清峰，肖 瑩*
（中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198）

研究利用油脂中的不飽和脂肪酸在提煉過程中發生脂質過氧化反應、產生低分子脂肪醛的特點，采用柱前衍生化-高效液相色譜法，以2，4-二硝基苯肼為醛的衍生化試劑、2-甲基吡啶硼烷為還原劑，通過測定脂肪醛類物質來檢測食用油中是否摻入了地溝油。結果表明：與食用油相比，精制地溝油中甲醛、乙醛的含量顯著增加，可據此判斷樣品是否為地溝油。該方法專屬性強、靈敏度高、準確性好，極大地優化了地溝油的檢測與鑒定流程。

地溝油；脂肪醛；2，4-二硝基苯肼；高效液相色譜

近年來，媒體多次報道地溝油經回收、加工重新流入食用油市場，由于地溝油質量和衛生較差，并且其中有害物質嚴重超標［1-2］，可誘發多種疾病甚至致癌［3-4］。目前質檢部門對食用油的檢測主要是理化指標檢查［5-6］，如膽固醇含量［7］、電導率［8-9］、脂肪酸相對不飽和度［10］、易揮發成分烷烴［11］、酸價、羰基值、鈉氯離子含量［12-14］、皂化值、過氧化值、碘值、重金屬含量、三酰甘油聚合物、氧化三酰甘油［15-17］等指標。但這些常規方法流程多、耗時長，特異性不強，且精制的地溝油均符合規定，給質檢部門和相關機構帶來很大的困擾。因此如何快速有效鑒別和檢測食用油中是否混入地溝油，正成為研究的熱點。

地溝油提煉自經加工過的普通食用油脂，其主要成分為高級脂肪酸甘油酯，在地溝油的加工、提煉過程中受氧氣、高溫等因素的作用，其中的不飽和脂肪酸甘油酯會發生水解及脂質過氧化反應［18-19］，進一步裂解形成食用油中本身不含的脂肪醛類物質［20-21］。基于該原理，董樹清等［22-23］使用2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrobenzene hydrazine，DNPH）作為醛的衍生化試劑，應用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對精煉地溝油進行了檢測。然而DNPH與脂肪醛反應時會生成C=N雙鍵的順、反異構體，這會使分析結果不準確，降低檢測靈敏度。Uchiyama等［24-25］研究表明，2-甲基吡啶硼烷（2-picoline borane，2-PB）可選擇性還原C=N雙鍵，使C=N雙鍵順、反異構體轉化為相同結構。本實驗采用DNPH衍生化、2-PB還原后用HPLC法測定地溝油中脂肪醛的方法，對食用油及地溝油中可能含有的飽和脂肪醛進行檢測并定量，結果表明該方法簡單易行、準確可靠、靈敏度高，可為地溝油的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同批次食用油（福臨門葵花籽油）購于南京市超市，且已開啟包裝；粗制地溝油為某食堂餐廚垃圾中的上層油脂漂浮物經過過濾和加熱除水后的殘留物，精制地溝油是取粗制地溝油參考董樹清等［22-23］的方法自制。

乙醛（≥99.5%）、丙醛（≥99.5%）、丁醛（≥99.5%）、戊醛（98%）、己醛（≥99.0%）、庚醛（≥98%）、辛醛（99%）、壬醛（96%）、癸醛（97%） 上海阿拉丁公司；衍生化試劑DNPH（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；2-PB絡合物（95%） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；乙腈（色譜純） 默克股份兩合公司；水為超純水；純氮（≥99.99%） 南京上元工業氣體廠。

1.2 儀器與設備

HPLC儀（包括1379脫氣機、1312二元泵、1314紫外檢測器） 美國Agilent公司；TS-100恒溫混勻儀 杭州瑞誠儀器有限公司；XK-1200型離心機 江蘇新康醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合醛標準品衍生化反應

1.3.1.1 混合醛標準溶液的制備

分別取一定量的乙醛、丙醛、丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、癸醛標準品溶于乙腈配成20 mmol/L混合醛儲備液。將儲備液稀釋10 倍，得到2 mmol/L的混合醛標準溶液，置冰箱中待用。

1.3.1.2 混合醛標準溶液的衍生化反應及產物的還原

取2 mmol/L混合醛標準溶液50 μL與2 mmol/L DNPH-乙腈溶液350 μL按物質的量比1∶7混合，加入0.2 mol/L磷酸溶液30 μL，加乙腈至1 000 μL，將混合液在600 r/min、60 ℃條件下反應3 h。反應結束后將反應液冷卻至室溫，加入0.5 mol/L 2-PB-乙腈溶液300 μL、85%的磷酸溶液10 μL，繼續反應1 h，用氮吹法將溶劑吹干，殘留物用65%的乙腈1 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取20 μL續濾液進樣分析。

1.3.2 供試油樣的收集與制備

1.3.2.1 地溝油的采集與精煉

參考董樹清等［22］的方法，將收集的廢油先用棉花過濾，濾液加熱除水，得粗制地溝油。在2.5 mL粗制地溝油中加入1 mL 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液，油樣迅速變混濁，出現白褐色絮狀物，再加入0.5 mL 10%氯化鈉溶液靜置過夜，油樣分層。分層后的油樣加入一定量活性炭，在115 ℃油浴中靜置30 min后過濾得到金黃色透明的精制地溝油，其外觀與食用油基本一致。

1.3.2.2 供試樣品的制備

取食用油、粗制地溝油、精制地溝油各200 μL，分別加入正己烷200 μL、2 mmol/L DNPH-乙腈溶液570 μL、0.2 mol/L磷酸溶液30 μL，混勻，在600 r/min、60 ℃條件下反應3 h。反應結束后向反應液中分別加入0.5 mol/L 2-PB的乙腈溶液300 μL、85%磷酸溶液10 μL，繼續反應1 h。還原后的溶液用少量乙腈萃取3 次，合并萃取液，將萃取液用氮氣吹干，殘留物用65%的乙腈500 μL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，各取20 μL續濾液進樣分析。

1.3.3 HPLC條件

色譜柱為T h e r m o B D S H Y P E R S I L C1 8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長355 nm，流速1 mL/min，進樣量20 μL，流動相：甲醇與水梯度洗脫（0～7 min，甲醇65%～72%；7～48 min，甲醇72%～95%）。

1.3.4 供試樣品分析

取供試樣品20 μL分別注入HPLC儀中，以保留時間定性，按試樣峰面積與標準樣品比較定量。

2 結果與分析

2.1 定量方法分析

DNPH與脂肪醛反應生成腙時，由于產物結構中含有C=N雙鍵而形成順反異構體，從而影響脂肪醛類化合物的準確定量。Uchiyama等［24-25］的研究表明，2-PB可選擇性還原C=N雙鍵為C—N單鍵，使順反異構體轉化為相同結構，反應機理見圖1。因此本實驗將DNPH-脂肪醛衍生物用2-PB進行還原，不但簡化了色譜圖，而且能夠更準確地測定脂肪醛的含量。混合醛標準品經DNPH衍生化后進樣的色譜圖見圖2A，由于C=N雙鍵的存在導致產物中出現異構體，且隨著碳鏈變長，異構體含量也逐漸增加。而衍生物經2-PB還原后色譜圖見圖2B，兩個異構體被還原為單一產物，其保留時間與還原前相比略有提前，但完全成為單峰，因而簡化了色譜圖，便于脂肪醛的準確定量。

圖1 DNPH與脂肪醛的反應及2-PB對DNPH-醛衍生物的還原過程Fig.1 Aliphatic aldehydes derivatization with 2，4-dinitrophenylhydrazine and reduction of DNPH-aldehydes derivates with2-PB

圖2 混合醛標準溶液經 DN PH 衍生化 （ A）及衍生化后經2-P B還原 （B ）的色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of: A） DNPH-aldehydes derivates of a standard aldehydes mixture ， and B） reductive products of DNPH-aldehydes derivates using2-picoline borane as reducing agent

2.2 方法學考察結果

實驗過程中發現C7～C10脂肪醛在食用油和地溝油中含量極低，無益于鑒別地溝油，因此選擇C2～C6脂肪醛作為考察指標，并進行了方法學驗證。

2.2.1 線性關系

取2 mmol/L C2～C6混合醛標準溶液分別配制成2.4、5.0、10、20、50、100 μmol/L，與DNPH按1∶7物質的量比混合，按1.3.1.2節下條件進行衍生化反應和還原反應，反應結束后用氮氣將溶劑吹干，殘留物用65%的乙腈1 mL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取20 μL續濾液進樣分析，實驗結果見表1，表明各脂肪醛濃度與衍生物峰面積的線性關系良好，該方法克服了直接使用2，4-二硝基苯腙作為對照時由于反應產率不同而造成的誤差。

表1 線性關系、進樣精密度及加樣回收率實驗結果Table 1 L in ear relati on ships， precisi on （RSDs） of i njecti on and spiked reco ve ries of ac etalde hy de ，p ro pa nal，b utanal ，p en tanal and hex anal

2.2.2 檢測限

取線性關系中2.4 μmol/L混合醛標準溶液衍生化反應后的溶液，按信噪比3∶1測定各脂肪醛的檢測限，結果見表1。其中乙醛的檢測限顯著高于其他醛，可能是由于乙醛沸點較低，配制溶液過程中易揮發，導致其濃度下降所致。

2.2.3 進樣精密度

取20 μmol/L標準混合醛衍生反應液還原后，按上述色譜條件連續進樣6 針，結果見表1，表明進樣精密度良好。

2.2.4 重復性

取200 μL食用油樣品，共平行5 份，按1.3.2.2節方法制備樣品，分別進樣分析。由于食用油中主要含乙醛［22-23］，本實驗以乙醛含量為指標，測得食用油中乙醛含量為53.0 μmol/L，相對標準偏差為3.0%。

2.2.5 加樣回收率

取200 μL食用油樣品，精密加入2 mmol/L混合醛標準溶液40 μL，按樣品衍生化方法處理，測定，計算加樣回收率，結果見表1，各脂肪醛的加樣回收率在81.1%～98.3%之間。

2.3 供試樣品測定結果

還原后的樣品溶液呈渾濁狀態，為便于測定，先將樣品離心分層，再用乙腈萃取3 次后，用氮吹法揮干乙腈，殘留物用65%乙腈500 μL溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液進樣，食用油、粗制地溝油和精制地溝油平行操作，色譜圖見圖3，結果見表2。

油脂中的脂肪醛主要來自多不飽和脂肪酸的脂質過氧化反應，因此食用油在制備、貯存過程中也會進行緩慢的脂質過氧化反應，產生少量的脂肪醛。而地溝油經過高溫加熱、堿洗、脫色等處理，可能產生更多的脂肪醛。本實驗采用DNPH衍生化、2-PB還原結合HPLC法對食用油、自制的粗制地溝油和精制地溝油中的脂肪醛含量進行了測定。結果顯示，食用油僅含有少量C2～C6脂肪醛，粗制地溝油中乙醛含量明顯增加，而C3～C6脂肪醛含量變化不顯著。精制地溝油經過堿化、活性炭吸附等步驟，使得乙醛含量有所降低，但所含的短鏈脂肪醛的種類反而增多，而且與食用油相比，精制地溝油中乙醛含量顯著高于食用油（表2）。此外，粗制地溝油和精制地溝油色譜圖中保留時間5.7 min的色譜峰（圖3B、C）顯著高于食用油，根據保留時間判斷可能為甲醛。選用37%甲醛溶液進行衍生化實驗，確認該色譜峰為甲醛衍生物，但因無準確濃度的甲醛對照品，本實驗未對其進行定量分析。與食用油相比，精制地溝油色譜圖中保留時間為8.2 min和10.6 min處的色譜峰明顯增加，可能為不飽和脂肪醛類或酮類衍生物（圖3A、C）。因此精制地溝油中顯著增加的甲醛、乙醛和其他不飽和醛的檢測與定量可作為鑒別地溝油的指標。

圖3 食用油（A）、粗制地溝油（B）和精制地溝油（C）的色譜圖Fig.3 HPLC chromatography of edible oil （A）， crude waste cooking oil （B）， and refined waste cooking oil （C） after derivatization with DNPH and reduction with2-PB

表2 食用 油、粗制 地溝 油、精制 地溝 油測 定結 果（n=3）Table 2 Results for determ in ati on of aliphaticaldehydesi nedible oil，cr ude w aste coo k in g oil and ref in e waste co ok in g o il（n =3 ）

3 結 論

本研究中采用DNPH作為醛的衍生化試劑，以2-PB為還原劑，可以有效改善因生成異構體而導致的定量不準確的問題，取食用油樣品直接進行衍生化、還原，乙腈萃取后直接進樣分析，使檢測流程更加簡捷、快速。本方法還可以避免因反應產率造成的結果偏低的問題。實驗結果表明，通過HPLC法測定脂肪醛類物質，來檢測食用油中是否摻入了地溝油的方法是可行的，并且準確度好、靈敏度很高，可以為地溝油的檢測提供參考。

［1］ 鄒君， 姜雪， 梁丹丹， 等.地溝油的危害及合理利用［J］.吉林醫藥學院學報， 2015， 36（4）: 296-299.DOI:10.13845/j.cnki.issn1673-2995.2015.04.026.

［2］ 李臣， 周洪星， 石駿， 等.地溝油的特點及其危害［J］.試驗研究，2010（6）: 69-70.DOI:10.3969/j.issn.1671-9646-C.2010.06.045.

［3］ 馬遇涵.科技為先， 法制為道， 化害為利， 變廢為寶: 對廢棄油脂處理方式的思考［J］.中國資源綜合利用， 2000（12）: 20-24.DOI:10.3969/j.issn.1674-0912.2001.02.003.

［4］ 陳媛， 陳智斌， 張立偉.食用油脂安全性及對人體健康的影響［J］.西部糧油科技， 2001， 26（2）: 42-45.DOI:10.3969/ j.issn.1007-6395.2001.02.016.

［5］ 焦云鵬.地溝油鑒別和檢測的研究進展［J］.現代食品科技， 2008，24（4）: 378-380.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2008.04.014.

［6］ 崔曉舉， 蔣世云， 張夏輝， 等.地溝油檢測技術研究進展［J］.化學分析計量， 2013， 22（2）: 100-104.DOI:10.3969/ j.issn.1008-6145.2013.02.029.

［7］ 張蕊， 祖麗亞， 樊鐵， 等.測定膽固醇含量鑒別地溝油的研究［J］.中國油脂， 2006， 31（5）: 65-67.DOI:10.3321/ j.issn:1003-7969.2006.05.019.

［8］ 胡小泓， 劉志金， 鄭雪玉， 等.應用電導率檢測潲水油方法的研究［J］.食品科學， 2007， 28（11）: 482-484.DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.11.114.

［9］ 朱銳， 王督， 楊小京， 等.電導率測定在鑒別食用植物油摻偽應用研究［J］.糧食與油脂， 2008（11）: 42-43.DOI:10.3969/ j.issn.1008-9578.2008.11.014.

［10］ 伊平河， 王桂華， 趙鈴， 等.GC-MS法食用油和餐飲業中廢棄油脂的研究［J］.分析試驗室， 2004， 23（4）: 8-11.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2004.0082.

［11］ 全常春， 伊平河， 趙鈴， 等.精煉餐飲業地溝油揮發性危害成分的GC/MS靜態頂空分析［J］.食品科學， 2004， 25（4）: 128-134.DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2004.04.030.

［12］ 毛新武， 賈煦， 胡國媛， 等.潲水油等廢棄食用油脂檢測指標的建立研究［J］.中國衛生檢驗雜志， 2007， 17（2）: 258-260.DOI:10.3969/ j.issn.1004-8685.2007.02.027.

［13］ 劉波， 楊建國， 張雪梅.地溝油鑒別檢測指標的研究進展［J］.職業與健康， 2011， 27（10）: 1167-1169.DOI:10.13329/j.cnki.zyyjk.2011.10.035.

［14］ 黃道平， 彭進， 謝燕湘， 等.潲水油鑒別檢測方法研究［J］.中國衛生檢驗雜志， 2006， 16（2）: 151-153.DOI:10.3969/ j.issn.1004-8685.2006.02.008.

［15］ 李琛.地溝油檢測技術研究現狀［J］.化工技術與開發， 2012（12）: 46-49.DOI:10.3969/j.issn.1671-9905.2012.12.015.

［16］ 曹文明， 薛斌， 楊波濤， 等.地溝油檢測技術的發展與研究［J］.糧食科技與經濟， 2011（1）: 41-44.DOI:10.3969/ j.issn.1007-1458.2011.01.014.

［17］ 李小鳳， 王超， 汪勇， 等.固相微萃取-氣相色譜-質譜法對比分析湘菜類地溝油與市售植物油中的揮發性成分［J］.現代食品科技， 2015，31（3）: 242-248.DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.3.040.

［18］ FRITZ K S， PETERSEN D R.An overview of the chemistry and biology of reactive aldehydes［J］.Free Radical Biology and Medicine 2013， 59: 85-91.DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2012.06.025.

［19］ KAWAI Y， TAKEDA S， TERAO J.Lipidomic analysis for lipid peroxidation-derived aldehydes using gas chromatography-mass spectrometry［J］.Chemical Research Toxicology， 2007， 20: 99-107.DOI:10.1021/tx060199e.

［20］ ZHANG J B， LI M J， LI W L， et al.A novel capillary electrophoretic method for determining aliphatic aldehydes in food samples using 2-thiobarbituric acid derivatization［J］.Electrophoresis， 2011， 32: 705-711.DOI:10.1002/elps.201000533.

［21］ 鄧鵬， 王守經， 王文亮.食用油氧化機理及檢測方法研究［J］.中國食物與營養， 2008（8）: 17-19.DOI:0.3969/j.issn.1006-9577.2008.08.005.

［22］ 董樹清， 王利濤， 張霞， 等.高效液相色譜法測定地溝油中脂肪醛類物質［J］.食品工業科技， 2013， 34（11）: 313-316.DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.11.016.

［23］ 董樹清， 楊孟銘， 王利濤， 等.高效液相色譜法測定油脂中的脂肪醛［J］.分析實驗室， 2013， 32（11）: 67-71.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2013.0301.

［24］ UCHIYAMA S， INABA Y， MATAUMOTO M， et al.Reductive amination of aldehyde 2，4-dinitorophenylhydrazones using 2-picoline borane and high-performance liquid chromatographic analysis［J］.Analytical Chemistry， 2009， 81: 485-489.DOI:10.1021/ac802163y.

［25］ UCHIYAMA S， INABA Y， KUNUGITA N.Derivatization of carbonyl compounds with 2，4-dinitrophenylhydrazine and their subsequent determination by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography B， 2011， 879: 1282-1289.DOI:10.1016/ j.jchromb.2010.09.028.

Determination of Aliphatic Aldehydes in Waste Cooking Oil by Pre-Column Derivatization-HPLC Method

SHEN Weiyang， WANG Jieqiong， WANG Wan， YU Qingfeng， XIAO Ying*
（School of Science， China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China）

By taking advantage of lipid peroxidation of unsaturated fatty acids and consequent generation of a variety of highly reactive small molecular aliphatic aldehydes during the refining of waste cooking oil， a simple and highly sensitive method was established based on the precolumn derivatization of aliphatic aldehydes utilizing 2，4-dinitrobenzene hydrazine （DNPH） followed by high performance liquid chromatography （HPLC）.Further， high sensitivity was obtained by adding 2-picoline borane （2-PB） as a reducing agent to convert cis- and trans-isomers into the same structure.Compared with edible oil， the contents of formaldehyde and acetaldehyde in refined waste oil increased significantly， providing an indicator to discriminate waste cooking oil.This method is specific， highly sensitive and accurate and greatly improves the procedure for detection and identification of waste cooking oil.

waste cooking oil； aliphatic aldehyde； 2，4-dinitrobenzene hydrazine； high performance liquid chromatography （HPLC）

10.7506/spkx1002-6630-201614028

TS229

A

1002-6630（2016）14-0160-05

沈衛陽， 王潔瓊， 王婉， 等.柱前衍生化-高效液相色譜法測定地溝油中的脂肪醛［J］.食品科學， 2016， 37（14）: 160-164.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614028. http://www.spkx.net.cn

SHEN Weiyang， WANG Jieqiong， WANG Wan， et al.Determination of aliphatic aldehydes in waste cooking oil by pre-column derivatization-HPLC method［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 160-164.（in Chinese with English abstract）

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614028. http://www.spkx.net.cn

2015-10-26

中國藥科大學中央高校基本科研業務費專項；江蘇省自然科學基金項目（BK20140654）

沈衛陽（1970—），男，副教授，博士，研究方向為藥物分析。E-mail：wyshen@hotmail.com

*通信作者：肖瑩（1977—），女，講師，博士，研究方向為藥物分析。E-mail：xyxyhello@sina.com