姜黃素對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響及機制研究

李香波　薛長春　吳震宇　李潔超　張赟峰　趙維納

(北京市大興區人民醫院內分泌科，北京　102600)

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實 驗 研 究

姜黃素對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響及機制研究

李香波薛長春吳震宇李潔超張赟峰趙維納1

(北京市大興區人民醫院內分泌科，北京102600)

【摘要】目的研究姜黃素對糖尿病大鼠心肌纖維化的影響及機制。方法將35只雄性SD大鼠以1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液45 mg/kg一次性尾靜脈注射制備糖尿病模型后，隨機分為模型組、姜黃素低劑量組及姜黃素高劑量組，每組各10只，另取10只大鼠為正常對照組。姜黃素低劑量組及姜黃素高劑量組大鼠分別予姜黃素溶液15、30 mg/(kg·d)腹腔注射，正常對照組及模型組大鼠予等容積6%乙醇和6%聚乙二醇混合液腹腔注射，連續用藥8周。最后一次給藥后采集各組大鼠心肌組織標本，以實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)檢測miR-130b 表達，Western-blot 法檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白表達。結果與正常對照組相比，模型組大鼠心肌miR-130b表達明顯降低(P<0.05)，TGF-β1蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，姜黃素低、高劑量組大鼠心肌miR-130b表達明顯升高(P<0.05)，TGF-β1蛋白及Ⅰ型膠原蛋白表達水平降低(P<0.05)，且姜黃素高劑量組與姜黃素低劑量組比較差異均有統計學意義(P<0.05)。結論姜黃素可通過miR-130b介導，抑制TGF-β1表達，對糖尿病大鼠心肌有保護作用。

【關鍵詞】糖尿病，實驗性；心肌纖維化；姜黃素；蛋白

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是嚴重的心肌病變，心肌間質膠原纖維沉積和纖維化是引起DCM的重要因素[1]。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是心肌組織中重要的信號分子，參與心肌纖維化、心肌細胞肥大和凋亡等生物學過程[2]。姜黃素是從中藥姜黃中提取的酚性有效單體[3]，干預糖尿病心肌纖維化[4]，但機制尚不明確。本實驗通過研究姜黃素對糖尿病大鼠心肌TGF-β1的影響和機制，為姜黃素治療糖尿病心肌纖維化提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物雄性SD大鼠(北京華阜康生物科技股份有限公司)，動物合格證號2014038，體質量180～230 g，分籠飼養，自由飲食和攝水，實驗室內自然晝夜光線照明，通風良好，室內溫度保持在18～25 ℃，相對濕度為40%～70%。

1.1.2藥品及試劑姜黃素，Sigma-Aldrich 公司；BulgeTMmiRNA qRT-PCR Primer Set，實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)試劑盒，廣州市銳博生物科技有限公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體和兔抗鼠CollagenⅠ多克隆抗體，Abcam公司；兔抗鼠β-actin多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司；OMEGA RNA 組織提取試劑盒，北京宜科思源科技有限公司，引物由廣州市銳博生物科技有限公司合成。

1.1.3主要儀器便攜式血糖儀，美國強生公司；Stepone熒光定量PCR，美國ABI公司；蛋白質雙向電泳系統、Mini Trans-Blot蛋白轉膜儀，美國BIO-RAD公司。

1.2方法

1.2.1模型制備雄性SD大鼠45只，適應性喂養1周后隨機取10只為正常對照組；其余35只以1%鏈脲佐菌素(STZ)溶液45 mg/kg一次性尾靜脈注射。正常對照組予等容積0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液一次性尾靜脈注射。注射后72 h非同日連續3次測定空腹血糖均≥16.7 mmol/L為糖尿病模型成功。將糖尿病模型大鼠隨機分為模型組、姜黃素低劑量組及姜黃素高劑量組，每組各10只。

1.2.2給藥方法姜黃素低劑量組及姜黃素高劑量組大鼠分別予姜黃素溶液(姜黃素溶于6%和乙醇和6%聚乙二醇混合液，藥液比例為1∶1)15 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)腹腔注射。正常對照組及模型組予等容積6%乙醇和6%聚乙二醇混合液(1∶1)腹腔注射，連續用藥8周。每周測各組大鼠體質量，根據體質量調整用藥量。

1.3觀察指標及方法

1.3.1標本采集最后一次給藥后，股動脈放血法處死各組大鼠，開胸取出心臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈，取5 mm×5 mm×5 mm左心室心肌組織，浸入4%多聚甲醛溶液中固定，用石蠟進行包埋。

1.3.2Real-time PCR 檢測miR-130b 表達用OMEGA RNA 組織提取試劑盒提取心肌組織總RNA，紫外檢測儀分別在 260、280 nm 波長下檢測 RNA 濃度及純度。按照BulgeTMmiRNA qRT-PCR Primer Set步驟進行逆轉錄，引物序列為：miR-130b上游引物(5'→3')CTGGGCAGTGCAATGATGAAA，miR-130b下游引物(5'→3')GGTGTCGTGGAGTCGGCAA，qPCR反應體系：SYBR Green 9 μL，cDNA 2 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL。反應條件：95.0 °C，20 s，循環1次；95 °C，10 s，循環40次。miR-130b和U6的相對表達量用公式2-△△CT計算[5]。

1.3.3Western-blot 法檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白表達提取心肌總蛋白，檢測蛋白濃度和純度，Western-blot法觀察TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白表達水平。采用4000 R柯達成像系統采集圖像，進行圖像分析(條帶的光密度值與條帶面積比值為單位面積蛋白濃度)，以β-actin為內參。

2結果

2.14組大鼠用藥8周后空腹血糖及體質量比較見表1。

表1　4組大鼠用藥8周后空腹血糖及

與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，#P<0.05

由表1可見，與正常對照組相比，模型組大鼠空腹血糖升高，體質量減輕 (P<0.05)。與模型組比較，姜黃素低、高劑量組大鼠空腹血糖無明顯變化(P>0.05)，但體質量明顯下降(P<0.05)，且姜黃素高劑量組大鼠體質量低于姜黃素低劑量組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.24組大鼠心肌miR-130b表達水平比較見表2，圖1。

組 別n倍數正常對照組101.00±0.01模型組100.41±0.01*姜黃素低劑量組100.69±0.03△姜黃素高劑量組100.81±0.02△#

與正常對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，#P<0.05

圖1　4組大鼠心肌miR-130b表達

注：NC為正常對照組，MG為模型組，Cur-L為姜黃素低劑量組，Cur-H為姜黃素高劑量組

由表2、圖1可見，與正常對照組比較，模型組大鼠心肌miR-130b表達降低(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素低、高劑量組大鼠心肌miR-130b表達量明顯升高(P<0.05)，且姜黃素高劑量組高于姜黃素低劑量組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。2.34組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達水平比較見表3，圖2。

表3　4組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達水平比較　±s

與正常對照組比較， *P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，#P<0.05

圖2　4組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達

注：NC為正常對照組，MG為模型組，Cur-L為姜黃素低劑量組，Cur-H為姜黃素高劑量組

由表3、圖2可見，與正常對照組相比，模型組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素低劑量組及高劑量組大鼠心肌TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05)，且姜黃素高劑量組低于姜黃素低劑量組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.44組大鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白表達水平比較見表4，圖3。

表4　4組大鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白表達水平比較　±s

與正常對照組比較， *P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與姜黃素低劑量組比較，#P<0.05

圖3　4組大鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白表達

注：NC為正常對照組，MG為模型組，Cur-L為姜黃素低劑量組，Cur-H為姜黃素高劑量組

由表4、圖3可見，與正常對照組相比，模型組大鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素低劑量組及高劑量組大鼠心肌Ⅰ型膠原蛋白表達水平降低(P<0.05)，且姜黃素高劑量組低于姜黃素低劑量組，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

心肌纖維化是糖尿病心肌病特征性病理表現，高糖刺激導致心肌成纖維細胞代謝紊亂，Ⅰ型膠原合成增加[6]。研究表明，小劑量鏈脲佐菌素誘導大鼠2型糖尿病模型成模8周后檢測該模型有心臟肥大，心臟超微結構發生損傷性改變，心肌間質纖維化明顯，Ⅰ型膠原蛋白含量增加[7]。本研究Western-blot結果顯示，雄性SD大鼠注射1% STZ溶液8周后，模型組Ⅰ型膠原蛋白表達明顯升高，與文獻報道一致，可成功誘導糖尿病大鼠心肌纖維化模型。分布在心臟細胞外基質(extracellular matrix，ECM)中的膠原蛋白有Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型等，在正常情況下，心肌 ECM 中的膠原蛋白在體內各種機制的調節下處于一種不斷合成和降解的平衡狀態，維持心臟結構和功能的完整性和協調性[8]，任何一種蛋白改變都可能影響心肌間質的功能。Ⅰ型膠原蛋白是構成粗纖維的主要成分，約占膠原蛋白總量的80%以上，彈性小、僵硬度大、抗牽拉性強是Ⅰ型膠原蛋白的主要特性，主要作用是維持心室壁的強度和硬度。Ⅰ型膠原蛋白表達增加，進而在心肌細胞間隙沉積，導致心室壁僵硬，順應性下降，影響心室的舒張和收縮功能[9]。

TGF-β1/Smads信號轉導通路參與糖尿病心肌纖維化[10-11]，高糖刺激導致心肌中TGF-β1的表達明顯增加。本研究Western-blot結果表明，模型組大鼠TGF-β1表達明顯高于正常對照組，但是目前關于TGF-β1參與心肌纖維化機制的研究很少。Castro NE[12]在研究糖尿病腎病機制時發現，腎小球系膜細胞中TGF-β1異常表達導致細胞外基質異常積聚，纖維組織增生明顯，MicroRNAs調節TGF-β1表達，參與導致糖尿病腎臟纖維化相關基因的表達，轉染miR-130b mimic，明顯抑制TGF-β1的表達，推測miR-130b 是 TGF-β1 依賴的基因。本研究表明，在糖尿病大鼠心肌中miR-130b表達明顯下調，說明miR-130b可能參與糖尿病心肌纖維化的發病機制。

姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃根莖中提取的多酚類天然產物，藥理作用廣泛，主要為抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗纖維化[13]，目前在糖尿病心肌纖維化中姜黃素的作用研究很少。本研究通過復制糖尿病模型，姜黃素溶液腹腔注射，血糖檢測結果表明，與模型組比較，姜黃素干預組空腹血糖變化無統計學意義(P>0.05)，推測姜黃素沒有降糖作用；Western-blot結果表明姜黃素干預后，Ⅰ型膠原蛋白及TGF-β1蛋白的表達量明顯降低，大鼠心肌纖維化明顯改善，且有劑量依賴性；Real-time PCR結果表明姜黃素能夠上調miR-130b表達。推測姜黃素對糖尿病大鼠心肌的保護作用與上調miR-130b表達，抑制TGF-β1信號通路有關，這為糖尿病心肌纖維化的治療提供了實驗依據。

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(本文編輯：曹志娟)

doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2016.06.023

作者簡介：李香波(1978—)，女，主治醫師，學士。研究方向：糖尿病及并發癥的診治。

【中圖分類號】R587.23；R285.5；R542.23

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2016)06-0887-04

(收稿日期：2015-02-10)

Effects of curumin on myocardial fibrosis in diabetic rats and its mechanism

LIXiangbo,XUEChangchun,WUZhenyu,etal.

DepartmentofEndocrinology,DaXingDistrictPeople'sHospitalinBeijingGity，Beijing102600

【Abstract】Objective To investigate the effects of curumin on myocardial fibrosis in diabetic rats and its mechanism. Methods 35 male SD rats which were induced as diabetic model by 1% streptozotocin (45 mg/kg), were randomly divided into model, curumin low dose and high dose group, 10 rats in each group. Another 10 normal rats were employed as the control group. The curumin low dose and high dose group received intraperitoneal injection of curumin 15 and 30 mg/(kg·d), respectively. The control and model group received intraperitoneal injection of the mixture of 6% ethyl alcohol and 6% polyethylene glycol, continuously for 8 weeks. The expression of myocardial miR-130b were detected by real-time PCR, and the TGF-β1 and type Ⅰ collagen were detected by western-blot. Results The expression of myocardial miR-130b in model group was obviously decreased as compared with that in control group (P<0.05), and the TGF-β1 and type Ⅰ collagen were increased (P<0.05). The expression of myocardial miR-130b in low and high dose groups were obviously increased as compared with that in model group (P<0.05), and the TGF-β1 and type Ⅰ collagen were decreased (P<0.05), and there were statistical differences between low and high dose group (P<0.05). Conclusion Curcumin has protective effects on myocardium in diabetic rats through inhibiting TGF-β1 expression mediated by miR-130b.

【Key words】Diabetes; Experimental; Myocardial fibrosis; Curcumin; Protein

1牡丹江醫學院紅旗醫院神經科，黑龍江牡丹江157011