miR-93、miR-191、 miR-499在顱腦損傷患者血清中的表達及其臨床意義

周小龍 宋建榮 呂新文 張鵬

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miR-93、miR-191、 miR-499在顱腦損傷患者血清中的表達及其臨床意義

周小龍 宋建榮 呂新文 張鵬

目的 探討miR-93、miR-191、miR-499在創(chuàng)傷性腦損傷患者中的表達情況及其臨床意義。方法 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR)方法檢測本院2010年9月～2015年9月收治的96例創(chuàng)傷性腦損傷患者以及招募的49例健康者中miR-93、miR-191、miR-499的表達水平，分析其與腦損傷的損傷程度、臨床療效以及診斷價值的關系。 結果 miR-93、miR-191、miR-499在創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中的表達水平明顯高于對照組(P<0.05)；輕度，中度和重度三種不同程度腦損傷患者血清中miR-93、miR-191、miR-499水平都顯著性上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而且重度腦損傷患者血清中的miRNAs水平最高；治療后臨床療效好的患者血清中miR-93，miR-191，miR-499水平顯著低于臨床療效差的患者，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； miR-93，miR-191，miR-499三種miRNAs ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.952 0(95%CI，0.906 5～0.997 4；P<0.001)，0.874 6(95%CI，0.793 3～0.955 8；P<0.001)，0.780 7(95%CI，0.671 9～0.889 5；P<0.001)。 結論 miR-93，miR-191，miR-499 在創(chuàng)傷性腦損傷患者中高表達，可以作為創(chuàng)作性腦損傷患者的預后和損傷程度指標以及診斷靶標。

創(chuàng)傷性腦損傷 miRNAs 診斷 預后 qRT-PCR

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是受外部壓力導致腦功能減弱的一種疾病，具有很高的致死和致殘率[1]。TBI根據(jù)Glasgow coma scale (GCS)評分可分為輕度、中度和重度腦損傷三種[2]。TBI 包括異質性損傷，可導致神經(jīng)功能和行為功能發(fā)生紊亂，因此很難評價相關損傷的預后和監(jiān)測相關損傷。

微小RNA(MicroRNAs，miRNAs)是一類可調控轉錄水平基因表達的小非編碼RNA。越來越多的證據(jù)表明許多疾病的患者血液中miRNAs 具有特異性表達模式[3]。大量研究也表明TBI后患者血清中miRNA 的表達發(fā)生改變。已有研究報道發(fā)現(xiàn)miR-93、miR-191、miR-499 在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷之大腦皮層以及海馬中顯著上調[4]。但是這些miRNA的表達程度在TBI患者中的表達情況、與TBI的嚴重程度、臨床治療效果以及診斷價值還沒有相關研究。

本研究旨在探討血清中miR-93、miR-191、miR-499在TBI患者中的表達水平以及與臨床治療效果的相關性，并且進一步評價作為TBI生物標志物的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集從2010年9月～2015年9月經(jīng)本院診治的創(chuàng)傷性腦損傷患者96例，所有患者都經(jīng)過本院兩名專家的診斷，而且經(jīng)確認無神經(jīng)系統(tǒng)性疾病史、無酗酒及濫用藥物史、無腦損傷史。平均住院時間(1.14±0.25)個月，平均年齡(48.5±16.5)歲。從本院體檢健康的人群中招募了49名身體健康者作為對照，平均年齡(46.6±8.6)歲。神經(jīng)功能狀態(tài)的損傷程度通過Glasgow coma scale(GCS)[2]評分系統(tǒng)進行評價，GCS評分為13～15分作為輕度創(chuàng)傷性腦損傷，評分為9～12分作為中度創(chuàng)傷性腦損傷，評分為3～8分作為重度創(chuàng)傷性腦損傷。患者臨床治療效果在損傷后9個月通過Glasgow outcome scale (GOS)評價體系進行打分，3～5分表示治療效果好，1-2分表示治療效果差。所有參與該項研究的患者和健康者都簽署了知情同意書，同時本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準。

1.2 血清樣本收集

創(chuàng)傷性腦損傷患者從發(fā)生損傷到24 h內的血清，從第1次收集完后每隔24 h收集1次，共收集21次。血液樣本樣集后立刻進行處理。分離血清3 000 r/min,離心15 min，-80 ℃保存待測。

1.3 RNA提取和實時定量PCR(real-time quantitive PCR，qRT-PCR)

用1步法phenol/chloroform RNA提取試劑盒從100 μL血清中提取總RNA，Nanodrop測定總RNA的含量和濃度，所有RNA測量吸光度(A)值，保證RNA的完整性(A260/A280>2.0)。總mRNA按照TaKaRa公司逆轉錄試劑盒操作說明書逆轉錄成cDNA。用TaqMan miRNA探針試劑盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行real-time PCR擴增，反應體系：1 μL cDNA (500 ng/20 μL)，0.6 μL primer (10 pmol/L)，9 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，無RNase水8.4 μL。反應條件: 95 ℃ 2 min 預熱，95 ℃ 15 s 變性，55 ℃ 30 s 退火，68 ℃ 30 s延伸，40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。miRNAs數(shù)據(jù)用平均值±SEM表示，其他計量資料采用平均值±SD表示；采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組間差異；用接受者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析評價miRNAs在創(chuàng)傷性腦損傷診斷中的價值。其中以α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中miR-93，miR-191，miR-499 表達情況

三種miRNA與對照組相比表達都顯著性升高。這三種miRNAs 在受傷后24 h之內表達都顯著性升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(t=9.87，P<0.001；t=6.73，P<0.001；t=6.05，P<0.01)；在2～7 d，這三種miRNAs 在血清中濃度達到峰值，差異具有統(tǒng)計學意義(t=12.54，P<0.001；t=7.86，P<0.001；t=8.45，P<0.001)；在8～14 以及15～21 d患者血清中三種miRNAs濃度下降，但與對照組相比，差異還具有統(tǒng)計學意義。

圖1 創(chuàng)傷性腦損傷后患者血清中三種miRNAs的表達水平 與對照組相比，?P<0．05，??P<0．01，???P<0．001

2.2 miR-93，miR-191，miR-499表達水平與患者損傷程度的關系

如圖2所示，與對照組相比，三種不同程度腦損傷患者血清中三種miRNAs濃度都顯著性上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而且重度腦損傷患者血清中的miRNAs濃度最高，與輕度和中度腦損傷患者相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 miR?93，miR?191，miR?499表達與患者損傷程度的關系 與對照組相比，?P<0．05，??P<0．01，???P<0．001；與輕度腦損傷相比，#P<0．05；與中度腦損傷相比，▽P<0．05

2.3 miR-93，miR-191，miR-499 表達水平與患者治療后臨床療效的相關性

如圖3所示，miR-93，miR-191，miR-499在A組中濃度高于B組，差異具有統(tǒng)計學意義(t=8.62，P<0.001；t=5.39，P<0.01；t=5.25，P<0.01)。

圖3 miR?93，miR?191，miR?499表達與患者治療臨床療效的相關性 與B組相比，??P<0．01，???P<0．001

2.4 miR-93，miR-191，miR-499表達水平與其診斷價值的關系

如圖4所示，其中miR-93，miR-191，miR-499三種miRNAs ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)分別為0.952 0(95%CI=0.906 5～0.997 4；P<0.001)，0.874 6(95%CI=0.793 3～0.955 8；P<0.001)，0.780 7(95%CI=0.671 9～0.889 5；P<0.001)。

圖4 創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中miR?93，miR?191andmiR?499表達水平的ROC分析

3 討 論

到目前為止，只有Redell 團隊報道發(fā)現(xiàn)重度創(chuàng)傷性腦損傷患者血液中miRNAs 表達發(fā)生改變，其中33個表達下調，19個表達上調[5]。但是在這項研究中TBI 患者樣本數(shù)較少，而且miRNAs 長期表達的變化也未進行研究，特別是miRNAs 和患者臨床治療效果的關系也未進行研究。某些miRNA miR-93，miR-191和miR-499已經(jīng)在大鼠大腦皮層以及海馬被發(fā)現(xiàn)表達上調。但這幾個miRNAs 在創(chuàng)傷性腦損傷患者中的表達情況還未見相關報道。因此，本研究目的是探討miR-93，miR-191，miR-499 在TBI 患者中的表達情況以及這三個miRNAs 與患者腦損傷程度、臨床治療效果、診斷價值的關系。

本研究結果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中這三個miRNA顯著上調，而且在2～7 d，這三種miRNAs在血清中濃度達到峰值。另外，可通過這三個miRNAs 表達情況判斷患者腦損傷的嚴重程度。結果表明miR-93，miR-191，miR-499可作為創(chuàng)傷性腦損傷患者診斷和進展監(jiān)控的新型標志物以及可能參與到創(chuàng)傷性腦損傷患者病理發(fā)生過程中。

miRNAs表達失調與細胞增殖、凋亡、周期進展、腫瘤發(fā)生等生理和病理過程有關。幾項研究已表明創(chuàng)傷性腦損傷后在大鼠大腦皮層、海馬以及血液中的miRNAs表達發(fā)生改變[4, 6]。Ping等[7]研究發(fā)現(xiàn)大鼠在創(chuàng)傷性腦損傷后48和72 h大腦皮層中miR-93表達上調2倍多。另外，也有相關研究發(fā)現(xiàn)大鼠的大腦皮層和海馬在創(chuàng)傷性腦損傷后miR-191，miR-499表達上調[8]。也有越來越多證據(jù)表明血清中miRNAs主要來自于組織中，特別是受疾病影響的組織，比如腦組織等。由損傷腦組織釋放的miRNAs很可能是創(chuàng)傷性腦損傷患者血液中miRNAs差異表達的主要原因[9]。最近也有報道發(fā)現(xiàn)由細胞或者組織分泌到血液中的miRNAs在細胞通訊過程中具有重要作用[10]。這些外分泌miRNAs通過微管，Ago蛋白以及高密度脂蛋白的運輸?shù)桨屑毎缓笥砂屑毎D化成激活形式發(fā)揮功能[11-12]。因此，本研究推斷創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中miR-93，miR-191以及miR-499持續(xù)穩(wěn)定高表達可能是由于患者大腦皮層或者海馬發(fā)生損傷，然后外分泌進入到血清中。但是對該問題很有必要進一步深入研究。

本研究也發(fā)現(xiàn)與輕度和中度腦損傷患者相比，重度創(chuàng)傷性腦損傷患者血清中的miR-93，miR-191以及miR-499存在顯著性高表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而且這三種miRNAs表達在臨床治療效果差的患者血清中要顯著高于臨床治療效果好的患者。因此，這三種miRNAs或許參與到創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生、進展以及修復過程。創(chuàng)傷性腦損傷的病理復雜，與炎癥，凋亡和神經(jīng)元再生等有關。Montalban等[13]發(fā)現(xiàn)miR-93受神經(jīng)營養(yǎng)素調控，靶向與神經(jīng)元相關的信號通路蛋白。另外，Brett等[14]報道發(fā)現(xiàn)miR-93與FoxO3結合，調控胰島素生長因子信號通路，在神經(jīng)干細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。同時，也有報道發(fā)現(xiàn)miR-191可抑制腦源性神經(jīng)因子表達，從而抑制腦發(fā)育和大腦海馬神經(jīng)再生[15-16]。Li 等[17]報道m(xù)iR-499主要參與到細胞增殖、凋亡、周期、骨架重塑等生理過程。因此，推斷這三種miRNAs是重要的基因調空因子，在創(chuàng)傷性腦損傷后的病理以及腦修復過程中具有重要功能，但這三種miRNAs在創(chuàng)傷性腦損傷中的具體功能以及機制還需要進一步深入的研究。

本研究有以下面幾方面的缺陷。第一方面，樣本數(shù)較小，主要是納入標準所限，體現(xiàn)在兩點：一是本研究所有的患者的血清樣本收集都是患者在醫(yī)院注冊完成后進行的；二是患者的住院時間為至少1個月，因此血清樣本收集的時間截至到第21 d；第二方面，對miRNAs的變化檢測評價是一個短期而不是長期過程，長期的監(jiān)測更有利于確定miRNAs與創(chuàng)傷性腦損傷的相關性。本研究創(chuàng)傷性腦損傷患者的臨床治療效果是在損傷后9個月用GOS評分進行評價的，而血清中miRNAs濃度的檢測是在1個月內(21 d)，這主要是因為患者出院后血清樣本不容易獲取。盡管存在上面的一些缺陷，與其他一些僅檢測3～7 d內患者血清中生物標志物濃度的相關研究[18]相比，本研究已經(jīng)做了很大改善；第三方面， miR-93，miR-191以及miR-499也有可能由其他細胞和組織分泌產生，因此不能排除來自腦外組織釋放這三種miRNAs的可能。

總之，結果表明外傷性腦損傷患者血清中miR-93，miR-191，miR-499表達上調。同時，這三個miRNA與外傷性腦損傷的嚴重程度以及患者臨床病理特征有關。所以，miRNAs在創(chuàng)傷性腦損傷的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用，而且可以作為TBI潛在的診斷與預后指標。

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(2016-04-08收稿)

The expression and clinical significance of miR-93,miR-191,miR-499 in the serum of patients with traumatic brain injury

ZhouXiaolong,SongJianrong,LvXinwen,etal.

DepartmentofNeurosurgery,BaojiCentralHospital,Baoji721008

Objective To investigate the expression and clinical significance of miR-93, miR-191, miR-499 in the serum of patients with traumatic brain injury (TBI).Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR) was used to evaluate these miRNAs levels of TBI patients (n=96) and healthy controls (n=49), who admitted in our hospital from Sep. 2010 to Sep. 2015,and the severity and clinical outcome of TBI was further analyzed.Results The serum miR-93, miR-191, and miR-499 levels significantly elevated in the TBI patients compared with the controls and these levels were much higher in the patients with severe TBI than those with moderate or mild TBI (P<0.05);After treatment,the serum miR-93, miR-191, and miR-499 levels were lower in the patients with good outcome than those with poor outcome (p<0.05);The AUCs of miR-93, miR-191, and miR-499 were 0.952 0 (95%CI, 0.906 5-0.997 4;P<0.001), 0.874 6 (95%CI, 0.793 3-0.955 8;P<0.001), 0.780 7 (95%CI, 0.671 9-0.889 5;P<0.001), respectively,all the differences of above had statistical significance.Conclusion miR-93, miR-191, and miR-499 express distinctly in the TBI patients,can be viewed as potentially valuable indicators of the diagnosis, severity, and prognosis of TBI.

Traumatic brain injury miRNAs Diagnosis Prognosis qRT-PCR

721008 陜西省寶雞市中心醫(yī)院神經(jīng)外科[周小龍 宋建榮 呂新文 張鵬(通信作者)]

R743

A

1007-0478(2016)06-0399-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.06.004