復(fù)方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸的影響

朱燕珍，何才姑，黃玉梅，江 澍，錢長暉，蔣藝燕，鄭雪花，倪艷紅，陳小環(huán)，陳碧珍，賀建超，袁　　潔（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

復(fù)方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸的影響

朱燕珍，何才姑，黃玉梅，江 澍，錢長暉，蔣藝燕，鄭雪花，倪艷紅，陳小環(huán)，陳碧珍，賀建超，袁潔
（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

目的觀察海馬突觸在血管性癡呆發(fā)病機制中的作用及復(fù)方丹參滴丸對其影響。方法制備血管性癡呆大鼠模型，用復(fù)方丹參滴丸治療，電鏡下觀察海馬突觸結(jié)構(gòu)，western blot法測定海馬突觸蛋白Ⅰ的表達。結(jié)果復(fù)方丹參滴丸改善了血管性癡呆大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)，促進了血管性癡呆大鼠海馬突觸蛋白Ⅰ表達。結(jié)論復(fù)方丹參滴丸具有改善血管性癡呆大鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)和突觸蛋白Ⅰ表達的治療作用。

復(fù)方丹參滴丸；血管性癡呆；突觸；海馬；突觸蛋白Ⅰ

血管性癡呆（VaD）是指腦缺血缺氧引起腦組織損傷產(chǎn)生的以認(rèn)知功能障礙為主的臨床綜合征。近年隨著中國人口的老年化，血管性癡呆的患病率和發(fā)病率呈指數(shù)上升。我們課題組以活血化瘀為治則，用復(fù)方丹參滴丸治療血管性癡呆大鼠，前期研究［1］我們證實復(fù)方丹參滴丸可改善血管性癡呆大鼠的認(rèn)知能力，促進海馬CA1區(qū)Bax、Caspase 3的表達。本實驗從突觸角度觀察復(fù)方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸及突觸蛋白Ⅰ的影響，為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1材料

1.1實驗動物清潔級SD大鼠24只，體質(zhì)量（412±35）g，由中國人民解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，證書號：SCXK-（軍）2007-004，合格證號：0014047。

1.2試劑復(fù)方丹參滴丸 （中國天津天士力制藥股份有限公司）；突觸蛋白Ⅰ兔抗單克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；GAPDH兔抗單克隆抗體 （美國Cell Signaling公司）

1.3儀器EM208透射電鏡（荷蘭飛利浦公司）。

2方法

2.1制備血管性癡呆大鼠模型用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備血管性癡呆大鼠，步驟如下：10%水合氯醛（3.5 mL/kg）經(jīng)腹膜腔麻醉大鼠，大鼠取仰臥位固定后，行頸前正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈以雙重絲線結(jié)扎，縫合切口。對照組大鼠手術(shù)步驟與模型組相似，但分離雙側(cè)頸總動脈后不結(jié)扎。將存活的模型組大鼠隨機分為VaD組和丹參組。

2.2給藥術(shù)后10 d，丹參組大鼠用復(fù)方丹參滴丸治療，用藥量3粒/kg。將復(fù)方丹參滴丸溶于1 mL的生理鹽水，灌胃，每日1次，治療20 d。對照組和VaD組在相同條件下給予生理鹽水灌胃。

2.3電鏡觀察海馬神經(jīng)突觸頸椎脫位后處死大鼠，開顱取腦，在冰盤上快速分離海馬組織。沿海馬CA1區(qū)縱軸方向切3條1 mm×3 mm×1 mm的海馬組織，將其置于3%戊二醛和1.5%多聚甲醛固定24 h，然后浸入1%鋨酸和1.5亞鐵氰化鉀固定1.5 h。以磷酸鹽緩沖液漂洗，組織與醋酸雙氧鈾染色過夜，用乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片，片厚80 nm，醋酸鈾染色5 min，檸檬酸鉛染色5 min。在EM208透射電鏡下觀察，攝影。

2.4Western blot法測定海馬突觸蛋白Ⅰ的表達

經(jīng)頸椎脫臼法處死大鼠，開顱取腦，冰上剝離海馬，稱體質(zhì)量，加入RIPA裂解液，終溶度為1Mm PMSF勻漿，4℃、14 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白溶度，加上樣緩沖液煮沸5 min。

參照文獻［2］進行Western blot實驗，其中第一抗體是突觸蛋白Ⅰ兔抗單克隆抗體和GAPDH兔抗單克隆抗體（稀釋比是1∶1000），第二抗體是辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（稀釋比是1∶4 000）。Western blot條帶掃描后用Phoretix ID軟件計算蛋白條帶的OD值并進行半定量分析，實驗中GAPDH是內(nèi)參。

3結(jié)果

3.1電鏡觀察海馬神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)對照組：突觸前膜、突觸后膜和突觸間隙明顯，突觸前成分有許多突觸小泡，突觸后成分上有密度高的致密物質(zhì)，見圖1－A。VaD組：突觸前、后成分腫脹明顯，突觸間隙模糊不清，突觸前成分內(nèi)的突觸小泡較少，突觸后成分內(nèi)的致密物質(zhì)變薄，見圖1－B。丹參組：與VaD組相比較突觸前、后成分表面變得清晰，突觸前成分內(nèi)的囊泡增多，突觸后成分內(nèi)致密物質(zhì)增厚，突觸前、后成分的腫脹減輕，見圖1－C。

3.2Western blot法測定海馬突觸蛋白Ⅰ的表達見表1和圖2。VaD組突觸蛋白Ⅰ表達的量明顯低于對照組（P＜0.05），丹參滴丸治療改善了VaD組大鼠突觸蛋白Ⅰ表達（P＜0.05）。

表1　3組大鼠海馬突觸蛋白Ⅰ的表達

4討論

4.1根據(jù)“腦髓純者靈，雜者鈍”。清靈之府因淤不能與臟器相接，腦失所養(yǎng)，遂致雜者鈍而發(fā)病。我們課題組認(rèn)為血瘀是血管性癡呆的重要發(fā)病因素，并以活血化淤為治療原則。復(fù)方丹參滴丸由丹參、三七、冰片組成，丹參具有擴張血管、改善循環(huán)、改變血液黏度的作用［1］。我們研究證實復(fù)方丹參滴丸明顯改善了血管性癡呆大鼠的認(rèn)知功能［2］。

4.2突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間傳遞信息的結(jié)構(gòu)，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)［3］。雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎可使大鼠海馬CA1區(qū)突觸數(shù)量減少和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙［4-6］。中藥針灸對海馬神經(jīng)元有一定的保護作用［7－8］。本研究結(jié)果顯示，VaD組海馬突觸前、后成分腫脹，間隙模糊不清，突觸前成分內(nèi)小泡減少，突觸后成分內(nèi)的致密物質(zhì)變??；丹參組海馬突觸結(jié)構(gòu)有明顯改變，提示突觸結(jié)構(gòu)和功能的改善在復(fù)方丹參滴丸治療血管性癡呆大鼠時發(fā)揮重要作用。

4.3突觸蛋白Ⅰ是選擇性位于突觸前成分內(nèi)的一種囊泡膜蛋白，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放和促進突觸發(fā)生的作用，與認(rèn)知功能密切相關(guān)［9］。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，VaD組突觸蛋白Ⅰ表達減少，復(fù)方丹參滴丸可促進血管性癡呆大鼠海馬突觸蛋白Ⅰ的表達，提示突觸蛋白Ⅰ的增加在復(fù)方丹參滴丸治療血管性癡呆時發(fā)揮重要作用。

［1］朱燕珍，葉小包，王晅，等.復(fù)方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬CA3區(qū)Bax、Caspase-3表達的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，21（3）：16-19.

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［8］陳蘭芳，張學(xué)君，林棟，等.電針長強穴對FMRI基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)PSD-95、CREB蛋白表達的影響［J］.康復(fù)學(xué)報，2015，25（4）：18-21，26.

［9］苑振云，姜相明，顧平，等.不同飼養(yǎng)環(huán)境對快速老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬突觸蛋白Ⅰ的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2013，33（17）：4196-4198.

R285.5

B

1000-338X（2016）03-0020-02

2016-03-02

福建省自然科學(xué)基金資助課題（2013J01331），國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目資助課題（201510393008）

朱燕珍（1976—），女，副教授，主要從事腦血管病的基礎(chǔ)研究。