HPLC法測定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量*

南　國，張　鵬，王　萌，王躍飛，朱　彥，吳紅華

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

HPLC法測定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量*

南國1，2，張鵬1，2，王萌1，2，王躍飛1，2，朱彥1，2，吳紅華1，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室，天津 300193；2.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

［目的］建立高效液相法（HPLC）同時測定穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量。［方法］采用Agilent1260 DAD高效液相色譜儀，Amethyst C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，4 μm），乙腈-水為流動相，檢測波長為210 nm，流速1 mL/min。［結(jié)果］三七皂苷R1對照品在8～247 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為102.69%，RSD=2.74%（n=6）；人參皂苷Rg1對照品在14～422 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為98.72%，RSD=1.85%（n= 6）；黨參炔苷對照品在1.5～42 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為97.69%，RSD=1.94%（n=6）；人參皂苷Rb1對照品在2.65～847 mg/L線性關(guān)系良好，回收率為102.11%，RSD=1.96%（n=6）；人參皂苷Rd對照品在8～255 mg/L線性關(guān)系良好，平均回收率為99.66%，RSD=2.49%（n=6）。［結(jié)論］本實驗中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd和黨參炔苷的含量測定方法穩(wěn)定可靠，可作為穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷含量測定方法。

穩(wěn)心顆粒；高效液相色譜法；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；黨參炔苷；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rd

穩(wěn)心顆粒是由三七、黨參、黃精、甘松和琥珀等組成的復(fù)方制劑［1］，其配伍特點與炙甘草湯一脈相承，具有活血化瘀、行氣導(dǎo)滯、益氣養(yǎng)陰的功效［2］。穩(wěn)心顆粒是目前中國首個通過美國實驗室論證，具有多離子通道［鈉離子（Na+）、鉀離子（Ka+）、鈣離子（Ca2+）］調(diào)節(jié)作用的中成藥［3-4］，能從根本上改善心律失常的原發(fā)病［5-6］，臨床將其用于室性早搏的治療，療效顯著［7］。方中黨參為君藥，補中益氣，帥血而行，使心脈通而不滯；三七活血化瘀，定驚安神，為佐藥［8］。

2015年藥典記載了穩(wěn)心顆粒中三七皂苷R1，人參皂苷Rg1、Rb1的定量方法。本實驗在此研究的基礎(chǔ)上，簡化實驗步驟，引入了兩個新定量指標(biāo)：人參皂苷Rd與黨參炔苷。使得穩(wěn)心顆粒的定量成分不再局限于三七藥材，使得質(zhì)量標(biāo)準更加全面。為穩(wěn)心顆粒的質(zhì)量控制及后續(xù)作用機制研究打下基礎(chǔ)。

1　實驗材料

1.1儀器Agilent1260 DAD高效液相色譜儀；超純水儀（Milli-Q，美國Millipore公司）；十萬分之一天平（METTLER TOLEDO XS205，瑞士METTLER公司）；萬分之一天平（METTLER TOLEDO AL204，瑞士METTLER公司）；SCIENTZ SB 25-12DTN超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2藥品與試劑穩(wěn)心顆粒（無蔗糖，每袋5 g由山東步長制藥有限公司提供；人參皂苷Rg1（批號110703-201529）、人參皂苷Rb1（批號110704-201424）、人參皂苷Rd（批號111818-201302）標(biāo)準品由中國藥品生物制品檢定所提供，純度為95%；三七皂苷R1（批號AB160N）、黨參炔苷（批號AB323L）標(biāo)準品由一方科技公司提供，純度為98%；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　實驗方法

2.1色譜條件色譜柱AmethystC18（4.6mm×250mm，4 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～14 min，22%～30%A；14～35 min，30%～38%A；35～45 min，38%～38%A；45～47 min，38%～95%A；47～62 min，95%～95%A；62～65 min，95%～22%A）；流速1 mL/min；檢測波長210 nm；柱溫27℃。

2.2對照品溶液的制備取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd和黨參炔苷適量，精密稱定，加甲醇配制成每1mL含有三七皂苷R10.247mg、人參皂苷Rg10.422 mg、黨參炔苷0.042 mg、人參皂苷Rb10.847 mg和人參皂苷Rd 0.255 mg的混合溶液，即得。

*基金項目：科技部國際國家合作專項（2013DFA31620）。

作者簡介：南國（1988-），男，碩士研究生，主要從事中藥分析工作。

通訊作者：吳紅華，E-mail：wuhonghua2003@163.com。

2.3供試品溶液的制備取裝量差異項下的本品，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水飽和的正丁醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡12 h，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用水飽和的正丁醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4專屬性實驗按處方中藥味的比例，分別去除三七與黨參，制成缺三七與黨參的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備陰性對照溶液測定，結(jié)果在三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷相同保留時間處未顯明顯色譜峰，故認為無干擾，見圖1。

2.5線性關(guān)系考察將混合對照品溶液稀釋0、2、4、8、16、32倍，分別注入液相色譜儀，分別計算同一保留時間下的峰面積，以濃度X為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。回歸方程：三七皂苷R1：Y=984.18X-0.546 3，r=0.999 9，對照品在8～247 mg/L線性關(guān)系良好；人參皂苷Rg1：Y=1 298.9X+6.829 2，r=0.999 9，對照品在14～422 mg/L線性關(guān)系良好；黨參炔苷：Y=38 187X-16.383，r=0.999 9，對照品在1.5～42 mg/L線性關(guān)系良好；人參皂苷Rb1：Y=441.49X-1.838 8，r=0.999 9，對照品在26.5～847 mg/L線性關(guān)系良好；人參皂苷Rd：Y=1009.8X+1.3961，r=0.9996，對照品在8～255 mg/L線性關(guān)系良好。

2.6精密度實驗精密吸取同一供試品溶液（批號1412042），進樣10 μL，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。三七皂苷R1的RSD=1.61%，人參皂苷Rg1的RSD= 0.32%，黨參炔苷的RSD=1.41%，人參皂苷Rb1的RSD=0.60%，人參皂苷Rd的RSD=1.37%，表明儀器精密度良好。

2.7穩(wěn)定性實驗精密吸取同一供試品溶液（批號1412042），在室溫下保存，分別于0、1、2、4、8、12、24、48 h的時間間隔，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。三七皂苷R1的RSD=1.56%，人參皂苷Rg1的RSD=0.46%，黨參炔苷的RSD=0.94%，人參皂苷Rb1的RSD=0.82%，人參皂苷Rd的RSD= 1.21%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8重現(xiàn)性實驗按前述供試品溶液制備方法制備，對同一批樣品（批號1412042）取6份進行測定。三七皂苷R1的RSD=1.06%，人參皂苷Rg1的RSD= 1.34%，黨參炔苷的RSD=0.54%，人參皂苷Rb1的RSD=1.10%，人參皂苷Rd的RSD=1.67%，表明方法的重現(xiàn)性良好。

圖1　對照品（A）、樣品（B）、缺三七陰性樣品（C）和缺黨參陰性樣品（D）HPLC圖Fig.1　The HPLC chromatograms of the chemical reference substances（A），samples（B），negative samples of Panax notoginseng（C）and Codouopsis pilosula（D）

2.9加樣回收率實驗取已知含量的穩(wěn)心顆粒樣品（批號1412042，三七皂苷R10.829 7 mg/g，人參皂苷Rg13.307 2 mg/g，黨參炔苷0.089 7 mg/g人參皂苷Rb15.464 3 mg/g，人參皂苷Rd 0.787 4 mg/g）約0.5 g，精密稱定6份，加入與樣品中各成分含有量相當(dāng)?shù)膶φ掌返娜芤海础?.3”項下方法制備供試溶液，依法測定峰面積并計算回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的回收率RSD分別為2.74%、1.85%、1.94%、1.96%與2.49%，表明本測定方法的回收率良好。

2.10樣品測定按上述色譜條件對6批樣品進行測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷的含量測定結(jié)果，見表1。

表1樣品測定結(jié)果Tab.1　Sample determination resultsmg/g

3　討論

本實驗參照2015版《中國藥典》方法，為最大限度防止定量成分損失，精簡實驗方法，將藥典關(guān)于穩(wěn)心顆粒的定量方法改進為“2.3”項下供試品制備方法。進而確定穩(wěn)心顆粒的定量成分：三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Rd與黨參炔苷。以上4類皂苷成分歸屬于三七藥材［9］，黨參炔苷為黨參中的化學(xué)成分［10］。據(jù)文獻報道，三七可以通過縮短鈣通道的開放時間，延長關(guān)閉時間，從而促進心律失常的恢復(fù)［11］。黨參提取物能在不增加心率的情況下提高心排血量，增加腦、內(nèi)臟和下肢的血液量以及循環(huán)量［12］。黨參炔苷具有抗腫瘤、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)靜、降壓作用，還能調(diào)節(jié)前列腺素代謝，亦可作為質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分［13］。本實驗方法簡便易操作，穩(wěn)定性良好，為穩(wěn)心顆粒的后續(xù)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

Determination of Notoginsenoside R1，Ginsenoside Rg1，Rb1，Rd and Lobetyolin in Wenxin Keli by HPLC

NAN Guo1，2，ZHANG Peng1，2，WANG Meng1，2，WANG Yue-fei1，2，ZHU Yan1，2，WU Hong-hua1，2
（1.Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.Research and Development Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin International Joint Academy of Biotechnology and Medicine，Tianjin 300457，China）

［Objective］To establish a HPLC method for simulataneous determination of Notoginsenoside R1（1），Ginsenoside Rg1（2），lobetyolin（3），Ginsenoside Rb1（4），Ginsenoside Rd（5）in Wenxin Keli by HPLC.［Methods］The HPLC was conducted on Amethyst C18column（4.6 mm×250 mm，4 μm）with acetonitrile-water solution as themobile phase.The detection wavelength was 210 nm，and flow rate was 1 mL/min.［Results］Linearity of each standard was established within the concentration range of 8～247 mg/L for 1，14～422 mg/L for 2，1.5～42 mg/L for 3，26.5～847 mg/L for 4 and 8～255 mg/L for 5.The average recovery（n=6）of the compound 1-5 was 102.69%with RSD of 2.74%，98.72%with RSD of 1.85%，97.69%with RSD of 1.94%，102.11%with RSD of 1.96%，99.66%with RSD of 2.49% respectively.［Conclusion］The treatment of samples was stable and reliable.The method can be used for determination of notoginsenoside R1，lobetyolin，ginsenoside Rg1，Rb1and Rd in Wenxin Keli.

Wenxin Keli；HPLC；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Lobetyolin Ginseno-side Rb1；Ginsenoside Rd

R284.2

A

1672-1519（2016）07-0434-03

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.07.13

2016-01-12）