白細胞介素-24基因在膝關節骨性關節炎發病中的作用及意義

劉揚

（三峽大學第一臨床醫學院 骨外科，湖北 宜昌 443000）

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論著

白細胞介素-24基因在膝關節骨性關節炎發病中的作用及意義

劉揚

（三峽大學第一臨床醫學院 骨外科，湖北 宜昌 443000）

摘要：目的探討白細胞介素-24（IL-24）基因在膝關節骨性關節炎（KOA）疾病中的作用及意義，為KOA的早期診斷及基因治療提供一定的科學依據。方法選擇該醫院骨科原發性KOA的滑膜標本，提取總R NA，用實時逆轉錄聚合酶鏈反應（R eal-time R T-PCR）檢測KOA滑膜組織中IL-24基因的表達。結果IL-24基因表達在KOA滑膜組織中降低（P<0.01）。結論IL-24在膝關節骨性關節炎滑膜中的表達降低，且與KOA病變關系密切，為將來診斷和基因治療膝關節骨性關節炎疾病提供參考。

關鍵詞：膝關節骨性關節炎；IL-24；基因

骨性關節炎（Osteoarthritis，OA）是發生于老年人群中的一種慢性退行性關節疾病，使患者逐漸散失關節功能[1]。其主要特點是軟骨下骨的改變、關節軟骨的破壞、細胞外基質的減少及滑膜炎性的改變。其特征是骨贅的形成和軟骨下骨的破壞[2]。年齡、肥胖、外傷、性別等是引起OA的常見風險因素[3]。在臨床上最為常見的是膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA），其發病率最高，是一組病因不同，但是有相似的生物學、形態學和臨床表現的疾病[4]。KOA主要損害關節軟骨、半月板、軟骨下骨及滑膜等關節組織，容易引起軟骨代謝的變化。膝關節骨性關節炎是一種自身炎癥反應，可以引起分解代謝和軟骨細胞的凋亡，從而導致軟骨的降解[5-6]。研究表明，KOA發生、發展的過程與多種細胞因子和生長因子有關，如白細胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）家族、轉移生長因子、炎癥因子等[7]。白細胞介素是一種在細胞間發揮免疫調節作用的細胞因子，可以對免疫反應起刺激或者抑制作用，其主要由單核細胞、T淋巴細胞、巨噬細胞產生。IL-24是一種抑制炎性白細胞介素，在骨性關節炎發病中起重要作用。IL-24由外周血單核細胞、B細胞、T細胞等免疫細胞，以及黑色素細胞、皮膚角化細胞、結腸漿膜下肌成纖維細胞等[8-9]非免疫細胞分泌。研究發現，IL-24除具有抑制腫瘤作用，還參與銀屑病、類風濕性關節炎等自身免疫性疾病的免疫病理過程[10-11]。總體來說，KOA是多種細胞因子相互調節引起的復雜病理過程。目前，還沒有IL-24與KOA的相關性及機制的系統性研究，本文通過IL-24基因在膝關節骨性關節炎發病中的作用研究，為KOA的發病機制研究和進一步的基因治療提供依據。

1　資料與方法

1.1一般資料

1.1.1KOA組選取2010年1月-2012年12月在本院骨科就診的膝關節骨性關節炎患者42例，男性22例，女性20例，平均年齡（61.00±2.12）歲，取膝關節滑膜標本作為KOA組實驗標本。

1.1.2對照組選取2010年1月-2012年12月在本院體檢，未患過膝關節骨性關節炎、創傷性截肢的患者32例。其中男性18例，女性14例；平均年齡（51.00±1.49）歲，取其膝關節滑膜組織來作為對照組的實驗標本。

1.1.3標本存放KOA組和對照組的實驗標本取出后，直接置于無菌的裝有液氮的凍存管中，30min后存于-80℃冰箱冷凍保存中。

1.2診斷及納入標準

1.2.1診斷標準滿足美國風濕協會的標準：患者具有膝關節疼痛，患膝X線檢查可以發現骨贅；受累的膝關節晨僵<30 cm；有骨擦聲音，在近1個月內有膝關節疼痛。

1.2.2納入標準篩選本院骨科年齡>50歲的原發性KOA患者，患者符合Ahlback膝關節骨性關節炎分級標準中關節間隙消失、輕度骨磨損、中度骨磨損（磨損0.5～1.0cm）的表現。

1.3實驗試劑

M-MLV轉移液（美國Invitrogen公司），dNTP混合液（日本TaKaRa公司），RNase合成酶抑制劑Inhibitor（美國Promega公司），TRIzol提取液（美國Invitrogen公司），RQI無RNase活性的DNA酶（美國Promega公司），RNeasy提取試劑盒（德國QIAGEN公司），SYBR GreenⅠ嵌合熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）混合液（美國Applied Biosystems公司），ABI熒光定量PCR儀專用96孔板（美國Applied Biosystems公司），ABI熒光定量PCR儀專用封板膜（美國Applied Biosystems公司），引物（9N逆轉錄引物PCR引物）（美國Invitrogen公司）。

1.4實驗儀器

小型臺式高速離心機5415D（德國Eppendorf公司），離心機581OR（德國Eppendorf公司），梯度PCR（德國Eppendorf公司），多孔道DNA檢測儀PTC-225（美國MJ公司），凝膠成像系統CBC/UVP I-DOOl（北京CapitalBio公司），分光光度計ND-1000（美國Nano Drop公司），7900HT實時定量PCR（美國Applied Biosystems），移液槍P-2.5，P-20，P-200，P-l000（德國Eppendorf公司）。

1.5實驗方法

1.5.1R NA的提取（Trizol法）用電子天平稱0.3～0.5 g取出的組織樣本，使用液氮預冷的研缽來研磨，為使組織不融化，研磨過程中注意隨時添加液氮；按組織∶Trizol=100∶1的比例加入Trizol，繼續研磨組織使其至比較細的粉末，轉入超凈工作臺，等融化后，把液體轉移到體積為1.5ml的離心管中，每管大約1 ml，室溫下將其放置>15 min；按照氯仿∶Trizol=0.2∶1.0的比例加入氯仿，將其游禍震蕩30 s混勻，室溫下放置2～3 min，再在4℃、15 000 r/min離心15 min；將離心后得到的上清液轉移到一個新Eppendorf管，按照異丙醇∶Trizol= 0.5∶1.0的比例加入異丙醇，混勻，在-20℃放置> 10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min；將異丙醇棄掉，加入1 ml 75%乙醇，用手指彈起沉淀塊，顛倒幾次，4℃、7500r/min離心5 min；將75%乙醇棄掉，在超凈臺中自然干燥15～30min；視RNA沉淀大小加入一定體積的無核酸酶水，65℃助溶5～10 min；置入-20℃冰箱冷凍保存，在-80℃長期冷凍保存。

1.5.2cDNA第一鏈的合成取2μg RNA置于反應管中，加入Oligo dT 1μl，再加入2.5 mmol dNTP mix 4μl，混勻，加ddH2O至13μl。在60℃條件下靜置10 min后，放在冰上放置>1 min。在反應管中加入5×第一鏈緩沖液4μl，0.1 mol二硫蘇糖醇（DL-dithiothreito，DDT）1μl，RNaseout（40u/μl）1μl，SuperscriptⅢRT 1μl，震蕩混勻后離心，70℃條件下通過滅活逆轉錄酶，合成cDNA第一鏈，4℃條件下保存。

1.5.3實時逆轉錄聚合酶鏈反應（real-time reverse transcription-polymerasechainreaction，R eal-time R T-PCR） ①逆轉錄反應體系和反應程序見表1；②逆轉錄終止反應程序：在70℃條件下加入5μl 1.5mol Na（OH）來終止逆轉錄反應，反應10 min后，加入1μl 10mol乙酸以發生中和反應，再加入無核酸酶水至50μl，在4℃可以短期低溫保存，在-80℃下能夠長期低溫保存。

1.5.4R eal time PCR反應①Real time PCR反應體系見表2；②Real time PCR反應程序見表3；③Real time PCR產物1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測見表4。1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測條件：120V，15～20min。1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測條件：120～130V，15～20min。

1.6統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，用t檢驗，計數資料以率表示，用χ2檢驗，用直線相關回歸描述IL-24 mRNA的相對表達量與KOA病程的相關性，用散點圖描述兩者的相關性，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1兩組患者一般情況比較

KOA組和對照組在性別、年齡方面比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

2.2RT-PCR檢測不同組織中IL-24 mRNA表達的電泳圖

人膝關節骨性關節炎滑膜組織與正常滑膜組織表達IL-24 mRNA的Real-time RT-PCR檢測電泳圖見圖1。

2.3Real-time RT-PCR分析

Real-time RT-PCR反應結果表明，兩組IL-24基因表達比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t= 19.263，P=0.000），KOA組較對照組IL-24基因表達降低。見圖2。

2.4IL-24 mRNA統計學分析

KOA組IL-24 mRNA的表達值為（0.051± 0.006），對照組為（0.940±0.070），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.734，P=0.001），KOA組低于對照組。

表1　Real-time RT-PCR逆轉錄反應體系及反應程序

表2　Real Time PCR反應體系

表3　Real Time PCR反應程序

表4　Real time PCR產物1.5%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測

2.5IL-24 mRNA相對表達量與KOA病程的相關分析

隨著病程的增加即關節磨損程度加重，IL-24 mRNA相對表達量減少，表明IL-24 mRNA的相對表達量與KOA病程呈負相關（r=-0.827，P=0.000）。見圖3。

表5　兩組患者一般情況比較

圖1　不同組織中IL-24 mRNA表達的電泳圖

圖2　兩組IL-24 mRNA的相對表達量比較

圖3　IL-24 mRNA的相對表達量和KOA病程散點圖

3　討論

膝關節骨性關節炎又稱增生性膝關節炎，是指膝關節由于外傷、慢性勞損及關節畸形等引起關節軟骨變性、增生，從而導致腫脹、疼痛、伸屈受限等癥狀的退行性關節疾病。MURPHY等[12]研究表明，1/2的成年人85歲之前患有癥狀的骨性關節炎。膝關節骨性關節炎易導致軟骨代謝的變化，其變化開始于關節軟骨結構的變化，滑膜的炎癥參與該過程。滑膜炎是體內細胞因子合成釋放綜合作用的結果，進而影響到關節軟骨的改變。滑膜炎是引起早期膝關節骨性關節炎臨床癥狀的主要因素。任紅革等[13]通過查閱文獻，總結出細胞因子在膝關節骨性關節炎發生、發展過程中發揮重要作用，部分細胞因子能促進骨性關節炎軟骨降解、滑膜炎癥及軟骨下骨的吸收，部分細胞因子也有抑制骨性關節炎病變發展的作用。與分解代謝有關的細胞因子主要有基質金屬蛋白酶；與合成代謝有關的細胞因子主要有轉化生長因子、骨形態發生蛋白、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子和血管內皮細胞生長因子；在關節組織中發現的影響細胞功能的炎癥因子包括白細胞介素、趨化因子和腫瘤壞死因子等。

白細胞介素含促炎癥白細胞介素和抑制白細胞介素兩類，其在膝關節骨性關節炎中發揮重要作用。促炎癥白細胞介素主要有IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18等，抑制炎癥白細胞介素主要有IL-4、IL-10、IL-13、IL-24等。研究表明，IL-24同腫瘤的抑制、炎癥的抑制、損失的修復作用密切相關[14-15]。IL-24對腫瘤的抑制作用比較廣泛，能夠抑制肺癌、鼻咽癌、宮頸癌等癌細胞的生長[16]。大量對其機制的研究表明，主要從PKR途徑、抑制腫瘤血管的生成、抑制腫瘤細胞的侵襲，以及IL-24的免疫調節作用來發揮作用。同時DOMINIK等[17]經免疫組織化學法、遷移分析等研究發現，IL-24在損傷修復過程中，在皮膚角化細胞中表達升高，并抑制由TGF-α引起的促炎癥作用。在本研究中通過Real-time RT-PCR檢測發現，IL-24基因在膝關節骨性關節炎滑膜中表達顯著降低，考慮原因為IL-24的低表達作用能很好地促進TGF-α引起的促炎癥反應以及關節軟骨的降解作用，從而引起人發生膝關節骨性關節炎。

通過IL-24基因在膝關節骨性關節炎發病中的作用研究，筆者發現，IL-24基因在膝關節骨性關節炎滑膜中表達顯著降低，IL-24與KOA的發生、發展過程密切相關。同時對IL-24基因的表達水平研究，能夠幫助早期診斷膝關節骨性關節炎，并且對IL-24基因進一步深入研究可以為將來膝關節骨性關節炎的診斷和基因治療提供參考。

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（童穎丹編輯）

中圖分類號：R 684.3

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.13.012

文章編號：1005-8982（2016）13-0063-05

收稿日期：2015-07-09

Expression ofIL24 gene in knee osteoarthritis and its significance

Yang Liu
（Department of Bone Orthopedics，the First College of Clinical Medical Science，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443000，China）

Abstract:Objective To investigate expression and significance ofIL24 gene in the knee osteoarthritis （KOA），and to provide scientific basis for early diagnosis and gene therapy for knee osteoarthritis.Methods Fresh synovial specimens were collected from orthopedic patients in our hospital.Trizol was used to extract total RNA.Expression ofIL24in knee osteoarthritis synovium was detected by RT-PCR.ResultsIL24gene expression in knee KOA synovial tissue obviously decreased（P＜0.01）.ConclusionsIL24 expression in the synovium of osteoarthritis knee joint obviously declines and is negatively correlated with the progress of KOA. Therefore，it can provide a reference for future diagnosis and gene therapy of knee osteoarthritis.

Keywords:knee osteoarthritis；IL24；gene