復方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸的影響

朱燕珍，何才姑，黃玉梅，江 澍，錢長暉，蔣藝燕，鄭雪花，倪艷紅，陳小環，陳碧珍，賀建超，袁　　潔（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

復方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸的影響

朱燕珍，何才姑，黃玉梅，江 澍，錢長暉，蔣藝燕，鄭雪花，倪艷紅，陳小環，陳碧珍，賀建超，袁潔
（福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

目的觀察海馬突觸在血管性癡呆發病機制中的作用及復方丹參滴丸對其影響。方法制備血管性癡呆大鼠模型，用復方丹參滴丸治療，電鏡下觀察海馬突觸結構，western blot法測定海馬突觸蛋白Ⅰ的表達。結果復方丹參滴丸改善了血管性癡呆大鼠海馬突觸結構，促進了血管性癡呆大鼠海馬突觸蛋白Ⅰ表達。結論復方丹參滴丸具有改善血管性癡呆大鼠海馬突觸結構和突觸蛋白Ⅰ表達的治療作用。

復方丹參滴丸；血管性癡呆；突觸；海馬；突觸蛋白Ⅰ

血管性癡呆（VaD）是指腦缺血缺氧引起腦組織損傷產生的以認知功能障礙為主的臨床綜合征。近年隨著中國人口的老年化，血管性癡呆的患病率和發病率呈指數上升。我們課題組以活血化瘀為治則，用復方丹參滴丸治療血管性癡呆大鼠，前期研究［1］我們證實復方丹參滴丸可改善血管性癡呆大鼠的認知能力，促進海馬CA1區Bax、Caspase 3的表達。本實驗從突觸角度觀察復方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬突觸及突觸蛋白Ⅰ的影響，為臨床治療提供實驗依據。

1材料

1.1實驗動物清潔級SD大鼠24只，體質量（412±35）g，由中國人民解放軍醫學科學院實驗動物中心提供，證書號：SCXK-（軍）2007-004，合格證號：0014047。

1.2試劑復方丹參滴丸 （中國天津天士力制藥股份有限公司）；突觸蛋白Ⅰ兔抗單克隆抗體（美國Cell Signaling公司）；GAPDH兔抗單克隆抗體 （美國Cell Signaling公司）

1.3儀器EM208透射電鏡（荷蘭飛利浦公司）。

2方法

2.1制備血管性癡呆大鼠模型用雙側頸總動脈結扎法制備血管性癡呆大鼠，步驟如下：10%水合氯醛（3.5 mL/kg）經腹膜腔麻醉大鼠，大鼠取仰臥位固定后，行頸前正中切口，分離雙側頸總動脈以雙重絲線結扎，縫合切口。對照組大鼠手術步驟與模型組相似，但分離雙側頸總動脈后不結扎。將存活的模型組大鼠隨機分為VaD組和丹參組。

2.2給藥術后10 d，丹參組大鼠用復方丹參滴丸治療，用藥量3粒/kg。將復方丹參滴丸溶于1 mL的生理鹽水，灌胃，每日1次，治療20 d。對照組和VaD組在相同條件下給予生理鹽水灌胃。

2.3電鏡觀察海馬神經突觸頸椎脫位后處死大鼠，開顱取腦，在冰盤上快速分離海馬組織。沿海馬CA1區縱軸方向切3條1 mm×3 mm×1 mm的海馬組織，將其置于3%戊二醛和1.5%多聚甲醛固定24 h，然后浸入1%鋨酸和1.5亞鐵氰化鉀固定1.5 h。以磷酸鹽緩沖液漂洗，組織與醋酸雙氧鈾染色過夜，用乙醇和丙酮梯度脫水，環氧樹脂618包埋劑包埋。超薄切片，片厚80 nm，醋酸鈾染色5 min，檸檬酸鉛染色5 min。在EM208透射電鏡下觀察，攝影。

2.4Western blot法測定海馬突觸蛋白Ⅰ的表達

經頸椎脫臼法處死大鼠，開顱取腦，冰上剝離海馬，稱體質量，加入RIPA裂解液，終溶度為1Mm PMSF勻漿，4℃、14 000 r/min離心10 min，BCA法測定蛋白溶度，加上樣緩沖液煮沸5 min。

參照文獻［2］進行Western blot實驗，其中第一抗體是突觸蛋白Ⅰ兔抗單克隆抗體和GAPDH兔抗單克隆抗體（稀釋比是1∶1000），第二抗體是辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（稀釋比是1∶4 000）。Western blot條帶掃描后用Phoretix ID軟件計算蛋白條帶的OD值并進行半定量分析，實驗中GAPDH是內參。

3結果

3.1電鏡觀察海馬神經元突觸結構對照組：突觸前膜、突觸后膜和突觸間隙明顯，突觸前成分有許多突觸小泡，突觸后成分上有密度高的致密物質，見圖1－A。VaD組：突觸前、后成分腫脹明顯，突觸間隙模糊不清，突觸前成分內的突觸小泡較少，突觸后成分內的致密物質變薄，見圖1－B。丹參組：與VaD組相比較突觸前、后成分表面變得清晰，突觸前成分內的囊泡增多，突觸后成分內致密物質增厚，突觸前、后成分的腫脹減輕，見圖1－C。

3.2Western blot法測定海馬突觸蛋白Ⅰ的表達見表1和圖2。VaD組突觸蛋白Ⅰ表達的量明顯低于對照組（P＜0.05），丹參滴丸治療改善了VaD組大鼠突觸蛋白Ⅰ表達（P＜0.05）。

表1　3組大鼠海馬突觸蛋白Ⅰ的表達

4討論

4.1根據“腦髓純者靈，雜者鈍”。清靈之府因淤不能與臟器相接，腦失所養，遂致雜者鈍而發病。我們課題組認為血瘀是血管性癡呆的重要發病因素，并以活血化淤為治療原則。復方丹參滴丸由丹參、三七、冰片組成，丹參具有擴張血管、改善循環、改變血液黏度的作用［1］。我們研究證實復方丹參滴丸明顯改善了血管性癡呆大鼠的認知功能［2］。

4.2突觸是神經元與神經元之間傳遞信息的結構，與學習記憶密切相關［3］。雙側頸總動脈結扎可使大鼠海馬CA1區突觸數量減少和形態結構發生顯著變化，導致學習記憶功能障礙［4-6］。中藥針灸對海馬神經元有一定的保護作用［7－8］。本研究結果顯示，VaD組海馬突觸前、后成分腫脹，間隙模糊不清，突觸前成分內小泡減少，突觸后成分內的致密物質變薄；丹參組海馬突觸結構有明顯改變，提示突觸結構和功能的改善在復方丹參滴丸治療血管性癡呆大鼠時發揮重要作用。

4.3突觸蛋白Ⅰ是選擇性位于突觸前成分內的一種囊泡膜蛋白，具有調節神經遞質釋放和促進突觸發生的作用，與認知功能密切相關［9］。本研究結果顯示，與對照組比較，VaD組突觸蛋白Ⅰ表達減少，復方丹參滴丸可促進血管性癡呆大鼠海馬突觸蛋白Ⅰ的表達，提示突觸蛋白Ⅰ的增加在復方丹參滴丸治療血管性癡呆時發揮重要作用。

［1］朱燕珍，葉小包，王晅，等.復方丹參滴丸對血管性癡呆大鼠海馬CA3區Bax、Caspase-3表達的影響［J］.福建中醫藥大學學報，2011，21（3）：16-19.

［2］ZHU Y Z，ZENG Y J，WANG X，et al.Effect of electroacupuncture on the expression of mTOR and eIF4E in hippocampus of rats with vascular dementia［J］.Neurol Sci，2013，34（7）：1093-1097.

［3］古訓瑚，劉志強，徐麗君.突觸改變與阿爾茨海默病關系的研究進展［J］.廣東醫學，2015，36（3）：478-480.

［4］MEYER D，BONHOEFFER T，SCHEUSS V.Balance and stability of synaptic structures during synaptic plasticity［J］.Neuron，2014，82（2）：430-443.

［5］HUANG S Q.Effect of Erythropoietin on plasticity of nervous synapse in CA1 region of hippocampal of vascular dementia （VaD）rats［J］.African Journal of Pharmacy and Pharmacology，2012，6（15）：1111-1117.

［6］LI H Y，XIN X Y.Nitrogen dioxide（NO2）pollution as a potential risk factor for developing vascular dementia and its synaptic mechanisms［J］.Chemosphere，2013，92（1）：52-58.

［7］林羽，徐偉，張玉琴，等.栝樓桂枝顆粒抗缺血性腦卒中大鼠神經元及原代海馬神經元凋亡研究［J］.康復學報，2015，25 （1）：38-43.

［8］陳蘭芳，張學君，林棟，等.電針長強穴對FMRI基因敲除小鼠海馬CA1區PSD-95、CREB蛋白表達的影響［J］.康復學報，2015，25（4）：18-21，26.

［9］苑振云，姜相明，顧平，等.不同飼養環境對快速老化小鼠學習記憶能力和海馬突觸蛋白Ⅰ的影響［J］.中國老年學雜志，2013，33（17）：4196-4198.

R285.5

B

1000-338X（2016）03-0020-02

2016-03-02

福建省自然科學基金資助課題（2013J01331），國家級大學生創新創業訓練計劃項目資助課題（201510393008）

朱燕珍（1976—），女，副教授，主要從事腦血管病的基礎研究。