高效液相色譜-串聯質譜檢測保健酒中非法添加物艾地那非

張麗媛，顏琳琦，周明昊，吳鴛鴦（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310000）

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高效液相色譜-串聯質譜檢測保健酒中非法添加物艾地那非

張麗媛，顏琳琦，周明昊，吳鴛鴦
（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310000）

目的：采用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，建立保健酒中非法添加物艾地那非的檢測方法。方法：使用Agilent RRDH Eclipse-plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸-乙腈溶液為流動相A、0.1%乙酸-20 mmol/L乙酸銨溶液為流動相B進行梯度洗脫。通過HPLC-MS/MS系統中全掃描模式對艾地那非進行定性分析，多反應監測模式對艾地那非進行定量分析。結果：該方法線性r2大于0.99，精密度相對標準偏差小于3%，不同質量濃度樣品平均回收率為97.31%～100.66%，檢出限為0.6 ng/mL，定量限為1.6 ng/mL。結論：此方法測定準確、靈敏度高、分離度高，可用于保健酒中非法添加物艾地那非的篩選和檢測。

艾地那非；高效液相色譜-串聯質譜法；保健酒；檢測方法；非法添加

艾地那非是5型磷酸二酯酶（phosphodieseterase 5，PDE5）抑制劑枸櫞酸西地那非的新型衍生物［1］，枸櫞酸西地那非、伐地那非和他達拉非是美國食品藥品監督管理局于1998年批準，用于治療男性勃起功能障礙的藥物［2］。近年來，一些不法廠家將其加入到補腎壯陽類中成藥和保健食品中，利用其用量少、效果快的特點，謀取高額利潤。此類藥物，對具有心血管系統疾病和糖尿病的患者有嚴重不良反應，消費者長期服用此類保健品將對身體產生嚴重危害［3-7］。2015年7月31日，國家食藥監總局在官網通告，有多達51 家69 種保健酒、配制酒中非法添加了西地那非等化學物質，此消息令外界震驚，也暴露了保健酒行業的亂象［8］。

近年來，隨著國家查處力度的不斷增大，一些不法商家轉而向保健食品中添加PDE5型抑制劑的衍生物，以期利用更隱蔽的方法獲得高額利潤，危害人民健康［9］。對于PDE5型抑制劑及其衍生物的檢測多采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，而HPLC-串聯質譜（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法，無論在選擇性、靈敏度及分子質量的測定方面均優于HPLC法［10-16］。目前，國家食品藥品監督管理局已發布了補腎壯陽類中成藥中11 種PDE5型抑制劑及其衍生物的檢測方法（國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（批準件編號：2009030））。但在日常監督檢測中，發現某廠家生產的3 批保健酒中非法添加了新型的衍生物——艾地那非。故采用HPLC-MS/MS法，對保健酒中非法添加的化學藥物艾地那非進行方法學研究，以期建立快速有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

艾地那非（純度9 9.9%）、紅地那非（純度99.1%）、偽伐地那非（純度99.5%）、羥基豪莫西地那非（純度98.8%）、那莫西地那非（純度99.7%）、豪莫西地那非（純度98.7%）、伐地那非（純度99.5%）、氨基他達拉非（純度99.9%）、那紅地那非（純度99.9%）、硫代艾地那非（純度99.7%） 加拿大TLC Pharmachem公司；西地那非（純度99.3%）、他達拉非（純度99.3%） 中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜純） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

1290-6490QQQ HPLC-MS/MS聯用儀（配有電噴霧離子源及MassHunter數據處理系統） 美國Agilent公司；MS205DU電子天平 瑞士梅特勒公司；KQ-300DB超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Genpure UV/UF超純水儀 美國熱電公司。

1.3 方法

參考國家食品藥品監督管理局發布的（國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（批準件編號：2009030））對補腎壯陽類中成藥中11 種PDE5型抑制劑及其衍生物的檢測方法，優化并確定對新發現PDE5型抑制劑衍生物艾地那非檢測的條件。

1.3.1 HPLC條件

A g i l e n t R R D H E c l i p s e-p l u s C1 8色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量1 μL；流動相A：0.1%甲酸-乙腈溶液；流動相B：0.1%乙酸-20 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫程序：0～7 min，30% A，70% B；7～12.5 min，30%～85% A，70%～15% B；12.5～13 min，85% A，15% B；13～13.5 min，85%～30% A，15%～70% B；13.5～15 min，30% A，70% B。

1.3.2 MS條件

離子化方式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：全掃描一級質譜，選擇離子全掃描二級質譜方式定性檢測；一級質譜掃描范圍為m/z 100～1 000；二級質譜掃描范圍為m/z 50～550；多反應監測模式定量檢測；毛細管溫度350 ℃；鞘氣流速11 L/min；離子源電壓4 kV。

1.3.3 對照品溶液制備

精密稱取艾地那非對照品適量，加乙腈配制成每1 mL含1 μg、100 ng的溶液，分別作為一級質譜掃描及選擇離子全掃描二級質譜溶液。

1.3.4 樣品溶液制備

取待測保健酒樣品過0.22 μm有機濾膜，取續濾液置進樣瓶中，待測。用乙腈稀釋，并進行一、二級質譜掃描。待測保健酒樣品均采自浙江省食品藥品檢驗研究院日常抽檢。

2 結果與分析

2.1 艾地那非一、二級質譜掃描圖譜

由圖1可知，艾地那非［M+H+］m/z如下：一級質譜母離子為489，二級質譜分子離子碎片為377、311、283、113、99、71。在二級質譜掃描模式下對艾地那非碰撞能進行優化，選擇碰撞能量為43 cid。

圖1 艾地那非一級（A）、二級（B）質譜掃描圖Fig.1 MS （A） and MS2 （B） spectra of aildenafil

艾地那非與西地那非衍生物-豪莫西地那非具有相同的分子式和相似的結構式［1，17］，見圖2。在HPLC-MS/ MS系統下，通過一級質譜全掃描發現艾地那非與豪莫西地那非具有相同的母離子，兩者二級質譜掃描圖相似，如圖3所示，且在色譜圖中出峰時間相近。因此，采用HPLC-MS/MS方法檢測保健酒中非法添加艾地那非時，應注意各色譜峰的分離度，避免誤判。

圖2 艾地那非（A）、豪莫西地那非（B）結構式Fig.2 Structural formulas of aildenafil （A） and homosildenafi （B）

圖3 豪莫西地那非二級質譜掃描圖Fig.3 MS2 spectrum of homosildenafil

2.2 多反應監測模式下艾地那非的定量分析結果

選擇艾地那非對照品碎片離子中離子豐度較高的2 個碎片離子283、99，分別作為定性和定量離子，見圖4。采用MassHunter軟件進行數據處理。

圖4 艾地那非多重反應監測質譜圖Fig.4 Mass spectrum of aildenafil in MRM mode

2.2.1 線性關系

精密稱取艾地那非對照品適量，加乙腈配制成質量濃度分別為1.61、3.22、8.05、16.10、32.20 ng/mL的梯度對照品，測定峰面積［18］。以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，計算得回歸方程Y=709.69X+238.49，r2=0.999 5。可見，艾地那非在質量濃度為1.61～32.20 ng/mL范圍內線性良好。

2.2.2 精密度實驗結果

分別精密吸取質量濃度為1.61、8.05、32.20 ng/mL的艾地那非對照品溶液作為低、中、高質量濃度溶液，各重復進樣3 次，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于3.0%，表明儀器精密度良好［19-20］。結果見表1。

表1 艾地那非在不同質量濃度條件下的精密度Table 1 Precisi on （RSD） for 3 replicated eterm in ati on s of aildena fila td ifferentc on centrati on levels

2.2.3 檢出限與定量限測定結果

采用空白樣品加標準溶液的方法測定［18-22］。取某廠生產的在上述檢測條件下未檢出艾地那非的保健酒溶液2 份，分別加入適量對照品溶液。以3 倍信噪比為檢出限最低響應值，計算檢出限為0.6 ng/mL；以10 倍信噪比為定量限最低響應值，計算定量限為1.6 ng/mL。

2.2.4 回收率測定結果

表2 艾地那非在不同質量濃度條件下的回收率Table 2 Recoveries of aildenafilspiked at different c on centrati on levels

采用樣品加標回收法測定［20，22］。取上述檢測條件下陰性保健酒溶液9 份，分別加入適量對照品溶液，使加標質量濃度分別達到定量限質量濃度、2 倍定量限質量濃度、10 倍定量限質量濃度3 個添加水平，按1.3.3節供試品溶液制備，每個添加水平平行制備3 份樣，計算回收率，如表2所示，不同質量濃度水平平均回收率為97.31%～100.66%，RSD小于3%。

2.2.5 專屬性

在3 批檢出艾地那非的保健酒中，按1.3節方法測定，樣品中出現與對照品保留時間和質譜圖一致的色譜峰［18］。同條件下艾地那非與11 種對照品能有效分離，如圖5所示。

圖5 12 種對照品色譜圖Fig.5 Chromatogram of mixture of12 reference substances

2.2.6 樣品定量測定結果

按照上述方法對10 批保健酒樣品進行確證定量，檢測出3 批含艾地那非的陽性樣品，含量分別為1.00、0.83、0.91 mg/kg，如圖6所示。

圖6 陽性樣品色譜圖（A）、多重反應監測質譜圖（B）Fig.6 Chromatogram of positive samples （A） and MRM spectrum （B）

3 結 論

西地那非等化學藥物為可溶于乙醇和水的白色或類白色結晶粉末［23］，故易溶解于保健酒中。經過文獻［24］檢索發現，艾地那非為西地那非的衍生物。故參照國家食品藥品監督管理局藥品檢驗補充檢驗方法和檢驗項目批準件（批準件編號：2009030）檢測方法，采用直接進樣法可有效檢測出保健酒中非法添加的化學藥物。本實驗中涉及到的保健酒中非法添加的化學藥品艾地那非是日常監督樣品中的“異常圖譜”，屬于意外發現。參照上述方法對保健酒中添加的化學藥物艾地那非進行方法學驗證表明：該方法可方便、快速、準確的對保健酒中非法添加的化學藥品艾地那非進行定性、定量檢測。且可以在同一系統條件下將12 種化學藥品成分有效分離，提高了工作效率。

西地那非等PDE5抑制劑作為臨床治療陰莖勃起功能障礙的一線藥物，且主要為進口藥物［25-26］，目前有針對的檢測方法。但艾地那非是新型PDE5抑制劑，未廣泛應用且檢測方法未成熟，故在監管上存在一定程度的漏洞，讓不法商家有機可乘。通過建立保健酒中非法添加物艾地那非的檢測方法，來進一步擴大檢測范圍，更有效的規范市場，使行業更加健康有序的發展。

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Determination of Aildenafil Illegally Added in Health Wine by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Liyuan， YAN Linqi， ZHOU Minghao， WU Yuanyang
（Zhejiang Institute for Food and Drug Control， Hangzhou 310000， China）

Objective: To develop a detection method for aildenafil adulterated in health wine using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）.Methods: The chromatography was performed using an Agilent RRDH Eclipse plus C18column （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm）， with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% formic acid （phase A） and 0.1% acetic acid-20 mmol/L ammonium acetate （phase B） by gradient elution.Qualitative analysis of aildenafil was conducted under full-scan model， and quantitative analysis in the multiple reaction monitoring （MRM） model.Results: The method was linear with a correlation coefficient （r2） ＞ 0.99， and its precision， expressed as RSD， was ＜ 3%.The recoveries of aildenafil at different spiked concentrations ranged from 97.31% to 100.66%.The limit of detection （LOD） was 0.6 ng/mL and the limit of quantitation （LOQ） was 1.6 ng/mL.Conclusion: This method is fast and accurate with a high sensitivity and a high degree of separation.It can be used for the screening and detection of aildenafil illegally added in health wine.

aildenafil； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）； health wine；detection method； illegally added

10.7506/spkx1002-6630-201614036

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0198-05

張麗媛， 顏琳琦， 周明昊， 等.高效液相色譜-串聯質譜檢測保健酒中非法添加物艾地那非［J］.食品科學， 2016， 37（14）: 198-202.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614036. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Liyuan， YAN Linqi， ZHOU Minghao， et al.Determination of aildenafil illegally added in health wine by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 198-202.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614036. http://www.spkx.net.cn

2015-11-30

張麗媛（1985—），女，助理工程師，碩士，研究方向為保健食品化妝品檢測。E-mail：xiaojie1119ok@163.com