Mcl-1抑制劑UM I-77誘導胃癌細胞MGC-803凋亡的機制研究

朱雪萍，吳 萍，張林杰

Mcl-1抑制劑UM I-77誘導胃癌細胞MGC-803凋亡的機制研究

朱雪萍，吳 萍，張林杰

目的 探討髓樣細胞白血病-1（Mcl-1）分子選擇性抑制劑UMI-77誘導胃癌細胞MGC-803凋亡的機制。方法采用Annexin V/PI染色流式細胞術觀察不同濃度UMI-77作用后MGC-803細胞凋亡率；JC-1染色流式細胞術分析線粒體膜電位的改變；Western blot法檢測UMI-77作用后半胱天冬氨酸蛋白酶9（Caspase-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶3 （Caspase-3）和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的活化情況以及B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）、Bcl-2蛋白1亞型1（Bcl-XL）和Mcl-1蛋白的表達情況；轉染Mcl-1 siRNA特異性沉默Mcl-1基因，Western blot驗證基因沉默效果，Annexin V/PI染色流式細胞術檢測轉染對UMI-77誘導的細胞凋亡的影響。結果 UMI-77能誘導胃癌細胞MGC-803發生凋亡，隨著藥物濃度升高，細胞凋亡率逐漸增加；UMI-77作用后，線粒體膜電位下降；Caspase-9、Caspase-3和PARP在UMI-77處理24 h顯著活化（P＜0.05）；Bcl-2、Bcl-XL在UMI-77作用前后的蛋白表達水平沒有明顯改變，而Mcl-1在12 h起即明顯下調（P＜0.05）；與陰性對照比較，轉染Mcl-1 siRNA后MGC-803細胞中Mcl-1蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05），且轉染后再用UMI-77處理，細胞凋亡率降低（P＜0.05）。結論UMI-77可通過內源性凋亡途徑誘導胃癌細胞MGC-803發生凋亡，下調Mcl-1表達會阻止UMI-77誘導的凋亡。

胃癌；UMI-77；Mcl-1；小分子抑制劑；細胞凋亡

網絡出版時間：2016-3-8 8：29：01 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160308.0829.022.htm l

胃癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，化療是主要的治療方式，而化療藥物通常是通過誘導細胞凋亡來發揮效應的。凋亡途徑一般分為由細胞膜上的死亡受體介導的外源性途徑和由線粒體啟動的內源性途徑，其中B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）家族蛋白是調控內源性途徑的關鍵，包括促凋亡的蛋白Bax、Bak、Bad、Bid和Bim等以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-2蛋白1亞型1（Bcl-2-like protein 1 isoform 1，Bcl-XL）、髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）和Bcl-w等，促凋亡和抗凋亡蛋白之間的平衡決定了細胞對凋亡刺激的反應［1］。近些年來，人們從抗凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1入手，合成了許多小分子抑制劑，如ABT-737［2］、ABT-199等，其單獨使用或與化療藥物聯合時具有很好的抗腫瘤效果。UMI-77是2014年Abulwerdi et al［3］運用高通量篩選以及結構生物學方法鑒定出的一種小分子抑制劑，能選擇性地結合Mcl-1，阻止Mcl-1/Bax及Mcl-1/Bak的異二聚化，從而拮抗Mcl-1的功能，發揮抑制細胞生長及誘導凋亡作用。該研究將UMI-77應用于胃癌細胞，了解其誘導胃癌細胞凋亡的機制，為其進入臨床提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料 人胃癌細胞株MGC-803購自中國科學院上海細胞庫；UMI-77購自美國Selleck公司；RPMI 1640培養基和Opti-MEM低血清培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、FACSVerse流式細胞儀購自美國BD公司；線粒體膜電位檢測試劑盒購自北京泛博生物化學有限公司；兔抗人Bcl-XL單克隆抗體及半胱天冬氨酸蛋白酶9（cysteinyl aspartate specific proteinase 9，Caspase-9）多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；小鼠抗人半胱天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Caspase-3）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）及Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Mcl-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Lipofectamine 2000 Reagent購自美國Invitrogen公司；人Mcl-1 siRNA序列由上海吉瑪公司設計并合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養 MGC-803細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，5%CO2、37℃、飽和濕度條件下常規培養。

1.2.2Annexin V/PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡 將對數生長期的細胞按每孔1×105個接種于24孔板中，次日細胞融合達80%以上，分別用0、2.5、5、10、15、20μmol/L UMI-77處理，每組設3個復孔，24 h后分別收集各孔中細胞于流式管中，加300μl 1×Binding Buffer重懸，然后加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI，充分混勻，避光作用20 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，采用FlowJo 7.6軟件分析結果。

1.2.3JC-1染色流式細胞術檢測線粒體膜電位按1.2.2中接種細胞，分別用0、15、20μmol/LUMI-77處理，每組設3個復孔，24 h后分別收集各孔細胞，用0.5 m l RPMI 1640完全培養液重懸細胞，再加入0.5 ml JC-1染色工作液，顛倒混勻，37℃避光作用20 min，于每管加入300μl JC-1染色緩沖液（1×），立即上流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化，以線粒體膜電位阻斷劑CCCP（50μmol/L）處理 10 min的細胞為陽性對照，FlowJo 7.6軟件分析結果。

1.2.4Western blot法檢測蛋白表達情況 分別收集各孔（未轉染、轉染NC siRNA、轉染Mcl-1 siRNA）以及UMI-77（15μmol/L）處理0、6、12、24 h細胞。加適量RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃、14 000 r/min離心30 min后取上清液，獲得細胞總蛋白。用BCA法進行蛋白定量，然后加入等體積的2×上樣緩沖液，煮沸3 min使蛋白變性。各蛋白樣品取20μg進行SDS-PAGE凝膠電泳，隨后轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，然后加入各自的一抗4℃孵育過夜，次日用TBST洗3次，每次10 min。再加入相應二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。用ECL試劑盒顯色，天能全自動凝膠成像系統照相并分析結果。

1.2.5siRNA轉染 Mcl-1 siRNA上游引物：5′-GUGCCUUUGUGGCUAAACA-3′，下 游 引 物：3′-UGUUUAGCCACAAAGGCAC-5′。將細胞分別接種于6孔板和24孔板中（6孔板每孔2×105個細胞，24孔板每孔1×105個細胞），次日細胞融合達30% ～50%即進行轉染，分未轉染、轉染NC siRNA、轉染Mcl-1 siRNA，每組設3個復孔。轉染前1 h將各孔中液體更換為無血清Opti-MEM培養基，然后分別用Opti-MEM將適量siRNA與Lipofectamine2000稀釋，靜置20 min后混合，將 siRNA/Lipofectamine 2000混合物滴入相應孔中，置于培養箱中繼續培養，約4～6 h后更換為RPMI 1640培養基。6孔板細胞在轉染48 h后提取細胞總蛋白，Western blot法檢測轉染效率。24孔板中細胞在未轉染以及轉染Mcl-1 siRNA基礎上待細胞融合達80%～90%后再加入 UMI-77（15μmol/L）處理24 h，Annexin V/PI染色流式細胞術檢測細胞凋亡率。

1.3統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行分析，實驗數據以±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

2　結果

2.1UM I-77對MGC-803細胞凋亡的影響 AnnexinV-FITC/PI染色流式細胞術結果顯示，0、2.5、5、10、15、20μmol/L的UMI-77作用 MGC-803細胞24 h的凋亡率分別為（2.12±3.103）%、（6.28± 2.679）%、（17.96±3.977）%、（43.11±5.133）%、（50.97±4.819）%、（77.38±6.574）%，隨著藥物濃度的升高，細胞凋亡逐漸增加（F=464.036，P＜0.05），呈劑量依賴性。見圖1。

圖1　不同濃度UM I-77處理MGC-803細胞24 h的凋亡率A：0μmol/L；B：2.5μmol/L；C：5μmol/L；D：10μmol/L；E：15μmol/L；F：20μmol/L；與0μmol/L比較：*P＜0.05

圖2　UM I-77對　MGC-803細胞線粒體膜電位的影響A：0μmol/L；B：15μmol/L；C：20μmol/L

2.2UM I-77對MGC-803細胞線粒體膜電位的影響JC-1染色流式細胞術檢測結果顯示，正常情況下JC-1聚集在線粒體基質中形成聚合物，而0、15、20μmol/L的UMI-77處理后，細胞逐漸向右下方移動，即聚集在線粒體的JC-1聚合物減少，而單體形式的JC-1增加，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位降低。見圖2。

2.3UM I-77對MGC-803細胞Caspase-9、Caspase-3、PARP表達的影響 Western blot法檢測UMI-77（15μmol/L）處理后Caspase-9、Caspase-3、PARP活化情況，無活性的前體形式的Caspase-9、Caspase-3和PARP在UMII-77處理6、12 h未發生明顯改變，而在處理24 h顯著下降（F=139.446、71.385、130.880，P＜0.05），被裂解的有活性的cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3和cleaved-PARP也出現，說明UMI-77激活了Caspase依賴性的內源性凋亡途徑。見圖3。

2.4UM I-77對MGC-803細胞Bcl-2、Bcl-XL和M cl-1表達的影響 Western blot法檢測UMI-77（15 μmol/L）處理前后抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-1的表達情況，Bcl-2和Bcl-XL在凋亡過程中并沒有明顯的改變，而Mcl-1則在UMI-77處理后12 h顯著降低（F=1244.0，P＜0.05），說明Mcl-1的下調可能參與了UMI-77誘導的凋亡過程。見圖4。

2.5UM I-77對沉默M cl-1的MGC-803細胞凋亡的影響利用化學合成的針對Mcl-1基因的siRNA轉染MGC-803細胞，Western blot法檢測基因沉默效果，與未轉染和轉染NC siRNA比較，轉染Mcl-1 siRNA能明顯降低細胞中Mcl-1蛋白的表達水平，基因沉默效果好（F=850.571，P＜0.05）。Annexin V/PI染色流式細胞術檢測基因沉默對UMI-77（15 μmol/L）誘導凋亡的影響。細胞轉染Mcl-1 siRNA后再加UMI-77處理24 h的凋亡率為（21.38± 4.907）%，與UMI-77處理未轉染細胞24 h比較，差異有統計學意義（F=274.062，P＜0.05）。見圖5、6。

圖3　UM I-77處理細胞不同時間后Caspase-3、Caspase-9以及　PARP的表達情況1：0 h；2：6 h；3：12 h；4：24 h；與0 h比較：*P＜0.05

3　討論

Mcl-1是1993年發現的Bcl-2家族抗凋亡分子，半衰期非常短，在多種腫瘤組織中高表達［4-5］，在胃癌組織中的表達水平也顯著高于癌旁組織，與胃癌細胞的生物學功能密切相關［6-7］，而且抑制Mcl-1表達能有效誘導腫瘤細胞凋亡［8］。Mcl-1在結構和功能上與Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡成員相似，但在凋亡細胞中的表達水平存在差異，如在多種腫瘤細胞中伴隨凋亡的加重，Mcl-1表達下調［8-10］；采用RNA干擾技術下調Mcl-1基因表達后可致使腫瘤細胞凋亡增加［9-10］。這些研究表明Mcl-1在腫瘤細胞凋亡調控中起重要作用，提示Mcl-1可能是腫瘤治療的一個重要靶點。

圖4　抗凋亡的Bcl-2家族蛋白在UM I-77處理細胞不同時間后蛋白的表達情況1：0 h；2：6 h；3：12 h；4：24 h；與0 h比較：*P＜0.05

圖5　W estern blot法檢測轉染　M cl-1siRNA的基因沉默效果1：未轉染；2：轉染NC siRNA；3：轉染Mcl-1 siRNA；與未轉染比較：*P＜0.05

圖6　UM I-77對沉默　M cl-1的MGC-803細胞凋亡的影響1：未轉染；2：未轉染　+UMI-77 15μmol/L；3：Mcl-1 siRNA+ UMI-77 15μmol/L；與未轉染　+UMI-77 15μmol/L比較：*P＜0.05

近年來，針對抗凋亡蛋白的抑制劑不斷涌現，其中最重要的是BH3類似物，都是一些類似BH3-only蛋白的小分子，如ABT-263［11］、AT-101［12］、ABT-737等，通過結合到Bcl-2家族抗凋亡（促生存）成員上發揮抑制作用。這些小分子抑制劑對細胞的滲透性好，相對于傳統的細胞毒性藥物更容易被細胞吸收［13］，在抑制蛋白作用的同時發揮抗腫瘤作用。目前研究的最為清楚的是ABT-737，其以高親和力與Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-w結合，抑制這些蛋白的功能，并釋放Bax和Bak，通過內源性途徑激發細胞凋亡［2］。ABT-737在多種腫瘤中單用或者與其他化療藥物聯用時有非常好的效果。但是，高表達Mcl-1的細胞卻對ABT-737抵抗［14］，如果能下調、去穩定或者滅活Mcl-1則可以增加該細胞對ABT-737的敏感性，提示Mcl-1可能是一個較Bcl-2、Bcl-XL更為重要的作用靶點。UMI-77除了有上述小分子抑制的特點以外，更表現出對Mcl-1的高選擇性和高親和性，而且UMI-77作用于胰腺癌可以抑制細胞增殖誘導細胞凋亡，其抑制作用與Mcl-1高表達有關［3］。

本實驗采用不同濃度UMI-77處理MGC-803細胞顯示細胞對UMI-77較為敏感，濃度在10μmol/L以上時24 h內有一半以上的細胞死亡，且大多數死亡的細胞表現為Annexin V（+）/PI（-），即凋亡細胞的特征性改變。在該凋亡過程中亦檢測出線粒體膜電位降低，說明線粒體可能參與其中。此外Caspase-9、Caspase-3活化和PARP裂解，也表明UMI-77誘導的是Caspase依賴性的內源性凋亡。本實驗顯示Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL在UMI-77處理前后并沒有發生改變，而Mcl-1則在藥物處理12 h起即顯著下調，這說明Mcl-1在UMI-77誘導的細胞凋亡中起重要作用。為進一步證實Mcl-1在UMI-77誘導細胞凋亡中的作用，采用Mcl-1 siRNA轉染方法沉默Mcl-1基因，在轉染后給予UMI-77處理，細胞凋亡率降低，進一步說明Mcl-1 在UMI-77誘導MGC-803細胞凋亡中起重要作用，Mcl-1基因沉默后 UMI-77沒有可結合作用的靶點而喪失了其誘導凋亡的功能。

綜上所述，本實驗顯示Mcl-1的小分子選擇性抑制劑UMI-77可誘導MGC-803細胞發生凋亡，該凋亡是通過線粒體介導的內源性凋亡途徑，而且UMI-77誘導的細胞凋亡可能部分是通過下調Mcl-1表達實現。Mcl-1蛋白小分子抑制劑具有廣泛的研究前景，對其作用機制進行深入研究并設計出高特異性、高親和力的小分子抑制劑將會為抗腫瘤治療提供更多選擇。

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Mechanism of apoptosis induced by Mcl-1 inhibitor UM I-77 on gastric cancer MGC-803 cells

Zhu Xueping，Wu Ping，Zhang Linjie
（Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To investigate themechanism of apoptosis induced by UMI-77，a novel selective inhibitor of Mcl-1，in gastric cancer MGC-803 cells.Methods MGC-803 cells were treated with UMI-77 in different concentrations for 24 h，apoptotic rates were determined by Annexin V/PImethod using flow cytometry.Mitochondrial membrane potentialwas determined by JC-1 staining on a flow cytometer.The activation of Caspase-9，Caspase-3 and cleavage of PARPwere measured by Western blot analysis.The protein level of Bcl-2，Bcl-XLand Mcl-1 was monitored by Western blotaswell.Chemically synthesized Mcl-1 siRNA was transfected into MGC-803 cells usingLipofectamine 2000 Reagent.The efficacy of gene silencing was confirmed by Western blotanalysis，and opoptotic rates before and after transfection wasmeasured by flow cytometry using Annexin V/PIstaining.Results UMI-77 was effective in induction of apoptosis in gastric cancerMGC-803 cells，apoptotic rateswere increased in a dose-dependentmanner.Mitochondrialmembrane potentialwas collapsed after UMI-77 treatment.Activation of Caspase-9，Caspase-3 and cleavage of PARP occurred at24 h（P＜0.05）.The expression level of Bcl-2 and Bcl-XLwere not altered after exposure to UMI-77，while Mcl-1 was down-regulated after 12 h（P＜0.05）.Transfection with Mcl-1 siRNA successfully decreased the expression level of Mcl-1 in MGC-803 cells（P＜0.05）and blocked apoptosis induced by UMI-77（P＜0.05）.Conclusion UMI-77 induces apoptosis through activation of the intrinsic pathway in gastric cancer MGC-803 cells，and knocking down Mcl-1 expression abrogates apoptosis by UMI-77.

gastric cancer；UMI-77；Mcl-1；smallmolecule inhibitor；apoptosis

R 735.2

A

1000-1492（2016）04-0506-06

2016-01-18接收

安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014A113）

安徽醫科大學免疫學教研室，合肥230032

朱雪萍，女，碩士研究生；

張林杰，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：zlj33@ahmu.edu.cn