異補骨脂素對氧化損傷的HLEC線粒體超微結構的影響

馮春燕，陳　　勝，胡艷紅，柯發杰，胡　　俊，黃秀榕，祁明信（.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003；.福建中醫藥大學病理生理研究中心，福建 福州 350）

異補骨脂素對氧化損傷的HLEC線粒體超微結構的影響

馮春燕1，陳勝1，胡艷紅1，柯發杰1，胡俊1，黃秀榕2，祁明信1
（1.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003；
2.福建中醫藥大學病理生理研究中心，福建 福州 350122）

目的觀察異補骨脂素對氧化損傷的HLEC線粒體超微結構的影響。方法實驗分正常對照組、H2O2組、E2組、ISR組，密度梯度離心法分離出HLEC線粒體，透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結構。結果正常對照組線粒體雙層膜結構完整，嵴結構完整，線粒體幾乎未受損傷；H2O2組線粒體雙層膜結構不完整，嵴結構斷裂消失，線粒體受損傷；E2組、ISR組線粒體雙層膜結構稍完整，嵴結構斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好。結論異補骨脂素對H2O2誘導氧化損傷的HLEC線粒體超微結構有保護作用。

異補骨脂素；氧化損傷；人晶狀體上皮細胞；線粒體

異補骨脂素（isopsoralen，ISR）是從補骨脂中提取的有效單體，我們課題組前期研究［1-4］發現ISR和雌二醇（β-Estradiol，E2）一樣具有雌激素作用，能夠增強抗氧化能力，提高人晶狀體上皮細胞（human lens epithelia cell，HLEC）內抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-px）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性；提高 HLEC內 SOD mRNA、GSH-px mRNA、CAT mRNA的表達，減輕HLEC氧化損傷，對H2O2誘導氧化損傷的HLEC發揮保護作用。本實驗進一步分離HLEC線粒體，用透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結構，探討ISR保護氧化損傷的HLEC亞細胞水平的形態結構變化。

1材料與方法

1.1材料3%戊二醛、1.5%多聚甲醛、0.1mol/L磷酸緩沖液、1%鋨酸亞鐵-1.5%氰化鉀混合液、醋酸鈾、檸檬酸鉛、MTT干粉（美國Sigma公司）；Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells（鷺隆生物科技有限公司）；異補骨脂素（中國藥品生物制品檢定所，純度99.5%）；E2（美國Sigma公司，純度97%）；二甲基亞砜（美國Amresco公司）；乙二胺四乙酸（美國Augus公司）；胰蛋白酶、DMEM培養基干粉（美國Gibco公司）；新生小牛血清 （奧地利Paa公司），H-7650電子顯微鏡（日本日立公司）；UC-6超薄切片機（美國LaiCa公司）；常溫離心機、低溫離心機（德國Heraeus Inc.公司）；-80℃低溫冰箱（英國New Brunswick Scientific Inc.公司）；IMT-413倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）、CO2培養箱（美國Forma公司）；超凈工作臺（江蘇SW-CJ-IF）。

1.2HLEC培養及傳代采用永生化人晶狀體上皮細胞系HLE-B3。取出凍存管中的HLE-B3立即放入37℃水中，將溶解的細胞懸液用10倍體積以上的培養液進行稀釋，離心，去上清，反復洗滌3次。以5×105個/mL接種于培養瓶中，37℃、5%CO2培養箱培養。待細胞生長融合后，進行傳代培養用于實驗。

1.3實驗分組① 正常組：HLEC加 DMEM培養液；② H2O2組：正常組加H2O2（終濃度300 μmol/ L）；③ E2組：H2O2組加E2（終濃度10-2μmol/L）；④ISR組：H2O2組加ISR（終濃度10 μmol/L）。

1.4細胞線粒體分離①收集2×107細胞于2 mL微量離心管，離心850×g，2 min，棄上清；② 加800 μL線粒體分離試劑A于離心管，以中等速度漩渦5 s，冰上孵育2 min；③ 將細胞懸液轉于冰冷的杜恩斯組織研磨器，充分勻漿細胞；④ 將勻漿液移到原離心管中，加800 μL線粒體分離試劑C，200 μL線粒體分離試劑A，混勻，離心700×g，10 min，4℃；⑤ 轉上清液于一新離心管，離心3 000× g，15 min，4℃；⑥轉上清液于一新離心管，加500 μL線粒體分離試劑C，離心12 000×g，5 min，4℃棄上清，所得沉淀即為線粒體。

1.5透射電鏡觀察HLEC線粒體超微結構① 前固定：分離出的HLEC線粒體以3%戊二醛-1.5%多聚甲醛混合液-0.1M PBS（pH 7.2）4℃過夜；② 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；③后固定：1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀4℃ 1.5 h；④ 漂洗：0.1M PBS（pH 7.2）3次；⑤ 脫水：50%酒精10 min→70%酒精飽和醋酸鈾染液4℃過夜→90%酒精10 min→90%酒精-丙酮10 min→90%丙酮10 min→無水丙酮10 min×3次；⑥ 浸透：無水丙酮+環氧樹脂618包埋劑（1∶1）1.5 h，純618包埋劑 35℃3 h；⑦ 包埋、聚合：35℃12 h、45℃ 12 h、60℃ 3 d；⑧切片、染色：超薄切片機切70～80 nm的超薄切片；經醋酸鈾、檸檬酸鉛分別染色5 min，并蒸餾水水洗；⑨ 透射電鏡下觀察并攝片。

2結果

2.1線粒體分離純化質量鑒定各組HLEC線粒體電鏡觀察顯示：線粒體聚集，其它細胞結構基本未見，說明線粒體分離純化良好。

2.2ISR對氧化損傷的HLEC內線粒體超微結構的影響① 正常對照組：線粒體雙層膜結構完整，嵴結構完整，線粒體幾乎未受損傷，見圖1。②H2O2組：線粒體雙層膜結構不完整，嵴結構斷裂消失，線粒體受損傷，見圖2。③E2組：線粒體雙層膜結構稍完整，嵴結構斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好，見圖3。④ ISR組：線粒體雙層膜結構稍完整，嵴結構斷裂，線粒體受損傷，但較H2O2組情況好，見圖4。

3討論

3.1文獻［5］表明，白內障的發病率呈男女性別差異，女性高于男性，且絕經后表現更為明顯。Krishnaiah等［6］發現絕經后接受激素替代治療的女性白內障患病率明顯低于未使用者及同齡男性，激素替代治療對皮質性、核性、后囊下性白內障有保護作用［7］。研究發現白內障的發生與缺乏雌激素的保護有關［8］，雌激素能夠減輕晶狀體氧化損傷程度［9-10］，抑制HLEC凋亡，在白內障的發生發展過程中起一定的作用。

3.2ISR是從補骨脂中提取的有效單體，我們前期研究發現ISR和E2發揮相同的作用，具有雌激素樣活性，能夠增強抗氧化能力，提高HLEC內抗氧化酶SOD、GSH-px、CAT活性，提高HLEC內的SODmRNA、GSH-pxmRNA、CATmRNA的表達，減輕HLEC氧化損傷，從而對氧化損傷的HLEC發揮保護作用。線粒體是一種真核細胞中普遍存在的細胞器，是細胞內氧化磷酸化及形成ATP的主要場所，故有細胞“動力工廠”之稱。目前純化線粒體的方法主要是差速離心結合密度梯度離心。密度梯度介質一般采用Percoll密度梯度和蔗糖密度梯度，提取的線粒體都需要進行純度評價。純度評價一般從3個方面進行：形態學觀察、特異酶活性測定、特異抗體檢測，形態學觀察一般采用透射電鏡來進行。本實驗通過密度梯度離心法分離出HLEC線粒體，并通

過透射電鏡鑒定，發現各組線粒體聚集，其它細胞結構基本未見，分離純化良好。可見密度梯度離心法是分離出HLEC線粒體的有效方法。

3.3實驗結果示：正常對照組線粒體雙層膜結構完整，嵴結構完整，線粒體幾乎未受損傷。經H2O2誘導氧化損傷后，HLEC的線粒體形態發生改變，線粒體雙層膜結構不完整，嵴結構斷裂消失；E2在保護 H2O2誘導氧化損傷 HLEC的同時，也保護了HLEC線粒體的形態結構。ISR和E2一樣在保護H2O2誘導氧化損傷HLEC的同時，也保護了HLEC線粒體的形態結構，說明ISR對H2O2誘導氧化損傷的HLEC線粒體超微結構有保護作用。

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R776

B

1000-338X（2016）03-0018-02

2016-03-02

福建省自然科學基金資助課題（2014J05093），福建省創新課題（2014-CXB-21）

馮春燕（1979—），女，醫學博士，主治醫師，主要從事白內障的基礎與臨床研究。

祁明信（1945—），男，教授，主任醫師。E-mail：qihuang@ netease.com