ARTP誘變選育高產油脂酵母菌

劉冬，邱婧云，王霞，鐘海清，萬琳琳，楊清香，2，*（.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉453007；2.河南省高校資源微生物與功能分子重點實驗室（河南師范大學），河南新鄉453007）

ARTP誘變選育高產油脂酵母菌

劉冬1，邱婧云1，王霞1，鐘海清1，萬琳琳1，楊清香1，2，*
（1.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉453007；2.河南省高校資源微生物與功能分子重點實驗室（河南師范大學），河南新鄉453007）

從實驗室保藏的15株酵母中篩選獲得一株油脂產量相對較高的酵母菌KC 8，經96 h搖瓶發酵培養后，油脂產量為1.22 g/L。利用分子生物學鑒定，該菌株的26S rDNA序列與膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）具有100%相似性；以KC 8為出發菌株，經ARTP誘變，最終從300株誘變存活菌株中篩選得到高產油脂突變菌株Y3，經96 h搖瓶發酵培養后，油脂產量為2.38g/L；對菌株Y3的培養條件進行優化，菌株在葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，碳氮比為90∶1，培養基初始pH為6.5時，在28℃恒溫條件下搖瓶發酵培養96 h后，油脂產量最高達到了3.96 g/L；GC-MS對油脂組分進行分析結果表明，該脂肪酸主要由棕櫚油酸、油酸、亞油酸、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸組成，與植物油成分相似。

酵母；油脂；ARTP誘變；脂肪酸組分

當今世界，隨著經濟發展，化石能源的大量消耗和環境污染的日益嚴重，人們迫切地尋求一種新的綠色能源來緩解這些危機，因此，生物柴油便應運而生。生物柴油具有低含硫量、易燃燒、可再生、儲運安全等優點，可以作為化石燃料的替代品［1］。目前，生物柴油的生產主要以動植物油脂原料［2］，生產成本高，原料供應不足等問題始終制約著生物柴油的規模化生產。因此，必須發展新型、低成本的油脂生產技術，來解決生物柴油生產中的難題。

在自然界中，一些微生物能夠通過自身代謝將碳氫化合物、碳水化合物以及普通油脂等轉化為油脂，貯存在菌體細胞內，我們通常將油脂的含量超過菌體自身生物總量20%的微生物稱為產油微生物［3］。產油微生物種類繁多，在細菌、真菌以及藻類中都能發現，在某些真菌中，其菌體內的油脂含量甚至超過了生物量的70%。微生物油脂的脂肪酸組主要為C16、C18系脂肪酸（如硬脂酸、油酸和亞油酸），與植物油脂成分相似［4］。微生物自身生產油脂與傳統的油脂生產相比，具有生產周期短、成本低、不受季節、場地的限制，以及容易實現大規模生產等優點。因此，對產油脂微生物的研究，并選育出高油脂產率微生物有著重大意義。

近年來，國內外的研究人員通過從自然界中篩選、優化培養基以及采用誘變等方式來獲得高油脂產率的產油菌株［5-8］，通過誘變育種的方式可以提高微生物的油脂產量。本研究從實驗室保藏的酵母菌中篩選得到一株油脂產率較高的酵母菌株作為誘變出發菌株，通過采用新型的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術對其進行誘變處理，以獲得高油脂產率的突變株，并對獲得的高產油脂突變株的培養條件進行優化，進一步提高其油脂產量。

1　材料與方法

1.1菌株與培養基

酵母菌：由河南師范大學資源微生物與功能分子河南省高校重點實驗室保存，共15株。

斜面活化培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，瓊脂20，pH自然。

種子液培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，pH自然。

發酵培養基（g/L）：葡萄糖20，酵母膏0.5，（NH4）2SO42，KH2PO41，MgSO4·7 H2O 0.5，pH 7.0。

以上培養基均在0.1 MPa滅菌30 min。

1.2產油酵母菌菌株的篩選

取一環保藏菌種接種至斜面培養基，28℃恒溫培養48 h活化菌種。用5 mL無菌水將斜面菌種洗下，轉接入裝液量為20 mL/100 mL的種子培養基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養36 h，獲得種子液。按10%接種量接入裝液量50 mL/250 mL的發酵培養基中，28℃，180 r/min恒溫震蕩培養96 h。取少量菌液，采用蘇丹黑染色的方法對產油脂酵母進行初篩［9］。然后將菌液8 000 r/min離心10 min，收集菌體測定酵母生物量和油脂產量，選用油脂產量最高的菌株做為出發菌株進行誘變育種，并對該菌株進行分子生物學鑒定［10］。

1.3生物量的測定

菌體生物量的測定采用菌體干質量法［11］。

菌體生物量/（g/L）=菌體干質量（g）/發酵液體積（L）

1.4油脂的提取和產量測定［12］

取45 mL發酵液于50 mL離心管中，6 000 r/min離心10 min，蒸餾水洗滌3次，收集菌體，加入4 mol/L的鹽酸15 mL，混勻后室溫下浸泡1 h，沸水浴5 min后迅速冷卻，6 000 r/min離心10 min，去除HCl，向離心管中加入15 mL氯仿/甲醇（體積比1∶1）溶液，室溫下震蕩混勻，6 000 r/min離心10 min，取氯仿層，加入相同體積的0.1%的NaCl（質量分數）溶液，振蕩混勻，6 000 r/min離心10 min，用已知質量的蒸餾瓶收集氯仿層后，通過旋轉蒸發儀將氯仿蒸干，再次稱量瓶中，得出油脂產量以及油脂產率。

將浸提液適當稀釋后，利用分光光度計在487 nm處測定其吸光度值，然后按下式計算類胡蘿卜素的產量：

油脂產率/%=油脂產量/干菌體質量×100

1.5酵母菌生長曲線的測定［13］

菌株在斜面培養基上活化后，取一環接種至種子培養基中，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養，培養過程中從4 h后開始，每隔2 h取樣測菌液在600 nm處的OD值，培養時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制菌株的生長曲線。

1.6誘變處理及正向突變菌株的篩選

菌懸液的制備：從斜面活化培養基上挑取適量菌體接種到種子培養基中，28℃，180 r/min恒溫振蕩培養至對數期，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水洗滌3遍，重懸浮，制成菌體細胞濃度為108CFU/mL的菌懸液。

常壓室溫等離子體（ARTP）誘變：采用清華大學化工系自主研發的ARTP II常壓室溫等離子體誘變儀對菌懸液進行誘變處理。固定儀器的電源功率、氣流量、等離子體發射源與菌懸液之間的距離等條件，將處理時間作為誘變的可變參數［14］。在本研究中ARTP的設定條件為：處理距離2 mm，處理功率120 W，氣流量10 SLM，處理時間分別為0、30、60、90、120、150、180 s，處理后菌懸液進行適當稀釋涂布到固體培養基上，28℃恒溫培養2 d～3 d，計算致死率并繪制致死曲線。

正向突變菌株的篩選：首先通過蘇丹黑染色的方法對突變株進行初篩，選取油脂含量較多的突變株，按照前述方法通過對突變株進行生物量以及油脂產量測定來進行高產油脂突變株的篩選。

1.7遺傳穩定性試驗

將篩選獲得的高產油脂紅酵母菌株接種至斜面固體培養基上傳代培養，共傳10代，取第0、2、4、6、8、10次傳代的菌進行搖瓶發酵培養，測其生物量和油脂產量，檢測篩選得到的高產油脂菌株的遺傳穩定性。

1.8培養條件的優化

采用單因素試驗法研究不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖），不同氮源（硫酸銨、氯化銨、硝酸銨），不同碳氮比（30∶1、50∶1、70∶1、90∶1、110∶1、130∶1）和不同發酵培養基初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）對菌株產油脂發酵的影響，對其培養條件進行優化。

1.9油脂成分的分析

1.9.1油脂的甲酯化［15］

稱取提取的酵母油脂100 mg，向其加入2 mL的 0.6 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液和2 mL的正己烷，振蕩2 min，在室溫下放置15 min后，加入5 mL蒸餾水，靜置分層，取正己烷層，用0.45 μm濾膜過濾后制得脂肪酸甲酯樣品，采用氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）測定其脂肪酸組成。

1.9.2GC-MS試驗條件［16］

GC條件：進樣器240℃；程序升溫：初始溫度50℃，保留5 min；以10℃/min的速度升至170℃，保留10 min；以3℃/min的速度升至205℃，保留20 min；再以10℃/min的速度升至250℃，保留5 min；離子源溫度200℃，傳輸線溫度250℃。

MS條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，質荷比掃描范圍35～450。

2　結果及分析

2.1產油脂酵母菌菌株的篩選及鑒定

按照材料方法所述從15株酵母菌中獲得一株生物量，油脂產量均較高的菌株KC 8，在發酵培養基中經96 h搖瓶發酵培養后，其生物量為（14.02±0.15）g/L，油脂產量為（1.22±0.07）g/L。

對其26S rDNA片段進行測序（GenBank登錄號：KP760069）并在NCBI進行Blast同源性檢索，結果表明與Rhodotorula mucilaginosa有100%的相似性，構建系統發育樹（圖1）表明，KC 8與Rhodotorula mucilaginosa聚為一簇，因此該紅酵母菌株KC 8的鑒定結果為膠紅酵母（R.mucilaginosa）。

圖1　基于26S rDNA基因序列的系統進化樹Fig.1　Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences

2.2菌株生長曲線的測定

誘變處理一般選取對數期的菌株，此時菌體生長狀況比較同步，代謝活性高而穩定，生活力強，易變異且重復性好。菌株KC 8在種子液培養基中的生長曲線見圖2。

由圖2可知，菌株KC 8在種子液培養基中28℃，180 r/min恒溫震蕩培養，培養至12 h～24 h期間處于對數期，本試驗選取培養20 h后的菌液進行誘變處理。

圖2 菌株KC 8在種子液培養基中的生長曲線Fig.2　The growth curve of initial strain KC 8 in seed culture

2.3ARTP誘變致死率曲線的測定

ARTP誘變的致死結果如圖3所示。

圖3誘變致死曲線Fig.3　The curve of mutation fatality rate

對酵母菌誘變處理時間在30 s到150 s范圍內，隨著等離子體對菌體細胞的照射時間的延長，致死率逐漸升高。當照射時間為120 s時，致死率為85%左右，而當照射時間為150 s時，菌體細胞幾乎全部被殺死，致死率接近100%。當致死率在85%左右時，有較高的正突變率［17］，因此選擇照射時間為120 s。

2.4高產油脂酵母菌株的篩選

按照方法1.6對紅酵母菌株KC 8進行誘變處理，從誘變后獲得的突變株中挑選出300株生長良好的菌株，測其生物量及油脂產量。通過對突變株的篩選，共獲得4株油脂產量明顯提高的菌株，分別命名為Y1、Y2、Y3、Y4，各自的生物量、油脂產量及產率如表1所示。

表1　各突變株的生物量、油脂產量及油脂產率Table 1　The biomass，oil yield and oil productivity of each mutant strain

ARTP誘變是一種新型誘變技術，和傳統誘變方法相比，ARTP誘變對遺傳物質的損傷機制多樣，獲得突變型多樣性的可能性較大，研究結果表明，ARTP技術可以快速有效地突變細菌、放線菌、霉菌、酵母等微生物［18-20］。由表1可以看出，篩選獲得的4株突變株的生物量以及油脂產量與出發菌株KC 8相比，均有不同程度的提高。其中，突變株Y 3的有著較高的生物量和油脂產量，分別是出發菌株KC 8的1.07倍和1.95倍。從表1可以看出，出發菌株經過ARTP誘變后，其生物量變化不是太大，而油脂產量卻有大幅升高。這與金麗華等［14］報道的利用ARTP誘變技術選育高產油脂的釀酒酵母研究中的結果相一致，因此，證明了新型的ARTP誘變技術對提高該紅酵母油脂產量的作用比較明顯。

2.5菌株Y3遺傳穩定性試驗

將菌株Y3傳代10次，取第0、2、4、6、8、10次傳代的菌進行搖瓶發酵培養，并分別測定每次傳代菌株的生物量和油脂產量，測定結果如表2所示，菌株的油脂產量比較穩定，說明該菌株的產脂穩定性較好。

表2 突變株Y3的遺傳穩定性Table 2　The hereditary stability of mutant strain Y3

2.6菌株Y3發酵條件的優化

2.6.1碳源對菌株Y3油脂發酵的影響

分別選用了葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為發酵培養基的單一碳源，其他條件不變，待其發酵96 h以后，測得不同碳源發酵條件下的菌株生物量和油脂產量，結果如圖4所示。

圖4 碳源對菌株Y3的油脂發酵的影響Fig.4　Effect of carbon source on fermentation efficiency of the strain Y3

葡萄糖和蔗糖作為發酵培養基的單一碳源時，菌體的生物量和油脂產量均較高，其中以蔗糖為碳源時，菌體的生物量最高，為（15.09±0.10）g/L，以葡糖糖為碳源時，菌體的油脂產量最高，為（2.37±0.02）g/L，當以麥芽糖為碳源時，菌體的生物量和油脂產量均為最低，分別為（9.32±0.12）g/L和（1.07±0.08）g/L。因此，菌株Y3發酵培養基的最適碳源為葡萄糖。

2.6.2氮源對菌株Y3油脂發酵的影響

以葡萄糖作為發酵培養基的碳源，分別選用硫酸銨、氯化銨、硝酸銨作為氮源，其他條件不變，發酵96 h以后，測得不同碳源發酵條件下的菌株生物量和油脂產量，結果如圖5所示。

圖5 氮源對菌株Y3的油脂發酵的影響Fig.5　Effect of nitrogen source on fermentation efficiency of the strain Y3

菌株Y3以硫酸銨為氮源時，菌體的生物量和油脂產量均為最高，分別為（15.02±0.11）g/L，（2.34±0.03）g/L，說明硫酸銨為該菌株發酵培養基的最適氮源；當發酵培養基分別以氯化銨和硝酸銨作當氮源時，菌體的生物量和油脂產量差別不大，但均不是最高，說明菌株Y3對氯化銨和硝酸銨的利用效率不如硫酸銨。

2.6.3碳氮比對菌株Y 3油脂發酵的影響

固定發酵培養基中氮源即 （NH4）2SO4的用量，以葡萄糖（碳源）為變量，分別測定菌株Y 3在碳氮比為30∶1、50∶1、70∶1、90∶1、110∶1、130∶1的發酵培養基中發酵96 h后，菌體的生物量以及油脂產量，結果如圖6所示。

圖6 碳氮比對菌株Y3油脂發酵的影響Fig.6　Effect of carbon-to-nitrogen ratio on fermentation efficiency of the strain Y3

當碳氮比在30∶1到70∶1范圍內時，菌體的生物量隨著碳氮比的增大而逐漸升高，并在碳氮比為70∶1時達到最大值，為（15.73±0.11）g/L。而當碳氮比為90∶1，生物量開始下降，說明當培養基中的氮源過少時，不利于菌體的生長，但是此時，菌體的油脂產量卻達到了最大值，為（3.95±0.07）g/L，說明當培養基中氮源缺乏而碳源充足時，更有利于菌體油脂的積累。

2.6.4培養基初始pH對菌株Y3油脂發酵的影響

發酵培養基以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，碳氮比為90∶1，用鹽酸和氫氧化鈉分別調至pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，并分別測定菌株Y3在不同pH的發酵培養集中發酵96 h后的菌體生物量和油脂產量，結果如圖7所示。

圖7 培養基初始pH對菌株Y3油脂發酵的影響Fig.7　Effect of initial pH on ermentation efficiency of strain Y3

培養基的初始pH的過低或者過高都不利于菌株的生長和油脂的積累，當發酵培養基初始pH為6.5時，菌株的油脂產量達到了最大值，為（3.96±0.03）g/L，因此，發酵培養基的最適初始pH為6.5。

從對菌株Y3的發酵培養條件優化結果可以看出，菌株Y3油脂發酵的最適碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，碳氮比為90∶1，發酵培養基的初始pH為6.5，在該發酵條件下，菌株Y3經搖瓶發酵培養96 h后，菌株的生物量為（14.98±0.11）g/L，油脂產量為（3.96± 0.05）g/L，油脂含量占菌體干重的26.4%。

2.7油脂的組分分析

采用GC-MS對制得的脂肪酸甲酯化樣品進行上樣分析，菌株Y3所產的油脂脂肪酸甲酯的總離子流圖見圖8。

圖8　菌株Y3菌體油脂脂肪酸甲酯的總離子流圖Fig.8　Total ion chromatogram for fatty acid methyl esters of Y3

從圖8可以看出，各種脂肪酸甲酯都得到了分離，共分離出6種（具體組分見表3）。

油脂組分測定結果如表3所示。

表3　菌株Y3菌油脂脂肪酸組成及相對含量Table 3　Fatty acid composition and relative content of strain Y3

菌株的脂肪酸主要由C16和C18的脂肪酸組成，占脂肪酸總量的91.87%。該脂肪酸中包含了飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中油酸的含量最高，占脂肪酸總量的70.21%，其次是棕櫚油，占脂肪酸總量的14.57%，二十碳烯酸和二十四烷酸的含量較少，分別占脂肪酸總量1.06%、1.61%。從測定結果可以看出，該脂肪酸組成與植物油成分相似，因此可以替代植物油來生產生物柴油，很好的解決了生物柴油生產中原料不足的問題。

3　結論

本試驗通過對實驗室保藏的紅酵母進行篩選，得到了一株油脂產量較高的紅酵母菌株KC 8，經鑒定為膠紅酵母（R.Mucilaginosa），其類油脂產量為（1.22± 0.07）g/L；對菌株KC 8進行ARTP誘變，篩選獲得一株高產油脂的突變菌株Y3，油脂產量為（2.38±0.02）mg/L；對菌株Y3的培養條件優化結果表明，該菌株油脂發酵的最適碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，碳氮比為90∶1，發酵培養基的初始pH為6.5，在該發酵條件下，菌株Y3經搖瓶發酵培養96 h后，菌株的生物量為（14.98± 0.11）g/L，油脂產量為（3.96±0.05）g/L，油脂含量占菌體干重的26.4%；GC-MS對油脂組分進行分析結果表明，該脂肪酸主要由棕櫚油酸、油酸、亞油、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸組成，與植物油成分相似，菌株Y3是一株遺傳性狀穩定，產油脂能力強的酵母菌株，可以用來替代植物油生產生物柴油，具有良好開發前景。

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Mutation Breeding of Yeast with High Lipid Production by Atmospheric and Room Temperature Plasmas

LIU Dong1，QIU Jing-yun1，WANG Xia1，ZHONG Hai-qing1，WAN Lin-lin1，YANG Qing-xiang1，2，*
（1.College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，Henan，China；2.Key Laboratory for Microorganisms and Functional Molecules（Henan Normal University），Xinxiang 453007，Henan，China）

A high lipids producing strain，KC 8，was selected from 15 yeast strains which were stored in our lab.KC8 could produce 1.22 g/L lipids after 96 h flask fermentation.Analysis on the 26S rDNA sequence indicated that KC 8 had 100%identity with Rhodotorula mucilaginosa.Using KC 8 as a starting strain，atmosphericand room temperature plasma（ARTP）was used to induce mutation for screening strains of higher lipids production.Finally，Y 3 was obtained from 300 strains of screening.The yield of lipid was 2.38 g/L after 96 hours flask fermentation by Y 3.After optimized the fermentation conditions，the lipid productivity reached 3.96 g/L under the following conditions：glucose as carbon source，（NH4）2SO4as nitrogen source，ratio of carbon to nitrogen at 90∶1，initial pH 6.5，incubated at 28℃for 96 h shaking fermentation.Gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS）analysis indicated that the fatty acids were mainly composed of palmic acid，oleic acid，linoleic acid，stearic acid，eicosenoic acid and tetracosanoic acid.The compositions of fatty acids were similar to those of vegetable oil．

yeast；lipid；atmospheric and room temperature plasma mutation；fatty acid composition

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.042

國家自然科學基金（No.NSFC21077032；NSFC21277041）；河南省高校科技創新團隊（No.13IRTSTHN009）作者簡介：劉冬（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：環境微生物。
*

楊清香（1966—），女（漢），教授，博士，研究方向：環境微生物。

2015-05-06