泥蚶HDAC1基因cDNA全長、內(nèi)含子克隆及時空表達(dá)特征分析

任付真，姚韓韓，董迎輝，周小龍，林志華*

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

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泥蚶HDAC1基因cDNA全長、內(nèi)含子克隆及時空表達(dá)特征分析

任付真1，2，姚韓韓2，董迎輝2，周小龍1，林志華2*

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點實驗室，浙江 寧波 315100)

摘要：HDAC1作為HDACs家族中重要成員，可使組蛋白去乙酰化進而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在細(xì)胞分化和胚胎早期發(fā)育中起重要作用。本文利用SMART RACE技術(shù)克隆得到泥蚶HDAC1(Tg-HDAC1)基因的cDNA全長序列，并對其內(nèi)含子進行擴增及不同組織、不同發(fā)育時期的定量表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Tg-HDAC1基因的cDNA序列全長為2 275 bp，開放閱讀框(ORF)1 587 bp，編碼528個氨基酸；Tg-HDAC1蛋白序列與斑馬魚、雞、小鼠等的相似性都在80%以上，表明該蛋白氨基酸序列在物種進化過程中具有保守性；在Tg-HDAC1基因中擴增出13個內(nèi)含子，均存在于開放閱讀框中，且都遵循GT-AG原則；熒光定量PCR(qRT-PCR)分析結(jié)果顯示，Tg-HDAC1基因在成體血液、內(nèi)臟團、外套膜、鰓、斧足和閉殼肌6個組織中均有表達(dá)，而在足中的表達(dá)量最高，且與其余5組織中的表達(dá)量有極顯著差異(P<0.01)，說明它對該組織生長具有重要作用。不同發(fā)育時期的表達(dá)差異結(jié)果表明，Tg-HDAC1基因在擔(dān)輪幼蟲期表達(dá)量最高，顯著高于其他發(fā)育時期(P<0.05)。

關(guān)鍵詞：泥蚶；組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)；基因克隆；內(nèi)含子；表達(dá)分析

1引言

組蛋白去乙酰化酶1(Histone deacetylase 1， HDAC1)是HDACs家族中重要的一類蛋白酶，在幾乎所有細(xì)胞的細(xì)胞核中均有表達(dá)，對細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育起重要作用[1]。迄今HDAC1基因已在線蟲(Caenorhabditiselegans)[2]、果蠅(Drosophilamelanogaster)[3]、斑馬魚(Daniorerio)[4]等模式生物中進行了大量研究。在脊椎動物中，Taunton等[5]發(fā)現(xiàn)第一個哺乳動物的組蛋白去乙酰化酶；Sun等[6]純化和鑒定了雞的HDAC1蛋白；Ye等[7]、柳小春等[8]證明HDAC1基因與豬的主要分割性狀及生長、胴體性狀相關(guān)。近幾年，有關(guān)藏羚羊[9]、鴨[10]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[11]中HDAC1基因結(jié)構(gòu)和功能研究也相繼被報道，而在海洋貝類中未見相關(guān)報道。

泥蚶(Tegillarcagranosa)是一種廣溫廣鹽性灘涂貝類，具有獨特的口感風(fēng)味和較高的營養(yǎng)價值、經(jīng)濟價值，深受江、浙、閩等地沿海居民喜愛。目前，關(guān)于泥蚶功能基因的研究主要集中在免疫相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析上，如小熱休克蛋白基因[12]、血紅蛋白基因[13]、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子3基因[14]等，而與生長、繁殖等主要經(jīng)濟性狀相關(guān)基因報道較少，已見泥蚶生長因子受體結(jié)合蛋白2基因[15]與Smad1/5基因[16]的克隆及時空表達(dá)研究。本研究首次克隆獲得泥蚶Tg-HDAC1基因的cDNA全長和所有內(nèi)含子序列，并用qRT-PCR技術(shù)對其在成貝不同組織、不同發(fā)育時期的表達(dá)進行分析，旨在探索HDAC1基因在生長、發(fā)育過程中的調(diào)控作用，為開展泥蚶分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

2材料與方法

2.1實驗材料

泥蚶成貝采自寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司，活體解剖取血液、內(nèi)臟團、外套膜、鰓、足和閉殼肌6個組織，液氮速凍后分裝入凍存管中，置于-80℃超低溫冰箱中保存，用于總RNA、DNA提取。通過親貝催產(chǎn)、人工授精和早期培育，獲得2-4細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、擔(dān)輪幼蟲期、D形幼蟲期、殼頂幼蟲期、眼點幼蟲期及稚貝期9個不同發(fā)育時期的樣品，液氮速凍后存于-80℃超低溫冰箱中。

2.2實驗方法

2.2.1Tg-HDAC1基因cDNA全長克隆

用Trizol法提取泥蚶閉殼肌總RNA，NanoVue微量紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度，1.0%瓊脂糖凝膠檢測RNA質(zhì)量。按照SMARTTMRACE cDNA Amplication Kit(Clontech)說明反轉(zhuǎn)錄合成RACE cDNA第一條鏈。根據(jù)本實驗室泥蚶454轉(zhuǎn)錄組文庫注釋信息，初步篩查到Tg-HDAC1基因cDNA部分序列，分別設(shè)計5′-RACE和3′-RACE特異性引物GSP1和GSP2(表1)，根據(jù)Advantage 2 Polymerase Kit說明，采用touch down PCR，擴增Tg-HDAC1基因的cDNA全長。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測、割膠純化，純化產(chǎn)物連接到pMD18-T(TaKaRa)載體，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(TaKaRa)中，經(jīng)菌液PCR鑒定后陽性克隆送華大基因公司測序。

2.2.2Tg-HDAC1基因序列及進化分析

測序結(jié)果利用NCBI的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對Tg-HDAC1基因編碼的氨基酸進行功能域與結(jié)構(gòu)域的預(yù)測，用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)程序搜索開放閱讀框；DNAMAN 軟件進行氨基酸序列、蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測分析；采用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測該蛋白信號肽區(qū)域；NetPhos2.0工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測氨基酸磷酸化位點；ExPASy ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)在線分析蛋白質(zhì)疏水性；蛋白質(zhì)跨膜區(qū)用TMHMM 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進行預(yù)測分析；Swiss Model軟件(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)進行蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預(yù)測；據(jù)NCBI上公布的其他物種HDAC1的氨基酸序列，利用ClustalW進行氨基酸多序列比對；用MEGA 6.0軟件中NJ(neighbor joining)法做進化分析。

2.2.3Tg-HDAC1基因內(nèi)含子的克隆

用酚-氯仿法[17]提取6顆泥蚶閉殼肌基因組DNA，據(jù)已獲得Tg-HDAC1基因的mRNA序列，設(shè)計特異性的引物(表1)利用Mastercycler ProS 梯 度 PCR 儀進行普通PCR擴增。PCR反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 45 s，Tm45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。通過PCR產(chǎn)物割膠純化、克隆測序獲取該基因內(nèi)含子的核苷酸序列。

2.2.4Tg-HDAC1基因 mRNA在泥蚶不同組織、不同發(fā)育時期的表達(dá)分析

用Trizol法提取泥蚶6個組織(血液、內(nèi)臟團、外套膜、鰓、斧足和閉殼肌，n=3)和9個發(fā)育時期樣品(成熟卵子、2-4細(xì)胞、囊胚、原腸胚、擔(dān)輪幼蟲、D形幼蟲、殼頂幼蟲、眼點幼蟲及稚貝，n>500)總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)cDNA 全長序列及內(nèi)含子的位置設(shè)計引物REAL-HDAC1-F和REAL-HDAC1-R(表1)，以18sRNA 基因為內(nèi)參，利用ABI 7500Fast進行Tg-HDAC1基因在成貝不同組織定量表達(dá)，每個樣本取3個平行檢測。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 20 s；95℃ 3 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)。采用相對值2-ΔΔCt法對該基因的相對表達(dá)量進行分析，SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

3結(jié)果

3.1Tg-HDAC1基因cDNA序列分析

Tg-HDAC1基因cDNA序列全長為2 275 bp(Genbank登錄號：KP250871 )，其中5′非編碼區(qū)(5′-UTR)26 bp，開放閱讀框(ORF)1 587 bp，編碼528個氨基酸，3′非編碼區(qū)(3′-UTR)662 bp。3′-UTR存在1個終止密碼子TAA，加尾信號AATAAA及polyA尾巴，其中加尾信號AATAAA與polyA尾巴相距246 bp(圖1)。

表1　實驗所用引物匯總

圖1　Tg-HDAC1基因的cDNA全長序列與推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1　The full-length cDNA sequence of HDAC1 gene and deduced amino acid sequence in T.granosa方框區(qū)域分別代表基因的起始密碼子、終止密碼子與加尾信號，*代表蛋白翻譯結(jié)束，下劃線部分表示polyA尾巴，灰色陰影部分為HDAC1超家族保守區(qū)域，代表金屬Zn結(jié)合位點The letters boxes are the start codon， the stop codon and the polyadenylation signal sequence. The* represents the end of the protein translation，and the underlined part is polyA. The conserved domain is shaded gray， is Zn binding site

圖2　Tg-HDAC1蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.2　The prediction of protein tertiary structure of Tg-HDAC1α-螺旋為深紅色；β-折疊為黃色；轉(zhuǎn)角為淡藍(lán)色；其他殘基的顏色為白色Red represents the alpha-helix， yellow represents the beta-sheet， blue represents the turn， other residues is white

DNAMAN軟件分析顯示，Tg-HDAC1蛋白分子量為59.91 kDa，理論等電點pI=5.65；在線軟件SignalP 4.1、TMHMM分析發(fā)現(xiàn)Tg-HDAC1基因編碼的蛋白質(zhì)無明顯的信號肽區(qū)域和跨膜區(qū)域；ExPASy ProtScale預(yù)測顯示組成該蛋白的氨基酸中親水性氨基酸占主導(dǎo)，表現(xiàn)為親水性；軟件預(yù)測表明，Tg-HDAC1蛋白包含絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸磷酸化位點個數(shù)分別為25、10、11；NCBI Blast分析序列的功能域和結(jié)構(gòu)域顯示該蛋白包含HDAC保守結(jié)構(gòu)域，并在保守序列含有金屬Zn結(jié)合位點。

用Swiss Model軟件預(yù)測表明，Tg-HDAC1蛋白由17個α-螺旋和17個β-折疊片組成，β-折疊片基本平行排列(圖2)，此排列方式或許對維持蛋白的穩(wěn)定性具有作用。

3.2Tg-HDAC1基因與其他物種的同源比對及系統(tǒng)進化分析

氨基酸序列比對結(jié)果表明，Tg-HDAC1蛋白序列與斑馬魚、雞、小鼠等脊椎動物同源性都在80%以上，表現(xiàn)出高度的保守性(圖3)。用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，泥蚶和無脊椎動物紫色球海膽親緣關(guān)系最近，其次為頭索動物門文昌魚。人、獼猴、牛、藏羚羊及鼠高等動物聚在一起，再與鳥綱的雞、兩棲綱的非洲爪蟾、魚綱的斑馬魚形成脊椎動物的一大分支(圖4)。

圖3　不同物種HDAC1氨基酸序列比對Fig.3　Amino acid sequence alignment of HDAC1 between T. granosa and other speciesTg：泥蚶；Xl：非洲爪蟾；Sp：紫色球海膽；Mm：小鼠；Bt：牛；Hs：人；Ph：藏羚羊；Gg：雞；Dr：斑馬魚；Ma：獼猴；Rn：褐家鼠；Bf：文昌魚Tg：Tegillarca granosa；Xl：Xenopus laevis；Sp：Strongylocentrotus purpuratus；Mm：Mus musculus；Bt：Bos taurus；Hs：Homo sapiens；Ph：Pantholops hodgsonii；Gg：Gallus gallus；Dr：Danio rerio；Ma：Macaca mulatta；Rn：Rattus norvegicus；Bf： Branchiostoma floridae

HDAC1物種GenBank登錄號HDAC1物種GenBank登錄號泥蚶(Tegillarcagranosa)KP250871小鼠(Musmusculus)AAI08372.1非洲爪蟾(Xenopuslaevis)NP_001079396.1牛(Bostaurus)NP_001032521.1紫色球海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)NP_999711.1人(Homosapiens)CAG46518.1青島文昌魚(Branchiostomafloridae)XP_002594632.1斑馬魚(Daniorerio)AAI65208.1褐家鼠(Rattusnorvegicus)NP_001020580.1雞(Gallusgallus)AAB99850.1藏羚羊(Pantholopshodgsonii)NP_001273520.1獼猴(Macacamulatta)AFJ71458.1

圖4　利用MEGA6.0 NJ法構(gòu)建的HDAC1系統(tǒng)進化樹Fig.4　Phylogenetic tree of HDAC1 amino acid sequences by NJ method using MEGA6.0 software

圖5　泥蚶不同組織中Tg-HDAC1基因表達(dá)差異性分析(n=3)Fig.5　Analysis of expression difference of Tg-HDAC1 gene in different tissues of T. granosa (n=3)1.內(nèi)臟團；2.外套膜；3.閉殼肌；4.血液；5.斧足； 6.鰓；**代表差異極顯著(P<0.01)1. Visceral mass; 2.mantle; 3.adductor muscle; 4.blood 5.foot ; 6.gill；** represents very significant differences(P<0.01)

圖6　Tg-HDAC1基因不同發(fā)育時期表達(dá)差異性分析Fig.6　Analysis of expression difference of Tg-HDAC1 gene in different developmental stages of T. granosa1.成熟卵子；2.2-4細(xì)胞；3.囊胚；4.原腸胚；5.擔(dān)輪幼蟲；6.D形幼蟲；7.殼頂幼蟲；8.眼點幼蟲；9.稚貝；不同字母代表差異顯著(P<0.05)1. Mature eggs; 2. 2-4 cells; 3.blastula; 4. Gastrulae; 5. trochophore; 6. D-shaped larva;7. umbo larvae; 8. eyebot larva;9. juvenile clams， different letters represent significant differences， P<0.05

圖7　Tg-HDAC1基因結(jié)構(gòu)圖Fig.7　Genomic DNA structure of Tg-HDAC1 gene外顯子、內(nèi)含子分別用方框和線條標(biāo)示，E代表外顯子，I代表內(nèi)含子。方框上的數(shù)字代表每個外顯子的堿基數(shù)，線條下方的數(shù)字代表內(nèi)含子的堿基數(shù)The box and the lines represent the exons and introns respectively.The letter E and I indicates the exon and introns. The number on the box and below the line represent the size of each exon and introns

3.3泥蚶不同組織與不同發(fā)育時期Tg-HDAC1表達(dá)差異性分析

用qRT-PCR技術(shù)檢測了Tg-HDAC1基因在泥蚶6個組織的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Tg-HDAC1基因在各個組織中均有不同程度的表達(dá)，其中斧足中表達(dá)量相對最高，與其余各組織間存在極顯著性差異(P<0.01)(圖5)。

Tg-HDAC1基因在泥蚶的9個發(fā)育時期均有不同程度的表達(dá)，從成熟卵子呈逐步升高的趨勢，而在原腸胚和擔(dān)輪幼蟲時期的表達(dá)量最高，顯著高于其他發(fā)育時期(P<0.05)，在眼點幼蟲和稚貝時期表達(dá)量顯著性降低(P<0.05)(圖6)。

3.4Tg-HDAC1基因內(nèi)含子序列分析

克隆得到Tg-HDAC1基因的全部內(nèi)含子序列，且外顯子與內(nèi)含子結(jié)合處序列遵循-AT/GT-原則，即都屬于GT-AG-內(nèi)含子。Tg-HDAC1基因共有14個外顯子，13個內(nèi)含子，序列總長度為10 499 bp。其中9號外顯子最長為168 bp，13號外顯子最短，為32 bp，其余外顯子長度在72～165 bp之間；1號內(nèi)含子最長，為1 293 bp，12號內(nèi)含子最短，為193 bp，其余內(nèi)含子長度在203～926 bp之間(圖7)。

4討論

組蛋白乙酰化主要由組蛋白乙酰化酶(HATs)與組蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化完成，與基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)[18]。HDACs有4大類18個亞型，目前研究主要集中在HDAC1[19]。本實驗成功獲得Tg-HDAC1 基因的cDNA全長序列，其編碼的氨基酸序列與雞、小鼠等脊椎動物的HDAC1蛋白具有高度同源性，聚類結(jié)果也表明，泥蚶與無脊椎動物如紫色球海膽、文昌魚親緣關(guān)系較近，與脊椎動物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與系統(tǒng)形態(tài)學(xué)上的分類基本一致。NCBI Blastx分析顯示，Tg-HDAC1 蛋白包含HDAC保守結(jié)構(gòu)域，推測該區(qū)域是HDAC1調(diào)控組蛋白去乙酰化程度的關(guān)鍵區(qū)域[20]。

內(nèi)含子是指斷裂基因中的非編碼區(qū)序列，在編碼蛋白質(zhì)前被去除。一直以來，研究者們對基因功能的研究主要集中在編碼序列，而對內(nèi)含子序列的研究較少。高通量技術(shù)的出現(xiàn)，使得許多物種的基因組序列逐漸呈現(xiàn)，內(nèi)含子序列占基因組序列的絕大部分，且與許多重要功能相關(guān)，因此發(fā)現(xiàn)和深入挖掘其與基因功能的相關(guān)性就顯得非常必要。近年來，已開展了一些動物內(nèi)含子與性狀的相關(guān)性研究，如在豬的脂肪性脂肪酸結(jié)合蛋白(A-FABP)基因內(nèi)含子1發(fā)現(xiàn)了與其肉質(zhì)性狀相關(guān)的SNP多態(tài)位點[21]；牛HDAC1基因內(nèi)含子10～11中存在SNP多態(tài)位點與其屠宰性狀相關(guān)[22]；鯰魚(Suckermouthcatfishes)生長激素基因內(nèi)含子在物種系統(tǒng)發(fā)育中具有重要作用[23]等。有關(guān)海洋貝類內(nèi)含子的研究也有報道，如包永波[24]搜索了海灣扇貝(Argopectenirradias)超氧化物歧化酶(SOD)基因部分內(nèi)含子區(qū)域的SNP位點；郭慧慧[25]克隆并分析了櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)轉(zhuǎn)化生長因子β家族基因中內(nèi)含子SNP位點與生長性狀的相關(guān)性；李璐[26]克隆并分析了合浦珠母貝(Pinctadamartensii)α-淀粉酶基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)特征。本研究成功克隆得到Tg-HDAC1 8 224 bp內(nèi)含子序列，序列分析表明，所獲得的內(nèi)含子核苷酸序列均符合“以GT開頭，以AG結(jié)尾”的規(guī)則，這是真核生物RNA正確剪切所必需的識別位點。在不同物種中，有些基因的內(nèi)含子數(shù)目是高度可變的，如淀粉酶基因在果蠅中沒有內(nèi)含子或數(shù)目極少，但在凡納對蝦(PenaeusvannameiBoone)中卻發(fā)現(xiàn)有9個內(nèi)含子[27]，這可能是在長期物種進化過程中形成的。HDAC1基因內(nèi)含子數(shù)目在不同物種中略有差異，如在人、猴和牛等脊椎動物中包含14個內(nèi)含子，在鼠、非洲爪蟾及斑馬魚等中卻發(fā)現(xiàn)有13個內(nèi)含子，而在泥蚶Tg-HDAC1基因中擴增出13個內(nèi)含子，均存在于開放閱讀框中，與其他物種差異不大。

HDAC1基因在早期胚胎發(fā)育中有重要的調(diào)節(jié)作用[1]，敲除該基因或使其碳末端發(fā)生突變都會導(dǎo)致小鼠早期胚胎發(fā)育異常[28]。HDAC1基因還參與牙鲆冠狀幼鰭、鰭條、腸道等多種器官的發(fā)育調(diào)控以及變態(tài)階段眼睛移動的過程[11]。在泥蚶中，檢測發(fā)現(xiàn)Tg-HDAC1基因在不同發(fā)育時期均有表達(dá)，而原腸胚、擔(dān)輪幼蟲期表達(dá)量顯著高于其他時期，這兩個時期是胚胎組織、器官形成的重要時期，細(xì)胞分裂快速，生命活動旺盛，可能需要更多的Tg-HDAC1基因來調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程。眼點幼蟲與稚貝時期各組織、器官構(gòu)建已基本完成，基因表達(dá)量較低。

有研究顯示，HDACs和HATs以重塑染色質(zhì)的

方式直接或間接地結(jié)合于MyoD或MEF2基因的調(diào)控序列，影響MyoD或MEF2及其下游基因的表達(dá)，進而調(diào)節(jié)肌肉的生肌過程[29]。Tg-HDAC1基因組織表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其在泥蚶斧足中表達(dá)量顯著地高于其他組織。斧足是泥蚶主要的運動器官[30]，Tg-HDAC1基因的高表達(dá)可能與其富含肌肉、生肌活動較為頻繁有關(guān)。另外，斧足占據(jù)泥蚶軟體部的很大部分，Tg-HDAC1基因的高表達(dá)推測其對軟體部生長具有重要調(diào)節(jié)作用，可作為泥蚶生長相關(guān)的重要候選基因。

參考文獻：

[1]王中偉. HDAC1基因在牛卵母細(xì)胞和早期克隆胚胎發(fā)育中的作用[D]. 長春: 吉林大學(xué)， 2011.

Wang Zhongwei. Function of HDAC1 gene during the development of bovine oocytes and cloned embryos[D]. Changchun: Jilin University， 2011.

[2]Dufourcq P， Victor M， Gay F， et al. Functional requirement for histone deacetylase 1 inCaenorhabditiselegansgonadogenesis[J]. Mol Cell Biol， 2002， 22(9): 3024-3034.

[3]Mannervik M， Levine M. The Rpd3 histone deacetylase is required for segmentation of theDrosophilaembryo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 1999， 96(12): 6797-6801.

[4]Nambiar R M， Henion P D. Sequential antagonism of early and late Wnt-signaling by zebrafishcolgatepromotes dorsal and anterior fates[J]. Dev Biol， 2004， 267(1): 165-180.

[5]Taunton J， Hassig C A， Schreiber S L. A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p[J]. Science， 1996， 272(5260): 408-411．

[6]Sun Jianming， Chen Houyu， Moniwa M， et al. Purification and characterization of chicken erythrocyte histone deacetylase 1[J]. Biochemistry， 1999， 38(18): 5939-5947．

[7]Ye X， Robinson J A B， Jiang Z， et al. Polymorphisms of histone deacetylase 1 and 3 genes and fatty acid binding protein 3 and 4 genes and their associations with economic traits in swine[C]//Proceedings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. Montpellier， France: Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)， 2002.

[8]柳小春， 肖調(diào)義， 何偉光， 等. 豬生長及胴體性狀3個相關(guān)基因座遺傳效應(yīng)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009， 42(2): 742-747.

Liu Xiaochun， Xiao Tiaoyi， He Weiguang， et al. Genetic effect of three loci related with growth and carcass traits in swine[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2009， 42(2): 742-747.

[9]劉芳， 格日力. 藏羚羊組蛋白去乙酰化酶1基因編碼區(qū)的克隆與序列分析[J]. 獸類學(xué)報， 2011， 31(4): 396-403.

Liu Fang， Ge Rili. Cloning and sequencing of HDAC1 coding cDNA sequence from Tibetan antelope (Pantholopshodgsonii)[J]. Acta Theriologica Sinica， 2011， 31(4): 396-403.

[10]何樺， 劉賀賀， 王浩瀚， 等. 鴨HDAC1基因編碼區(qū)的分子克隆及生物信息分析[J]. 中國畜牧雜志， 2013， 49(9): 6-10.

He Hua， Liu Hehe， Wang Haohan， et al. Cloning and bioinformatics analysis of HDAC1 gene encoding region of duck[J]. Chinese Journal of Animal Science， 2013， 49(9): 6-10.

[11]李慧， 徐義平， 鮑寶龍. 牙鲆胚后發(fā)育階段HDAC1基因的空間表達(dá)[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報， 2014， 23(5): 641-648.

Li Hui， Xu Yiping， Bao Baolong. Different expression pattern of HDAC1 before and during the process of metamorphosis inParalichthysolivaceus[J]. Journal of Shanghai Ocean University， 2014， 23(5): 641-648.

[12]Bao Yongbao， Wang Qing， Liu Haoming， et al. A small HSP gene of bloody clam (Tegillarcagranosa) involved in the immune response againstVibrioparahaemolyticusand lipopolysccharide[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2011， 30(2): 729-733.

[13]汪青， 林志華， 包永波， 等. 泥蚶(Tegillarcagranosa)血紅蛋白基因(Tg-HbIIA)克隆、分析及免疫表達(dá)研究[J]. 海洋與湖沼， 2012， 43(1): 88-94.

Wang Qing， Lin Zhihua， Bao Yongbo， et al. Clone and analysis of hemoblobin gene (Tg-HbIIA) and immune expression research inTegillarcagranosa[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 2012， 43(1): 88-94.

[14]李佩芬， 林志華， 包永波. 泥蚶基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子3基因的克隆及鎘免疫表達(dá)研究[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2015， 39(3): 336-344．

Li Peifen， Lin Zhihua， Bao Yongbo. A novel tissue inhibitor of metalloproteinase 3 in blood clamTegillarcagranose: molecular cloning and immune-related research of Cd[J]. Journal of Fisheries of China， 2015， 39(3): 336-344．

[15]董迎輝， 項翔， 姚韓韓， 等. 泥蚶(Tegillarcagranosa)生長因子受體結(jié)合蛋白2(GRB2)基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 海洋與湖沼， 2013， 44(4): 937-943．

Dong Yinghui， Xiang Xiang， Yao Hanhan， et al. Cloning and expression of GRB2 gene from the blood clamTegillarcagranosa[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica， 2013， 44(4): 937-943.

[16]錢雪駿， 董迎輝， 姚韓韓， 等. 泥蚶Smad1/5基因cDNA全長克隆及時空表達(dá)特征分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報， 2015， 39(9): 1302-1312.

Qian Xuejun， Dong Yinghui， Yao Hanhan， et al. Cloning and spatiotemporal expression analysis of Smad1/5 gene in the blood clamTegillarcagranosa[J]. Journal of Fisheries of China， 2015， 39(9): 1302-1312.

[17]Sambrook J， Russell D W. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001.

[18]Kouzarides T. Histone acetylases and deacetylases in cell proliferation[J]. Curr Opin Genet Dev， 1999， 9(1): 40-48．

[19]Witt O， Deubzer H E， Milde T， et al. HDAC family: what are the cancer relevant targets？[J]. Cancer Lett， 2009， 277(1): 8-21．

[20]Hoxha E， Lambers E， Xie Hehuang， et al. Histone deacetylase 1 deficiency impairs differentiation and electrophysiological properties of cardiomyocytes derived from induced pluripotent cells[J]. Stem Cells， 2012， 30(11): 2412-2422．

[21]Gao Yan， Zhang Yonghong， Zhang Shumin， et al. Association ofA-FABPgene polymorphism in intron 1 with meat quality traits in Junmu No. 1 white swine[J]. Gene， 2011， 487(2): 170-173．

[22]楊穎. HDAC1基因多態(tài)位點與肉牛部分經(jīng)濟性狀的相關(guān)性分析[D]. 南寧: 廣西大學(xué)， 2012.

Yang Ying. Study of the HDAC1 gene SNP and its correlation with partical economic traits in cattle[D]. Nanning: Guangxi University， 2012.

[23]Schmidt R C， Bart Jr H L， Nyingi D W， et al. Phylogeny of sucker mouth catfishes (Mochokidae:Chiloglanis) from Kenya: the utility of Growth Hormone introns in species level phylogenies[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2014， 79: 415-421.

[24]包永波. 海灣扇貝超氧化物歧化酶家族基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)和多態(tài)性分析[D]. 青島: 中國科學(xué)院海洋研究所， 2009.

Bao Yongbo. Superoxide dismutase multigene family in bay scallopArgopectenirradians: gene structures， expression and polymorphism[D]. Qingdao: The Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences， 2009.

[25]郭慧慧. 櫛孔扇貝TGF-β/Smad信號通路基因的克隆、表達(dá)分析及生長性狀相關(guān)SNP位點篩查[D]. 青島: 中國海洋大學(xué)， 2012.

Guo Huihui. TGF-β/Smad signaling pathway genes: molecular cloning， expression analysis and SNPs associated with growth traits in Zhikong scallop (Chlamysfarreri)[D]. Qingdao: Ocean University of China， 2012.

[26]李璐. 合浦珠母貝α-淀粉酶基因結(jié)構(gòu)、SNP篩選、生長關(guān)聯(lián)與生態(tài)響應(yīng)研究[D]. 上海: 上海海洋大學(xué)， 2013.

Li Lu. Genomic structure， SNP screening， growth association and ecological response of α-amylase gene in the pearl oysterPinctadafucata[D]. Shanghai: Shanghai Ocean University， 2013.

[27]Sellos D Y， Van Wormhoudt A. Structure of the of α-amylase genes in crustaceans and molluscs: evolution of the exon/intron organization[J]. Biologia， Bratislava， 2002， 57(S11): 191-196．

[28]Montgomery R L， Davis C A， Potthoff M J， et al. Histone deacetylases 1 and 2 redundantly regulate cardiac morphogenesis， growth， and contractility[J]. Genes & Development， 2007， 21(14): 1790-1802.

[29]McKinsey T A， Zhang Chunli， Olson E N. Control of muscle development by dueling HATs and HDACs[J]. Curr Opin Genet Dev， 2001， 11(5): 497-504．

[30]常亞青. 貝類增養(yǎng)殖學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2007.

Chang Yaqing. Mollusc Culture[M]. Beijing: China Agriculture Press， 2007.

收稿日期：2015-10-23；

修訂日期：2016-04-06。

基金項目：國家現(xiàn)代貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-48)；浙江省自然科學(xué)基金重點項目(LZ12C19001)； 浙江省重大科技專項(2012C12907-4)；國家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺項目(2015DKA30470)。

作者簡介：任付真(1988-)，女，山東省定陶縣人，主要從事海洋貝類分子遺傳研究。E-mail：renpiaoyu@126.com *通信作者：林志華(1965-)，研究員。E-mail:zhihua9988@126.com

中圖分類號:S917.4

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：0253-4193(2016)08-0073-10

cDNA， introns cloning and spatiotemporal expression analysis of HDAC1 gene in Tegillarca granosa

Ren Fuzhen1，2，Yao Hanhan2，Dong Yinghui2，Zhou Xiaolong1，Lin Zhihua2

(1.CollegeofFisheriesandLifeSciences，ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China;2.KeyLaboratoryofAquaticGermplasmResourceofZhejiang，CollegeofBiological&EnvironmentalSciences,ZhejiangWanliUniversity,Ningbo315100，China)

Abstract:As an important member of HDACs family， HDAC1 can regulate gene expresstion and play a crucial role in cell differentiation and early embryonic development. Tg-HDAC1 cDNA was cloned by SMART RACE technique and then the bioinformatics， expression analysis， and intron amplification of Tg-HDAC1 were carried out in Tegillarca granosa. The full length of Tg-HDAC1 cDNA was 2 275 bp， containing a complete 1 587 bp ORF encoding 528 amino acids. The homologous similarity between the blood clam and other species， such as Danio rerio， Gallus gallus， Mus musculus， was more than 80%， which indicate that HDAC1 is relatively conserved in the evolution. Thirteen introns of Tg-HDAC1 were amplified in ORF， which all of them follow the principle of GT-AG. The results of six tissue-specific expression by real time PCR showed that Tg-HDAC1 gene expressed in all tissues， and the expression of foot were significantly higher than other tissues(P<0.01)， which suggest that the gene play an important role in the course of foot growth. The relative expression in different stages revealed that the expression of Tg-HDAC1 gradually increased with the process of the development， and showed the highest in trochophore stage (P<0.05)．

Key words:Tegillarca granosa; HDAC1; gene cloning; intron; expression analysis

任付真，姚韓韓，董迎輝，等. 泥蚶HDAC1基因cDNA全長、內(nèi)含子克隆及時空表達(dá)特征分析[J].海洋學(xué)報，2016，38(8)：73—82， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.008

Ren Fuzhen，Yao Hanhan，Dong Yinghui， et al. cDNA， introns cloning and spatiotemporal expression analysis of HDAC1 gene inTegillarcagranosa[J]. Haiyang Xuebao，2016，38(8)：73—82， doi：10.3969/j.issn.0253-4193.2016.08.008