Fkbp51基因敲除小鼠肝臟與大腦海馬區RNA表達譜系的分析比較

徐玉雪，邱　彬，魏　強，雍偉東

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京　100021)

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Fkbp51基因敲除小鼠肝臟與大腦海馬區RNA表達譜系的分析比較

徐玉雪，邱彬，魏強，雍偉東

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京100021)

目的通過分析野生型小鼠(WT)與Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝臟、海馬RNA表達譜系之間的差異，研究Fkbp51基因在代謝通路和神經通路中的作用。方法利用第二代測序技術對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬mRNA進行表達譜測序，將測序結果用BRB-ArrayTools進行分析，篩選出小鼠肝臟與海馬的差異基因，然后分別利用在線工具DAVID對差異基因進行GO本體分析，STRING數據庫對其進行蛋白質的相互作用網絡分析，并利用Genecard對基因進行注釋。 結果 (1)Fkbp51的缺失，在肝臟中造成類固醇生物合成及代謝、脂類物質代謝以及氧化還原反應等相關基因表達水平的變化；(2)在海馬中造成機械刺激探測、學習或記憶、突觸傳遞的調節、PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)等相關基因表達水平的變化；(3)在肝臟與海馬中，Fkbp51的缺失同時造成了11個基因的共差異表達，這11個基因的蛋白網絡互作圖顯示：HMGCS2與INSIG1及相關蛋白形成網絡，而USP2與PER、CRY、DBP等相關蛋白形成另一個網絡。這兩個網絡既參與代謝也參與神經調節。結論Fkbp51在代謝與神經中的作用既是相互獨立又是相互聯系的。

Fkbp51基因敲除小鼠；肝臟；神經系統；RNA-seq

Fkbp51是一種具有肽酰脯氨酰順-反異構酶活性的免疫親和蛋白，含有肽重復序列結構域，可介導蛋白與蛋白之間的相互作用。其作為一種共伴侶蛋白，能夠直接與伴侶蛋白(熱休克蛋白HSP90/70等)結合并參與激素-受體復合物的形成及調控[1]。已有研究表明，Fkbp51在代謝與神經方面發揮著重要作用。

研究發現，Fkbp51可通過調節糖代謝和脂代謝在動物體代謝過程中發揮作用。在肝臟中，糖皮質激素(GC)的重要作用是促進糖異生，但GC的過度刺激往往會引發糖尿病和某些代謝綜合征，如向心性肥胖、脂肪病變和胰島素抵抗等[2-3]。GC激活糖皮質激素受體(GR)后可直接促進Fkbp51的表達，進而負反饋作用于GR，使其對GC的敏感性降低[4-6]，促進機體穩態的平衡。此外，近些年Fkbp51在脂肪細胞分化中的作用也引起了研究者們的關注，Toneatto J等[7]人發現Fkbp51可抑制3T3-L1前脂肪細胞的分化，而Stechschulte等[8]人的研究則發現脂肪的生成需要Fkbp51的參與，這些矛盾的體外實驗結果，可能是由于培養和誘導體系不同所導致的。我們前期利用Fkbp51基因敲除小鼠(Fkbp51KO)，通過高脂喂養模型，發現敲除Fkbp51基因可對抗高脂誘導的肥胖[9]，并且其體內脂肪含量明顯減少。進一步的研究發現，Fkbp51KO肝臟、肌肉和脂肪組織中GR的活性明顯大于野生型小鼠(WT)，提示Fkbp51可能通過調節GR活性及其下游基因在代謝中發揮作用[10]。

此外，Fkbp51在神經方面也發揮著重要作用。海馬是應激反應的整合部位，在海馬中存在糖皮質激素受體(GR)和鹽皮質激素受體(MR)，下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA)的負反饋調節就是通過GR和MR調節實現的。HPA軸通過釋放皮質類固醇激素來應對外界的各種壓力，這類激素的釋放可激活神經元中GR活性和一些與應激反應相關的基因[11]，但這些調控機制的紊亂則會導致與壓力相關腦疾病的產生。Binder和他的同事發現Fkbp51基因的單核苷酸多態性(SNPs)與抑郁癥及其治療密切相關，這一發現為抗抑郁藥物的研究提供了新的方向[12]。研究還發現，這些存在于Fkbp51基因組中的SNPs能夠使Fkbp51蛋白表達量增加，進而導致GR活性下降，引起HPA軸調節的紊亂。持續的GR抵抗使個體極易發生與壓力相關的精神疾病。近年的研究還發現Fkbp51基因的SNPs變異與多種精神疾病的發病具有高度相關性，包括重度抑郁、雙相情感障礙以及創傷后應激障礙(PTSD)等[13-14]。

本實驗通過分析Fkbp51基因敲除小鼠肝臟、海馬RNA表達譜系與野生型小鼠之間的差異，研究Fkbp51基因在代謝通路與神經通路以及共同通路中的差異基因,進而進一步研究Fkbp51在生物體中的作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物

2月齡清潔級Fkbp51KO與同窩野生型雄鼠，由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所提供【SYXK(京)2014-0029】【SCXK(京)2014-0004】，體重20g～24g。動物實驗方案經過中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批準。在使用實驗動物的過程中充分考慮到動物的福利原則，尊重動物生命,善待動物，減少動物的應激、痛苦和傷害，采取脫頸的方法處置動物。

1.2方法

1.2.1RNA提取及測序

脫頸處死同窩Fkbp51KO與WT雄鼠各3只，取肝臟和海馬，利用Trizol法提取組織的RNA，樣品交由華大基因測序。

1.2.2差異表達基因的篩選

利用BRB-ArrayTools軟件對數據進行統計學分析。該軟件基本功能包括數據可視化、標準化處理、差異基因篩選、聚類分析等。BRB-ArrayTools以Excel加載宏的形式呈現,計算由Excel外部的分析工具完成,用來比較兩個組間的基因表達差異,集中關注一組顯著上調或下調的基因,以此來闡述不同處理對樣本產生的影響或揭示其中的生物學意義。

1.2.3差異基因的GO本體分析以及KEGG通路分析

通過在線工具DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異基因進行分析。基因本體數據庫GO(Gene Ontology)具有3個結構化的網絡，從生物學過程、細胞成分和分子功能三個方面分別對肝臟與海馬的差異基因進行注釋。

1.2.4差異表達基因的相互作用網絡分析

STRING(http://string-db.org/)數據庫是一個有關已知或預測蛋白質間相互作用的數據庫,這些相互作用包括物理上的直接作用和功能上的間接關系。它們主要來自高通量實驗、共表達分析、基因組內容、已有的知識這四個資源數據子庫。本文章主要利用此數據庫進行肝臟與海馬共差異基因的相互作用網絡分析，來進一步研究蛋白之間的直接與間接相互作用。

1.2.5Genecard注釋及分析

通過在線工具Genecard(http://www.genecards.org/)對基因進行注釋。Genecard是一個全面的，綜合的收集了所有已知的或者預測的基因。它整合了跟基因相關的基因組、轉錄組、蛋白質組、臨床等相關信息，收集整理了超過100個網站的數據。

2　結果

2.1Fkbp51KO與WT小鼠肝臟差異表達基因的分析

2.1.1Fkbp51KO與WT小鼠肝臟差異表達基因的GO本體分析

利用BRB-ArrayTools軟件對Fkbp51KO和WT小鼠的肝臟基因進行差異篩選，共篩選出206個差異基因，其中154個基因呈現上調趨勢，52個基因呈現下調趨勢。通過在線工具DAVID對肝臟的差異基因進行GO本體分析，分別從生物學過程、細胞組成和分子功能對基因進行注釋(圖1)，并統計每個注釋中的上調基因和下調基因個數(表1)。從圖中可以看出，肝臟中的差異基因主要涉及與脂類物質代謝相關的生物學過程，在細胞組成中涉及到高密度脂蛋白顆粒，在分子功能中涉及到芳香化酶活性、轉移酶活性以及類固醇脫氫酶活性。這一分析也進一步驗證了這些差異基因在肝臟中的重要性。

對這些差異表達基因進行生物學過程分析發現：主要涉及類固醇生物合成過程、氧化還原反應、類固醇代謝過程、脂類生物合成過程等生物學過程(表2)。

表1　KO與WT小鼠肝臟差異基因的變化趨勢

表2　KO與WT小鼠肝臟差異基因的生物學過程

注：Fisher檢驗,P< 0.001；Benjamini-Hochberg校正,P<0.01。

Note: Fisher’s exact test,P<0.001; Benjamini-Hochberg corrected,P<0.01.

2.2.2Fkbp51KO與WT小鼠肝臟差異表達基因的KEGG通路分析

同時DAVID在線工具對上述差異基因進行KEGG通路分析發現，這些差異基因主要參與藥物代謝、視黃醇代謝、細胞色素P450外源性代謝、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝等信號通路(表3)。

2.2Fkbp51KO與WT小鼠海馬差異表達基因的分析

2.2.1Fkbp51KO與WT小鼠海馬差異表達基因的GO本體分析

利用BRB-ArrayTools軟件對Fkbp51KO和WT小鼠的海馬基因進行差異篩選，共篩選出364個差異基因，其中172個上調基因，192個下調基因。通過在線工具DAVID對海馬的差異基因進行GO本體分析，分別從生物學過程、細胞組成和分子功能對基因進行注釋(圖2)，并統計每個注釋中的上調基因和下調基因個數(表4)。從圖中可以看出，海馬中的差異基因主要涉及與神經調節相關的生物學過程，在細胞組成方面涉及到與神經調節相關的纖維以及微管，在分子功能上涉及順-反異構酶等的活性。這一統計也正進一步驗證了這些差異基因在海馬中的重要性。

通過對這些差異表達基因進行生物學過程分析發現：主要涉及機械刺激探測、學習或記憶、多糖分解過程、突觸傳遞的調節等生物學過程(表5)。

表3　KO與WT小鼠肝臟差異基因的KEGG通路

注：Fisher檢驗,P<0.001；Benjamini-Hochberg校正,P<0.01。

Note: Fisher’s exact test,P<0.001; Benjamini-Hochberg corrected,P<0.01.

圖2　KO與WT小鼠海馬差異基因GO本體分析Fig.2　GO analysis of the Hippocampus differentially expressed genes in KO and WT

表4　KO與WT小鼠海馬差異基因的變化趨勢

表5　WT與Fkbp51KO小鼠海馬差異基因的生物學過程

注：Fisher檢驗,P<0.001。

Note:Fisher’s exact test,P<0.001.

表6　WT與Fkbp51KO小鼠海馬差異基因的KEGG通路

注：Fisher檢驗,P< 0.001。

Note:Fisher’s exact test,P<0.001.

2.2.2Fkbp51KO與WT小鼠海馬差異表達基因的KEGG通路分析

同時DAVID在線工具對上述差異基因進行KEGG通路分析發現，這些差異基因主要參與PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、軸突導向通路、神經配體-受體相互作用通路等信號通路(表6)。

2.3Fkbp51KO與WT小鼠肝臟與海馬共差異表達基因的分析

2.3.1Fkbp51KO與WT小鼠肝臟與海馬共差異表達基因的篩選

通過BRB-ArrayTools工具對兩樣本分類比較后一共找出11個共差異表達基因(圖3)，其中Abca3、Cela1、Fkbp5、Glo1、Hmgcs2、Insig1、Per3、Usp2在肝臟與海馬中的變化趨勢相同，而Cml1、Dbp、Gstm6變化趨勢相反，具體見表7。

圖3　 海馬與肝臟共差異表達基因Fig.3　Coexpression analysis of liver and hippocampus differentially expressed genes

表7KO與WT小鼠肝臟與海馬差異基因

Tab.7Liver and hippocampus differentially expressed genes differentially expressed genes in KO and WT

序號Number基因名稱NameofgenesKO/WT倍數(肝臟)KO/WTmultiple(liver)KO/WT倍數(海馬)KO/WTmultiple(hippocampus)1Abca34.4964↑1.1996↑2Cela14.3763↑2.0984↑3Cml13.4376↑0.6860↓4Dbp31.4498↑0.9561↓5Fkbp50.0180↓0.1159↓6Glo12.5599↑2.0965↑7Gstm62.5472↑0.6540↓8Hmgcs20.4022↓0.4807↓9Insig13.2643↑1.3971↑10Per310.4440↑1.2905↑11Usp24.9330↑1.2301↑

2.3.2Fkbp51KO與WT小鼠肝臟與海馬共差異表達基因的蛋白網絡互作分析

通過STRING在線工具對11個差異表達基因編碼的蛋白進行蛋白-蛋白相互作用網絡分析(圖4-左)，發現PER3、DBP與USP2之間存在相互作用關系，HMGCS2與INSIG1之間存在互作關系，而其他蛋白之間無網絡關系。進一步的網絡互作分析發現，Fkbp51通過HSP90AA1、CSNKLE與PER3、USP2、DBP、PER1、PER2、CLOCK、CRY1、CRY2、ARNTl形成相互作用的網絡，而HMGCS2、INSIG1與SREBF2、SCAP形成網絡關系(圖4-右、表8)。HSP90AA1、CSNK1E、PER1、PER2、CLOCK、CRY1、CRY2、ARNTl、SREBF2以及SCAP雖然未出現在我們的測序數據里，但是為我們研究這些共差異蛋白在脂類代謝與神經調節中的作用提供了一個明確的思路，具有非常重要的意義。

圖4　肝臟與海馬共差異表達基因蛋白互作網絡圖Fig.4　Protein-protein interaction network of the differentially expressed genes

表8　肝臟與海馬共差異表達基因的可能作用基因

3　討論

Fkbp51在代謝與神經中的具體作用機制目前仍不清楚，其作用機制可能涉及多個方面，這是一個多基因、多途徑、多步驟、多信號通路相互作用和相互影響的過程。因此，研究Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬RNA-seq，對于從分子水平揭示Fkbp51在生物體內的作用是一個重要的突破口。

首先，對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟數據進行挖掘，共篩選出206個差異表達基因。通過進一步的GO本體和KEGG通路分析，我們發現這些差異表達基因主要參與類固醇生物合成與代謝、脂類代謝、藥物代謝通路、視黃醇代謝通路、細胞色素P450外源性代謝通路、花生四烯酸以及亞油酸代謝通路等分子生物過程及信號通路。而Akr1c、Hsd3b、Sc4molL和Fdps幾乎參與上述所有過程。研究報道：Akr1c編碼酮類還原酶家族，此家族包含40種已知的酶。這些酶利用NADH/NADPH催化醛與酮之間的轉換；Hsd3b編碼的蛋白為一種雙功能酶，在類固醇的所有生物合成階段發揮重要作用；Sc4molL編碼甲基固醇單加氧酶，位于內質網膜，在內源性膽固醇合成中扮演重要角色；而Fdps編碼法尼基焦磷酸合酶，可以催化合成香葉基焦磷酸酯和法尼基焦磷酸酯，而法尼基焦磷酸酯是膽固醇和甾醇生物合成過程中重要的中間物質。因此深入研究Fkbp51與這些基因之間的關系，對于探究Fkbp51在脂代謝中的作用具有重要意義。

然后，對Fkbp51KO與WT小鼠的海馬數據進行挖掘，共篩選出364個差異表達基因。這些差異基因主要參與機械刺激探測、學習或記憶、多糖分解過程、突觸傳遞的調節等生物學過程以及PPAR信號通路、肌萎縮性脊髓側索硬化癥(ALS)、軸突導向通路、神經配體-受體相互作用通路等信號通路。同時我們對這些差異表達基因進行蛋白-蛋白相互作用網絡分析發現泛素蛋白C(Ubiquitin C，UBC)居于網絡中心，我們通過文獻檢索發現UBC與蛋白降解、DNA修復、細胞周期調控、激酶修飾以及細胞內吞作用均有關，且該蛋白參與PI-3K級聯反應。

最后，在肝臟與海馬的共差異表達分析中，我們發現HMGCS2與INSIG1存在互作關系。Hmgcs2編碼3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A合酶2，是一種線粒體酶，催化生酮反應的第一步反應，主要在碳水化合物缺失(比如禁食)時發揮作用，研究顯示野生型小鼠體重減輕時，此蛋白表達量也隨之降低。Insig1是胰島素誘發基因1，編碼內質網膜蛋白，研究發現此蛋白具有促進膽固醇合成和抑制脂類生成的作用。進一步分析發現，SCAP和SREBF2也參與此互作關系。Srebf2是固醇調節元件結合因子2，調節低密度脂蛋白、膽固醇和脂肪酸的轉錄，維持脂類穩態。SCAP是SREBP的伴侶蛋白，在高膽固醇和氧甾醇密集時，SREBP-SCAP復合物通過內質網保留蛋白INSIG1的作用滯留在內質網上；而在低膽固醇時，SREBP-SCAP復合物離開內質網進入細胞核激活靶基因的轉錄，進而促進固醇、脂肪酸以及甘油三酯等物質的合成[15]。在Fkbp51KO與WT小鼠的測序數據中，我們發現KO與WT小鼠相比，其HMGCS2表達量下降，而INSIG1表達量升高，這些均提示敲除Fkbp51基因可能通過這些基因調節脂類合成和代謝[16]。

從共差異表達蛋白網絡互作圖中，我們還發現USP2與PER、CRY、DBP等蛋白存在相互作用。Usp2基因編碼泛素特異性肽酶2，具有去泛素化作用，主要靶蛋白為脂肪酸合成酶、小鼠雙微粒2(MDM2)以及細胞周期蛋白D1(cyclin D1)，并且在腫瘤壞死因子α(TNF-α)和核因子kB(NF-kB)信號通路中發揮重要作用。其中Mdm2是腫瘤抑制基因P53的負性調節因子，而細胞周期蛋白D1在細胞周期G1/S轉換中發揮重要作用。Dbp基因編碼白蛋白啟動子D位點結合蛋白，可結合白蛋白、Cyp2a4和Cyp2a5等基因的啟動子區，此外還能夠調節與生物節律相關的基因的表達。而Per3基因編碼的蛋白屬于生物鐘節律蛋白，是自發活動、代謝、行為的生物周期節律的蛋白組件，主要參與生物節律通路。CLOCK/ARNTL異質二聚體可以上調該蛋白，而PER/CRY異二聚體可以通過結合CLOCK/ARNTL進而抑制其上調作用。在代謝方面有研究報道，小鼠肝臟中的USP2A可以通過促進CRY1去泛素化來增加其穩定性，以此來對抗炎癥反應，而這一穩定性的維持則是通過抑制Per2啟動子活性實現的。有趣的是，促炎癥因子、TNF-α可以使CRY1蛋白表達水平增加并抑制與生物鐘相關的基因表達[17]。在神經方面研究報道稱，USP2的去泛素化作用與生物節律蛋白密切相關，在低光照強度下Usp2-/-小鼠比WT小鼠的相位延遲明顯提高。最近的流行病研究顯示：生物節律的混亂會造成代謝上的紊亂[17-18]。在我們的測序數據中，USP2、PER與DBP蛋白在肝臟與海馬中的變化正是說明代謝調節與神經調節是緊密聯系的。

本研究通過對Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬RNA-Seq數據分析后，發現Fkbp51在脂類代謝和神經調節中的作用既是相互獨立又是相互聯系的，也為下一步深入研究Fkbp51基因在脂類代謝和神經調節中作用的分子機制提供了理論基礎。未來我們將繼續展開工作，對這些數據分析進行后續的分子生物學實驗，以期進一步驗證這些分析的可靠性。

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The gene expression profiling difference of liver and brain hippocampus between wild type andFkbp51 knockout mice

XU Yu-xue, QIU Bin, WEI Qiang,YONG Wei-dong

(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS) & Comparative Medical Center，Peking Union Medical College (PUMC); Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health; Key Laboratory of Human Disease Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100021, China)

ObjectiveThe purpose of this study is to understand the function ofFkbp51 in metabolic pathways and neural pathways by profiling gene expression of liver and hippocampus tissues of bothFkbp51KO and WT mice.Methods mRNAs of liver and hippocampus ofFkbp51KO and WT mice were isolated and expression profiling was performed using RNA-seq. Differentially expressed gene between KO and WT were analyzed using BRB-Array Tools. DAVID, STRING, Genecard programs, the Gene Ontology, the Protein-protein Interaction Network and the Gene Annotation were applied to identify significant functional-relevant pathways. ResultsWhen compared differentially expressed genes betweenFkbp51KO and WT in liver, we found that the loss ofFkbp51 in liver has large effect on the genes related to steroid biosynthetic and metabolic process, lipid biosynthetic process and oxidation reduction. When differentially expressed gene in hippocampus was studied between genotypes, we found that elimination ofFkbp51 has much effect on genes related to detection of mechanical stimulus, learning or memory, regulation of synaptic transmission and the pathway of PPAR and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) e.g. When intersection of gene lists between liver and hippocampus tissues, we identified 11 common differentially expression genes. In these genes, HMGCS2 and INSIG1 are grouped in one protein-protein interaction network, and USP2, PER, CRY and DBP are grouped in another network. ConclusionsThe role ofFkbp51 in metabolism and nervous system is not only independent but also interactive.

Fkbp51 knockout mice;Liver; Nervous system;RNA-seq

國家自然科學基金(81272273)；協和青年基金和中央高校基本科研業務費專項資金資助(333320140151、3332015054、3320140086)；中國醫學科學院醫學實驗動物研究所基本科研業務費專項資助(DWS201508)。

徐玉雪(1988-)，女，碩士，研究方向：基因與發育生物學。E-mail: 978268201@qq.com。

雍偉東(1967-)，男，研究方向：生殖與發育生物學。Email: wyong@cnilas.org；魏強(1964-)，男，研究方向：實驗動物病毒學 Email: weiqiang0430@sohu.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016) 05-0040-09

10.3969.j.issn.1671.7856. 2016.005.006

2016-01-10