HPLC法測(cè)定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量*

南　國(guó)，張　鵬，王　萌，王躍飛，朱　彥，吳紅華

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

HPLC法測(cè)定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量*

南國(guó)1，2，張鵬1，2，王萌1，2，王躍飛1，2，朱彥1，2，吳紅華1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

［目的］建立高效液相法（HPLC）同時(shí)測(cè)定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量。［方法］采用Agilent1260 DAD高效液相色譜儀，Amethyst C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），乙腈-水為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速1 mL/min。［結(jié)果］三七皂苷R1對(duì)照品在8～247 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為102.69%，RSD=2.74%（n=6）；人參皂苷Rg1對(duì)照品在14～422 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為98.72%，RSD=1.85%（n= 6）；黨參炔苷對(duì)照品在1.5～42 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為97.69%，RSD=1.94%（n=6）；人參皂苷Rb1對(duì)照品在2.65～847 mg/L線性關(guān)系良好，回收率為102.11%，RSD=1.96%（n=6）；人參皂苷Rd對(duì)照品在8～255 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為99.66%，RSD=2.49%（n=6）。［結(jié)論］本實(shí)驗(yàn)中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd和黨參炔苷的含量測(cè)定方法穩(wěn)定可靠，可作為穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷含量測(cè)定方法。

穩(wěn)心顆粒；高效液相色譜法；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；黨參炔苷；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rd

穩(wěn)心顆粒是由三七、黨參、黃精、甘松和琥珀等組成的復(fù)方制劑［1］，其配伍特點(diǎn)與炙甘草湯一脈相承，具有活血化瘀、行氣導(dǎo)滯、益氣養(yǎng)陰的功效［2］。穩(wěn)心顆粒是目前中國(guó)首個(gè)通過美國(guó)實(shí)驗(yàn)室論證，具有多離子通道［鈉離子（Na+）、鉀離子（Ka+）、鈣離子（Ca2+）］調(diào)節(jié)作用的中成藥［3-4］，能從根本上改善心律失常的原發(fā)病［5-6］，臨床將其用于室性早搏的治療，療效顯著［7］。方中黨參為君藥，補(bǔ)中益氣，帥血而行，使心脈通而不滯；三七活血化瘀，定驚安神，為佐藥［8］。

2015年藥典記載了穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rb1的定量方法。本實(shí)驗(yàn)在此研究的基礎(chǔ)上，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，引入了兩個(gè)新定量指標(biāo)：人參皂苷Rd與黨參炔苷。使得穩(wěn)心顆粒的定量成分不再局限于三七藥材，使得質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)更加全面。為穩(wěn)心顆粒的質(zhì)量控制及后續(xù)作用機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器Agilent1260 DAD高效液相色譜儀；超純水儀（Milli-Q，美國(guó)Millipore公司）；十萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO XS205，瑞士METTLER公司）；萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO AL204，瑞士METTLER公司）；SCIENTZ SB 25-12DTN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2藥品與試劑穩(wěn)心顆粒（無(wú)蔗糖，每袋5 g由山東步長(zhǎng)制藥有限公司提供；人參皂苷Rg1（批號(hào)110703-201529）、人參皂苷Rb1（批號(hào)110704-201424）、人參皂苷Rd（批號(hào)111818-201302）標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，純度為95%；三七皂苷R1（批號(hào)AB160N）、黨參炔苷（批號(hào)AB323L）標(biāo)準(zhǔn)品由一方科技公司提供，純度為98%；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1色譜條件色譜柱AmethystC18（4.6mm×250mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～14 min，22%～30%A；14～35 min，30%～38%A；35～45 min，38%～38%A；45～47 min，38%～95%A；47～62 min，95%～95%A；62～65 min，95%～22%A）；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫27℃。

2.2對(duì)照品溶液的制備取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd和黨參炔苷適量，精密稱定，加甲醇配制成每1mL含有三七皂苷R10.247mg、人參皂苷Rg10.422 mg、黨參炔苷0.042 mg、人參皂苷Rb10.847 mg和人參皂苷Rd 0.255 mg的混合溶液，即得。

*基金項(xiàng)目：科技部國(guó)際國(guó)家合作專項(xiàng)（2013DFA31620）。

作者簡(jiǎn)介：南國(guó)（1988-），男，碩士研究生，主要從事中藥分析工作。

通訊作者：吳紅華，E-mail：wuhonghua2003@163.com。

2.3供試品溶液的制備取裝量差異項(xiàng)下的本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水飽和的正丁醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡12 h，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和的正丁醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4專屬性實(shí)驗(yàn)按處方中藥味的比例，分別去除三七與黨參，制成缺三七與黨參的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液測(cè)定，結(jié)果在三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷相同保留時(shí)間處未顯明顯色譜峰，故認(rèn)為無(wú)干擾，見圖1。

2.5線性關(guān)系考察將混合對(duì)照品溶液稀釋0、2、4、8、16、32倍，分別注入液相色譜儀，分別計(jì)算同一保留時(shí)間下的峰面積，以濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：三七皂苷R1：Y=984.18X-0.546 3，r=0.999 9，對(duì)照品在8～247 mg/L線性關(guān)系良好；人參皂苷Rg1：Y=1 298.9X+6.829 2，r=0.999 9，對(duì)照品在14～422 mg/L線性關(guān)系良好；黨參炔苷：Y=38 187X-16.383，r=0.999 9，對(duì)照品在1.5～42 mg/L線性關(guān)系良好；人參皂苷Rb1：Y=441.49X-1.838 8，r=0.999 9，對(duì)照品在26.5～847 mg/L線性關(guān)系良好；人參皂苷Rd：Y=1009.8X+1.3961，r=0.9996，對(duì)照品在8～255 mg/L線性關(guān)系良好。

2.6精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)1412042），進(jìn)樣10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。三七皂苷R1的RSD=1.61%，人參皂苷Rg1的RSD= 0.32%，黨參炔苷的RSD=1.41%，人參皂苷Rb1的RSD=0.60%，人參皂苷Rd的RSD=1.37%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)1412042），在室溫下保存，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h的時(shí)間間隔，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。三七皂苷R1的RSD=1.56%，人參皂苷Rg1的RSD=0.46%，黨參炔苷的RSD=0.94%，人參皂苷Rb1的RSD=0.82%，人參皂苷Rd的RSD= 1.21%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)按前述供試品溶液制備方法制備，對(duì)同一批樣品（批號(hào)1412042）取6份進(jìn)行測(cè)定。三七皂苷R1的RSD=1.06%，人參皂苷Rg1的RSD= 1.34%，黨參炔苷的RSD=0.54%，人參皂苷Rb1的RSD=1.10%，人參皂苷Rd的RSD=1.67%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

圖1　對(duì)照品（A）、樣品（B）、缺三七陰性樣品（C）和缺黨參陰性樣品（D）HPLC圖Fig.1　The HPLC chromatograms of the chemical reference substances（A），samples（B），negative samples of Panax notoginseng（C）and Codouopsis pilosula（D）

2.9加樣回收率實(shí)驗(yàn)取已知含量的穩(wěn)心顆粒樣品（批號(hào)1412042，三七皂苷R10.829 7 mg/g，人參皂苷Rg13.307 2 mg/g，黨參炔苷0.089 7 mg/g人參皂苷Rb15.464 3 mg/g，人參皂苷Rd 0.787 4 mg/g）約0.5 g，精密稱定6份，加入與樣品中各成分含有量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品的溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，依法測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的回收率RSD分別為2.74%、1.85%、1.94%、1.96%與2.49%，表明本測(cè)定方法的回收率良好。

2.10樣品測(cè)定按上述色譜條件對(duì)6批樣品進(jìn)行測(cè)定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量測(cè)定結(jié)果，見表1。

表1樣品測(cè)定結(jié)果Tab.1　Sample determination resultsmg/g

3　討論

本實(shí)驗(yàn)參照2015版《中國(guó)藥典》方法，為最大限度防止定量成分損失，精簡(jiǎn)實(shí)驗(yàn)方法，將藥典關(guān)于穩(wěn)心顆粒的定量方法改進(jìn)為“2.3”項(xiàng)下供試品制備方法。進(jìn)而確定穩(wěn)心顆粒的定量成分：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷。以上4類皂苷成分歸屬于三七藥材［9］，黨參炔苷為黨參中的化學(xué)成分［10］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，三七可以通過縮短鈣通道的開放時(shí)間，延長(zhǎng)關(guān)閉時(shí)間，從而促進(jìn)心律失常的恢復(fù)［11］。黨參提取物能在不增加心率的情況下提高心排血量，增加腦、內(nèi)臟和下肢的血液量以及循環(huán)量［12］。黨參炔苷具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓作用，還能調(diào)節(jié)前列腺素代謝，亦可作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分［13］。本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便易操作，穩(wěn)定性良好，為穩(wěn)心顆粒的后續(xù)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

［1］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥曲（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］徐鶯，楊青，朱海燕，等.穩(wěn)心顆粒治療心血管疾病研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2011，18（12）:100-102.

［3］郭繼鴻.抗心律失常中藥的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)［J］.中國(guó)循證心血管醫(yī)學(xué)雜志，2010，2（4）:198-201.

［4］崔長(zhǎng)琮.穩(wěn)心顆粒對(duì)家兔左心室內(nèi)、外膜電生理特性的影響［J］.世界中醫(yī)藥，2007，2（5）:304-305.

［5］桑旭，張明.步長(zhǎng)穩(wěn)心顆粒治療心律失常研究及應(yīng)用進(jìn)展概述［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（10）:208-210.

［6］郭繼鴻，崔長(zhǎng)琮.抗心律失常中西藥與離子通道［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:130-132.

［7］孟令飛.步長(zhǎng)穩(wěn)心顆粒治療室性早搏療效觀察［D］.吉林:吉林大學(xué)，2013.

［8］陸永平，郭繼鴻.穩(wěn)心顆粒治療心律失常機(jī)制探討［J］.光明中醫(yī)雜志，2009，24（10）:1987-1988.

［9］江劉平，焦林如.三七總皂苷的藥用生物學(xué)活性研究進(jìn)展［J］.氨基酸和生物資源雜志，2013，35（3）:17-21.

［10］賀慶，朱恩圓，王崢濤，等.黨參中黨參炔苷的HPLC分析［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40（1）:56-57.

［11］何芳.穩(wěn)心顆粒抗心律失常作用研究進(jìn)展［J］.人民軍醫(yī)，2014，57（8）:896-897.

［12］李曉峰.黨參的化學(xué)成分及藥理作用研究概況［J］.中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥雜志，2014，12（21）：83-84.

［13］宋丹，王崢濤，李龍?jiān)疲?黨參炔苷對(duì)胃潰瘍模型大鼠胃黏膜損傷保護(hù)作用的研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥雜志，2008，17（7）:963-964，968.

（本文編輯：高杉，滕曉東）

Determination of Notoginsenoside R1，Ginsenoside Rg1，Rb1，Rd and Lobetyolin in Wenxin Keli by HPLC

NAN Guo1，2，ZHANG Peng1，2，WANG Meng1，2，WANG Yue-fei1，2，ZHU Yan1，2，WU Hong-hua1，2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China）

［Objective］To establish a HPLC method for simulataneous determination of Notoginsenoside R1（1），Ginsenoside Rg1（2），lobetyolin（3），Ginsenoside Rb1（4），Ginsenoside Rd（5）in Wenxin Keli by HPLC.［Methods］The HPLC was conducted on Amethyst C18column（4.6 mm×250 mm，4 μm）with acetonitrile-water solution as themobile phase.The detection wavelength was 210 nm，and flow rate was 1 mL/min.［Results］Linearity of each standard was established within the concentration range of 8～247 mg/L for 1，14～422 mg/L for 2，1.5～42 mg/L for 3，26.5～847 mg/L for 4 and 8～255 mg/L for 5.The average recovery（n=6）of the compound 1-5 was 102.69%with RSD of 2.74%，98.72%with RSD of 1.85%，97.69%with RSD of 1.94%，102.11%with RSD of 1.96%，99.66%with RSD of 2.49% respectively.［Conclusion］The treatment of samples was stable and reliable.The method can be used for determination of notoginsenoside R1，lobetyolin，ginsenoside Rg1，Rb1and Rd in Wenxin Keli.

Wenxin Keli；HPLC；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Lobetyolin Ginseno-side Rb1；Ginsenoside Rd

R284.2

A

1672-1519（2016）07-0434-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.13

2016-01-12）