不同時間慢性間歇性缺氧對大鼠海馬細胞凋亡及Caspase- 3表達的影響

西電集團醫院神經內科(西安710077)　張　恒　姚　力　侯沛紅　何劍波　李會琪

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不同時間慢性間歇性缺氧對大鼠海馬細胞凋亡及Caspase- 3表達的影響

西電集團醫院神經內科(西安710077)張恒姚力△侯沛紅何劍波李會琪

摘要目的：研究在不同持續時間下慢性間斷性缺氧(CIH)對大鼠海馬區中神經細胞凋亡及Caspase-3表達的影響。方法：取健康雄性SD大鼠30只隨機分為三組，即對照組(10只)、CIH4周組(10只)和CIH8周組(10只)。分別用原位未端標記法(TUNEL)和免疫組織化學方法檢測大鼠腦組織中的凋亡細胞和Caspase-3蛋白表達。結果：CIH8周組同其他兩組相比，具有顯著差異(P<0.01)；組間多重比較也存在著顯著差異(P<0.05)。CIH4周組及CIH8周組海馬區均可見Caspase-3陽性細胞表達增強(P<0.01)，CIH8周組Caspase-3陽性表達與CIH4周組比較有統計學意義(P<0.05)。結論:伴隨著CIH持續時間的不斷增加，神經細胞凋亡的數量也不斷增加，Caspase-3蛋白表達也增強(P<0.01)。CIH持續時間對大鼠腦組織細胞凋亡有著重要意義。

主題詞缺氧 細胞凋亡@Caspase- 3

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(簡稱OSAS)主要表現為不斷重復出現的低氧、高碳酸血癥以及睡眠混亂，并最終導致器官出現損傷[1-2]。Caspase-3是半胱氨酸蛋白酶的級聯通路的效應分子，主要功能就是控制細胞凋亡的發生與否。有文獻報道慢性間歇性缺氧(CIH)不同嚴重程度對大鼠皮層神經細胞凋亡有著差異性表達[3]，但對CIH不同持續時間報道卻鳳毛麟角。本文根據OSAS患者發生CIH時的主要特征來建立大鼠模型 ,采取不同時間長度干預，觀察 CIH 對大鼠前額葉區神經細胞凋亡及Caspase- 3表達的影響。

材料與方法

1材料30只雄性200～250gSD大鼠，設對照組、CIH4周組、CIH8周組(n=10),Caspase-3兔抗鼠多克隆抗體、MaxVisionTM一步法試劑盒、原位細胞凋亡檢測(TUNEL)試劑盒。

2方法本文所選用的模型參照了文獻[4]的方法，制作出相應的氧濃度變化趨勢圖，如圖1。實驗結束后進行TUNEL染色及免疫組織進行化學染色。在光鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件來測量相應的累積吸光度值(簡稱為IOD) 表示Caspase- 3表達水平。

圖1　間歇性缺氧箱內氧濃度變化趨勢圖(1個周期)

結果

在400倍鏡下觀察發現凋亡的細胞呈藍黑色，結果可以參照凋亡小體。對照組則無TUNEL陽性細胞；與其余兩組比較，CIH8周組凋亡細胞明顯增多(F=29.32，P<0.01)；實驗組海馬區均可見Caspase-3陽性細胞表達增強，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。各組間多重比較有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1　各組大鼠腦組織TUNEL陽性細胞數比較及Caspase-3免疫組化結果比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與CIH4周組比較，△P<0.05

討論

OSAS的后果已被廣泛研究從實驗和臨床水平證實，主要病理就是CIH，是腦血管疾病的獨立危險因素。全身和器官特異性氧化應激通過間歇性缺氧觸發被認為OSAS這些中期和長期后果的關鍵作用[5-6]。細胞凋亡尤其在神系統變性病的發病機制中起到至關重要的作用，針對CIH以后的大腦神經細胞凋亡現象以及相應的機理進行研究，能夠很好地揭示這些疾病之間的關系。本研究通過控制密閉箱內不同氣體持續時間，設置了靜息狀態，并通過快速氧氣輸入，使箱內氧濃度快速提升到大氣中氧濃度水平。這種以濃度結合時間切換方式，更加地接近OSAS的臨床真實狀態。經缺氧處理后，經過測量氧濃度和大鼠動脈血氣的分析以后，可以得出結論：這種處理方法能夠很好地模擬出OSAS的血氧變化情況。

所謂的細胞凋亡，其實就是受到細胞內的基因和酶控制的一個過程，涉及到很多個通路，而對這些通路起關鍵作用的就是Caspase 家族。其中Caspase-3 是最重要的一個起執行作用的蛋白。TUNEL法染色法可以對單個凋亡細胞進行原位染色，是檢測細胞凋亡的特異性和敏感性很高的方法。本研究結果發現，CIH模型中大鼠的海馬神經細胞中的Caspase-3蛋白表達會隨著CIH時間的長短而變化，兩者呈正相關關系，而且相應的過程能夠同神經細胞凋亡的過程大致相同，這也就是說隨著Caspase-3蛋白的表達增多，能夠在很大程度上激活了Caspase家族的蛋白酶級聯反應，這才導致神經細胞開始出現過度凋亡的現象，這同時也說明了Caspase-3其實是參與了CIH大鼠的神經細胞凋亡的調控過程，這與國內多數研究結果相一致。也提示我們不同的CIH持續時間對神經元細胞凋亡有著一定程度的影響。

參考文獻

[1]Hui X, Wing-ho Y. Chronic intermittent hypoxia-induced deficits in synaptic plasticity and neurocognitive functions: a role for brain-derived neurotrophic factor[J]. Acta Pharmacologica Sinica,2012,33(1):5-10.

[2]謝柏梅，王博，董玉.慢性阻塞性肺疾病患者的認知損害研究進展[J]. 陜西醫學雜志，2015，44(1)：119.

[3]趙雅寧，王紅陽，李琳,等. 不同程度間歇性低氧對大鼠不同腦區Bax、Bcl-2表達的影響[J]. 中國老年學雜志，2015，35(1)：162-163.

[4]宋愛玲，曾奕明.慢性間斷性缺氧對小鼠腎組織結構、基質金屬蛋白酶及其組織抑制因子表達的影響[J]. 國際呼吸雜志，2007, 27(11):808-812.

[5]吳雨嶺，余鴻，徐富翠.缺氧對鼠胚大腦神經元c-Fos表達的影響及當歸保護作用[J]. 陜西醫學雜志，2006，35(4)：391-393.

[6]Farias JG, Puebla M, Acevedo A,etal. Oxidative stress in rat testis and epididymis under intermittent hypobaric hypoxia: protective role of ascorbate supplementation[J]. Androl，2010，31:314-321.

(收稿：2016-01-04)

通訊作者△

【中圖分類號】R33

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.08.002