甘糖酯對糖尿病大鼠視網膜病變中炎性因子TNF-α和IL-1β表達的影響

周瑋琰，王洪亞，杜秀娟，董衛紅

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甘糖酯對糖尿病大鼠視網膜病變中炎性因子TNF-α和IL-1β表達的影響

周瑋琰1，王洪亞2，杜秀娟3，董衛紅1

1Department of Ophthalmology;2Department of Clinical Laboratory, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong Province, China;3Eye Center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Shandong Shierming Eye Hospital, Jinan 250002, Shandong Province, China

Correspondence to:Wei-Hong Dong. Department of Ophthalmology, Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Jinan 250021, Shandong Province, China. dongwh69@163.com

Received：2016-03-31Accepted：2016-07-07

?AIM: To investigate the influence of propylene glycol mannite sulfate (PGMS) on the expression of tumor necrosis factor -α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β), in diabetic retinopathy by a rat model, to study the mechanism of PGMS against diabetic retinopathy, and provide a reliable theoretical and experimental evidence for the PGMS to be applied to clinical prevention and treatment of diabetic retinopathy.

?METHODS: Male Wistar rats were randomized into 4 groups, normal control group, diabetic control group and PGMS in group, the PGMS in groups included the doses of 50mg/kg and 100mg/kg. 1% streptozotocin (STZ) of 60 mg/kg was intraperitoneally injected in rats to establish the diabetic models. The PGMS with the doses of 50mg/kg and 100mg/kg were used to gavage in different groups of models for 12wk. Twelve weeks later, the animals were sacrificed and retinas were isolated. The aqueous humors and serums were taken, expressions of TNF-α and IL-1β protein in retinas, aqueous humors and serums were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. The location and the expression of TNF-α and IL-1β protein in retina tissue was detected by immunohistochemistry.

?RESULTS: Twelve weeks after the use of PGMS, the level of blood glucose was not changed. ELISA showed that the expression of TNF-α and IL-1β protein in serum and retina was significantly increased in diabetic control group than in normal control group(P<0.05), but in the groups which PGMS was given reduced, lower than those in diabetes mellitus(DM) group, especially as the concentration of PGMS increased (P<0.05). But the levels of aqueous humor’s TNF-α and IL-1β proteins in PGMS group were not reduced. Immunohistochemistry showed that the TNF-α protein was almost not expressed in normal control group. But the TNF-α protein was highly expressed in diabetic control group. The expression mainly located in the ganglion cell layer, the inner plexiform layer, outer plexiform layer and pigment epithelium. The TNF-α protein was weakly expressed at the group of 50mg/kg PGMS, the TNF-α protein was almost not expressed at the group of 100mg/kg PGMS. When the normal control group was detected, the IL-1β protein was weakly expressed in the outer plexiform layer. But the IL-1β protein was also highly expressed in diabetic control group．The expression mainly located in the inner plexiform layer, outer plexiform layer and pigment epithelium. The IL-1β protein was weakly expressed at the group of 50mg/kg and 100mg/kg PGMS.

?CONCLUSION: PGMS can treat the diabetic retinopathy by downregulating the expressions of TNF-α and IL-1β in early diabetic retinopathy. PGMS maybe have a good control effect on early diabetic retinopathy.

Citation:Zhou WY, Wang HY, Du XJ,etal. Effects of propylene glycol mannite sulfate on the expression of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in the rat with diabetic retinopathy.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(8):1444-1448

摘要

目的：探討甘糖酯對糖尿病大鼠視網膜病變中炎性因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達變化的影響，為將甘糖酯應用于臨床上防治糖尿病視網膜病變提供可靠的理論和實驗依據。

方法：選取清潔級雄性成年Wistar大鼠，隨機分為正常對照組、糖尿病組、50mg/kg甘糖酯治療組和100mg/kg甘糖酯治療組。大鼠采用鏈脲佐菌素(STZ)60mg/kg一次性腹腔內注射制作糖尿病模型，甘糖酯治療組的給藥方法為甘糖酯溶液灌胃，持續12wk。給藥12wk后處死各組大鼠并分離視網膜，取房水、血清，用ELISA法檢測大鼠視網膜組織、房水及血清中TNF-α和IL-1β蛋白的表達變化，免疫組織化學檢測大鼠視網膜TNF-α和IL-1β蛋白表達的變化。

結果：給藥12wk后大鼠糖尿病視網膜病變模型中，甘糖酯對糖尿病大鼠的血糖沒有影響；ELISA檢測表明，糖尿病組大鼠血清與視網膜中的TNF-α和IL-1β含量增加，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；甘糖酯干預后血清及視網膜中TNF-α和IL-1β顯著降低，與糖尿病組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且甘糖酯濃度越高，降低越明顯。但是甘糖酯干預組房水中TNF-α和IL-1β蛋白的產生無明顯變化。免疫組織化學檢測表明，正常對照組視網膜中幾乎不表達TNF-α蛋白，糖尿病組TNF-α蛋白呈高表達狀態，主要位于視網膜神經節細胞層內叢狀層、外叢狀層及色素上皮層；50mg/kg甘糖酯干預組TNF-α弱表達，100mg/kg甘糖酯干預組TNF-α幾乎不表達。而在正常對照組視網膜中IL-1β在外核層微量表達，糖尿病組IL-1β在內叢狀層、外叢狀層及色素上皮層高表達；50mg/kg甘糖酯干預組及100mg/kg甘糖酯干預組IL-1β呈低表達。

結論：甘糖酯能抑制大鼠早期糖尿病視網膜病變中的炎性因子TNF-α和IL-1β的產生，提示其可能對糖尿病視網膜病變起著防治作用。

關鍵詞：甘糖酯；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-1β；糖尿病視網膜病變

引用：周瑋琰，王洪亞，杜秀娟，等.甘糖酯對糖尿病大鼠視網膜病變中炎性因子TNF-α和IL-1β表達的影響.國際眼科雜志2016;16(8):1444-1448

0引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是一種糖尿病病變中最常見的并發癥，也是糖尿病導致患者視力下降的重要原因。該病具體發病機制目前還不清楚，越來越多的文獻報道，炎癥反應以及炎性因子在糖尿病視網膜病變中起著重要作用[1-2]，而且其被認為是一種低度慢性炎癥性疾病[3]。

炎性因子腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素(interleukin-1β，IL-1β)被認為是在炎癥反應過程中出現最早、最為重要的因子，具有重要的免疫調節作用。目前已有大量的文獻報道這兩個因子參與了早期DR的發生，并在其發展中起著重要作用[4]。甘糖酯(propylene glycol mannite sulfate，PGMS)是一種最近合成的新型低分子量酸性多糖類藥物，有研究表明其具有抗炎的作用，在糖尿病腎病中該藥起著抑制炎性因子的作用，但其在糖尿病視網膜病變中的治療作用及機制尚未見系統的研究報道。根據甘糖酯的抗炎藥理作用，并針對炎性因子TNF-α和IL-1β在早期糖尿病視網膜病變中的作用，本研究應用甘糖酯干預STZ誘導的糖尿病大鼠，研究甘糖酯是否通過調節糖尿病大鼠模型中TNF-α和IL-1β蛋白的表達以抑制糖尿病視網膜病變的進展，旨在進一步探討DR的炎癥發病機制及甘糖醇對其的早期保護作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物山東大學實驗動物中心提供的雄性Wistar大鼠60只，體質量約為180～200g，所有大鼠購買后適應性飼養7d后用于實驗，實驗前斷尾取血，血糖儀測末梢血糖，排除患病大鼠，裂隙燈顯微鏡檢查眼部排除眼部疾病。于山東中醫藥大學眼科研究所動物實驗中心進行飼養。飼養條件：室溫23℃±2℃，光照不超過300lx，光照/黑暗時間12h/12h。

1.1.2藥物及主要試劑鏈脲佐菌素(streptozotoein，STZ)、檸檬酸、檸檬酸三鈉(美國Sigma公司)；甘糖酯(青島海爾藥業)；TNF-α多克隆抗體(美國Immunoway)；IL-1β多克隆抗體(美國Immunoway)；山羊抗兔IgG試劑盒(美國Immunoway)；免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)，大鼠TNF-α ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)，大鼠IL-1β ELISA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠糖尿病動物模型的建立及分組取材取新鮮配制的1% STZ溶液腹腔注射，劑量為60mg/kg，對照組則注射1.2mL無菌檸檬酸鈉緩沖液。STZ注射48h后，斷尾取血檢測末梢血糖，以后每周測量大鼠餐后末梢血糖，記錄體質量、飲水量和尿量，當血糖>16.7mmol/L時，尿糖>+++，且有多飲、多食、多尿的大鼠即為造模成功。觀察大鼠的生長狀態，裂隙燈顯微鏡觀察前節情況，散瞳后用直接眼底鏡檢查后節情況。按血糖隨即分成正常對照組、糖尿病組、甘糖酯治療組(50mg/kg組、100mg/kg組)，方法為甘糖酯溶液灌胃，持續12wk。造模過程中有6只大鼠注射STZ后糖尿病模型造模未成功，實驗過程中大鼠死亡4只，最終每組各選12只大鼠進入實驗。于造模12wk腹腔內注射質量分數10%水合氯醛處死各組大鼠，摘除大鼠右眼備用。各組大鼠摘除眼球后，暴露心臟，用10mL注射器從心尖進針左心室抽吸血液，離心后收集血清，-70℃冰箱中備存待用。

1.2.2 ELISA法測定大鼠視網膜組織、房水及血清中TNF-α和IL-1β蛋白含量取出眼球后置于冰塊上，抽取前房水后沿正中失狀軸偏顳側切開，去除晶狀體和玻璃體，剝取視網膜，加入含1μg/L蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，勻漿器將標本制成100g/L勻漿液，3 000r/min離心20min，收集上清。按前述方法取出的視網膜上清液、前房水、血清嚴格按試劑盒說明書的檢測步驟進行檢測，用酶標儀在450nm波長處測量各孔吸光度(A450)值，再乘以稀釋倍數，即為樣本的質量濃度。

1.2.3免疫組織化學觀察大鼠視網膜TNF-α和IL-1β蛋白表達以上各組在造模成功后12wk摘取眼球投入4%多聚甲醛固定液中，固定24h。酒精梯度脫水，石蠟包埋切片，脫蠟至水，抗原熱修復，過氧化氫封閉，正常山羊血清工作液封閉，分別滴加兔抗鼠TNF-α抗體(1∶100)、兔抗鼠IL-1β抗體(1∶200)4℃過夜，復溫沖洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫孵育15min，沖洗后滴加試劑SABC室溫孵育30min，PBS沖洗后DAB染色后蘇木素復染，脫水，透明，封片。每只眼球選取2張結構完整的視網膜切片，每張切片隨機選取5個視野，圖像處理分析軟件分析各組染色區的光密度(OD)值。

表1　ELISA檢測各組大鼠血清、房水、視網膜中TNF-α蛋白的含量　，pg/mL)

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vs糖尿病組；eP>0.05vs正常對照組；gP>0.05vs糖尿病組。

表2　ELISA檢測各組大鼠血清、房水、視網膜中IL-1β蛋白的含量　，pg/mL)

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vs糖尿病組；eP>0.05vs正常對照組；gP>0.05vs糖尿病組。

2結果

2.1大鼠血清、房水、視網膜中TNF-α蛋白含量測定ELISA法檢測結果顯示，糖尿病組大鼠血清與視網膜中的TNF-α蛋白含量較正常對照組增加，差異有統計學意義(P<0.05)，甘糖酯干預后血清及視網膜中TNF-α蛋白較糖尿病組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中100mg/kg甘糖酯對TNF-α蛋白的降低作用較50mg/kg甘糖酯作用強(P<0.05)；房水中TNF-α蛋白各組比較差異沒有統計學意義(P>0.05，表1)。

2.2大鼠血清、房水、視網膜中IL-1β蛋白含量測定ELISA法檢測結果顯示，糖尿病組大鼠血清與視網膜中的IL-1β蛋白含量較正常對照組增加，差異有統計學意義(P<0.05)，甘糖酯干預后血清及視網膜中IL-1β蛋白較糖尿病組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，其中100mg/kg甘糖酯對IL-1β蛋白的降低作用較50mg/kg甘糖酯作用強(P<0.05)；房水中IL-1β蛋白各組比較差異沒有統計學意義(P>0.05，表2)。

2.3各組大鼠視網膜TNF-α免疫組織化學結果免疫組織化學檢測結果示正常對照組幾乎不表達TNF-α蛋白，糖尿病組TNF-α蛋白呈高表達狀態，主要位于視網膜神經節細胞層內叢狀層、外叢狀層及色素上皮層；50mg/kg甘糖酯干預組TNF-α蛋白呈弱表達；100mg/kg甘糖酯干預組TNF-α蛋白幾乎不表達(圖1，表3)。

2.4各組大鼠視網膜IL-1β免疫組織化學結果正常對照組視網膜IL-1β蛋白在外核層微量表達，糖尿病組IL-1β蛋白表達在內叢狀層、外叢狀層及色素上皮層高表達；50mg/kg甘糖酯組及100mg/kg甘糖酯組IL-1β都較糖尿病組低表達(圖2，表3)。

3討論

DR是糖尿病最常見的微血管并發癥，它的危害性也越來越被廣泛地關注，然而目前對其治療多不理想，主要為早期視網膜光凝以及晚期玻璃體切割手術進行治療，而有效的藥物治療尚處于探索階段。近年的許多觀點認為DR是一種炎癥相關性疾病，高血糖導致白細胞在視網膜組織內聚集增加，產生相應的炎癥因子，誘發隨后的炎癥反應[5]，炎癥因子在其中起著重要作用。炎性因子過度表達引起的炎性反應能導致糖尿病視網膜的損傷，文獻報道炎性因子IL-1β、TNF-α被認為與DR發生發展密切相關[6]。

IL-1β是IL-1基因家族成員之一，是一種在DR發生發展中起關鍵作用的致炎因子，能夠協同其他的細胞因子促進B細胞活化，在白細胞的激活、趨化、附壁及滲出等各個階段都發揮重要作用[7]。胡毅等認為糖尿病視網膜病變可誘導IL-1β產生，產生的IL-1β則可以通過促進黏附分子表達、氧自由基的釋放、鈣超載等途徑加重糖尿病視網膜病變[8]。TNF-α是一種具有很多功能的炎性因子，其由單核細胞或巨噬細胞活化后產生。研究發現TNF-α表達增加可以用來監測DR疾病的嚴重程度[9]。該因子可以刺激炎癥反應，促進白細胞黏附以及聚集，最終導致視網膜炎癥反應的加重[10-11]。其也可以促進血管內皮生長因子的分泌以及血管內皮細胞的過度生長，加重視網膜新生血管膜的生長。同樣文獻報道也表明糖尿病患者視網膜中炎性因子IL-1β、TNF-α的釋放，也可以通過激活小膠質細胞、增加內皮細胞黏附力等方式造成白細胞的聚集和毛細血管的滲漏增加[12-13]，同時也有作者發現DR患者血清IL-1β、TNF-α濃度較正常組升高，這種升高程度與DR的病程和嚴重程度呈正相關。

圖1免疫組織化學檢測各組大鼠視網膜TNF-α蛋白的變化(DAB，×400)A：正常對照組；B：糖尿病組；C：50mg/mL甘糖酯組；D：100mg/mL甘糖酯組。

圖2蛋白免疫組織化學各組大鼠視網膜IL-1β蛋白的變化(DAB，×400)A：正常對照組；B：糖尿病組；C：50mg/mL甘糖酯組；D：100mg/mL甘糖酯組。

表3　各組大鼠視網膜TNF-α和IL-1β蛋白免疫組織化學灰度值的變化　±s

注：aP<0.05vs正常對照組；cP<0.05vs糖尿病組；eP<0.05vs低甘糖酯組。

甘糖酯是由青島海洋大學海洋藥物與食品研究所在藻酸雙酯鈉(PSS)的基礎上研制而成的一種新型低分子量酸性多糖類藥物，屬線形陰離子多糖。已有實驗表明，PGMS有保護血管內皮細胞免受炎性因子及多種化學物質損傷的作用[14]。體外培養臍靜脈血管內皮細胞的研究發現，甘糖酯能抑制多聚陽離子以及氧自由基對人臍靜脈血管內皮細胞炎癥的損傷[15]。同時其能改善糖尿病大鼠體內自由基代謝的紊亂[16]。已有研究表明，甘糖酯可以抑制糖尿病大鼠腎臟中炎癥因子的表達[17-18]，臨床上也有較多研究表明甘糖酯可以降低糖尿病患者的血脂及外周血的炎癥因子的水平[19]。巨噬細胞作為較早啟動的炎性細胞之一，它們可以分泌炎性因子以及吸引更多的炎性細胞黏附參與炎性反應[20]，而PGMS被報道可以穩定巨噬細胞，降低其活化水平。

大量的研究表明，TNF-α和IL-1β在DR發病早期起著重要的作用，但是甘糖醇對其影響作用目前尚未有研究，我們應用ELISA及免疫組織化學檢測糖尿病大鼠模型，研究結果表明造模成功的糖尿病大鼠在3mo時血清及視網膜中的TNF-α和IL-1β較正常對照組升高，這種情況與以前的文獻是一致的，而給予甘糖酯預干預后，這兩種炎癥因子表達顯著降低。同時我們應用ELISA檢測大鼠房水中TNF-α和IL-1β的表達，我們發現糖尿病大鼠房水中TNF-α和IL-1β含量與正常對照組對比差異無統計學意義。而甘糖酯干預后，房水中兩種因子的表達也無明顯變化。我們猜測這可能與早期糖尿病對眼部的損傷集中于玻璃體及視網膜中，晚期時才能引起眼前部損傷有關系，當然這還需要進一步的實驗證實。通過實驗我們可以看出，甘糖酯能抑制DR大鼠血清以及視網膜中炎性因子TNF-α和IL-1β蛋白的表達，這種改變可能就是其防治糖尿病視網膜病變的機制所在。

本研究證實，甘糖酯對DR大鼠血清及視網膜中炎性因子TNF-α和IL-1β蛋白表達有著抑制作用，這可能和甘糖酯抑制糖尿病視網膜病變的發生發展有關系，然而目前關于甘糖酯對DR的治療及作用機制的研究尚處于初級階段。鑒于糖尿病視網膜病變的發病機制非常復雜，而且炎性反應也只是其復雜發病機制的一種理論，因此,甘糖酯對糖尿病視網膜病變防治作用的具體機制尚待進一步研究，我們將繼續為甘糖酯應用于臨床上治療糖尿病視網膜病變提供可靠的理論和實驗依據。

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基金項目：山東省科學技術發展計劃(No.2010G0020239)；山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金(No.BS2014YY060)

作者單位：(250021)中國山東省濟南市，山東大學附屬省立醫院1眼科；2檢驗科；3(250002)中國山東省濟南市，山東中醫藥大學眼科中心 山東施爾明眼科醫院

作者簡介：周瑋琰，博士，主治醫師，研究方向：糖尿病視網膜病變的基礎與臨床研究。

通訊作者：董衛紅，碩士，主任醫師，研究方向：眼底病.dongwh69@163.com

收稿日期：2016-03-31 修回日期： 2016-07-07

Foundation items:Science and Technology Development Plan of Shandong Province(No.2010G0020239); Shangdong Province Young and Middle-Aged Scientists Research Awards Fund (No.BS2014YY060)

DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.8.10

?KEYWORDS:propylene glycol mannite sulfate; tumor necrosis factor-α; interleukin-1β; diabetic retinopathy

Effects of propylene glycol mannite sulfate on the expression of tumor necrosis factor-α and interleukin-1β in the rat with diabetic retinopathy

Wei-Yan Zhou1, Hong-Ya Wang2, Xiu-Juan Du3, Wei-Hong Dong1

Abstract