高效液相色譜-熒光法測(cè)定甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在煙葉及土壤中的殘留及消解動(dòng)態(tài)

徐金麗， 尤祥偉， 王秀國(guó)， 徐光軍， 鄭 曉， 陳 丹， 李義強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101)

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高效液相色譜-熒光法測(cè)定甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在煙葉及土壤中的殘留及消解動(dòng)態(tài)

徐金麗， 尤祥偉*， 王秀國(guó)， 徐光軍， 鄭 曉， 陳 丹， 李義強(qiáng)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，煙草行業(yè)煙草病蟲(chóng)害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266101)

[目的]建立柱前衍生高效液相色譜-熒光法測(cè)定煙葉和土壤中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量的方法。[方法]樣品經(jīng)乙腈提取，分散固相萃取凈化，以N-甲基咪唑和三氟乙酸酐進(jìn)行柱前衍生，衍生物用高效液相色譜-熒光法測(cè)定。[結(jié)果]當(dāng)添加濃度為0.000 5～1.000 0mg/kg時(shí),甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的平均添加回收率均超過(guò)90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～5.5%。在鮮煙葉、干煙葉和土壤中，方法最低檢出濃度(LOQ)分別為0.004、0.008和0.000 5mg/kg。采用所建方法測(cè)定了2014～2015年山東、四川煙葉和土壤樣品中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的消解動(dòng)態(tài)及最終殘留，結(jié)果表明，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽在煙葉和土壤中消解半衰期為4.4～5.4和1.6～2.6d。按照2.25和3.375ga.i./hm2用量，分別施藥2～3次，采收間隔期 7d時(shí)，烤后煙葉樣品中甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽殘留量低于0.2mg/kg。[結(jié)論]該方法操作簡(jiǎn)便，有機(jī)溶劑用量少，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)對(duì)靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度的要求。

高效液相色譜-熒光法；甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽；煙葉；土壤；殘留；消解

甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡(jiǎn)稱(chēng)甲維鹽)是以阿維菌素為原料，經(jīng)化學(xué)合成的一種高效殺蟲(chóng)殺螨劑[1]，其作用機(jī)理為阻礙害蟲(chóng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)傳遞而使其麻痹死亡，具有胃毒、觸殺和一定的滲透作用。甲維鹽對(duì)鱗翅目、鞘翅目、同翅目等害蟲(chóng)具有顯著防效，在水果、蔬菜、煙草以及大田作物中得到了廣泛應(yīng)用[2]。

目前，甲維鹽的分析方法常采用高效液相色譜分離，紫外檢測(cè)器(UV)[3-5]或熒光檢測(cè)器(FLD)[6-7]進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器(UV)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于雜質(zhì)干擾大、靈敏度低，需要進(jìn)行較為復(fù)雜的凈化和濃縮步驟，程序繁瑣，消耗大量有機(jī)溶劑[8-9]。而目前報(bào)道的衍生化方法中，應(yīng)用范圍也以蔬菜、水果和土壤為主[10-13]。筆者首次將分散固相萃取凈化與熒光檢測(cè)相結(jié)合，建立了煙草和土壤中甲維鹽的分析方法，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、可靠的特點(diǎn)，并采用所建方法研究3.4%甲維鹽懸浮劑在煙草上應(yīng)用時(shí)的消解動(dòng)態(tài)與最終殘留水平，為推薦該農(nóng)藥制定合理使用規(guī)范提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料煙草試驗(yàn)品種：NC89(山東青島)、CF27(四川西昌)。

1.2藥品、試劑及主要儀器甲維鹽(emamectinbenzoate)標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%%，德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH公司)；乙腈(分析純)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、去離子水、氯化鈉(分析純)；衍生化試劑：N-甲基咪唑(NMIM)、三氟乙酸酐(TFAA)和N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑(PSA)。3.4%甲維鹽懸浮劑(陜西上格之路生物科學(xué)有限公司)。

WatersAlliancee2695/2475高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器(HPLC-FD)(Waters公司)；WatersSunFireTMC18色譜柱(5.0μm，4.6mm×150.0mm，Waters公司)；超聲波振蕩機(jī)(RSQ-60AS，寧波榮順公司)； 千分之一電子天平(SHIMADZU-UW420H，日本Shimadzu公司)；萬(wàn)分之一電子天平(ER-182A，日本Tykyo公司)；回旋式振蕩器(BLUDPARDWSZ-200A，上海藍(lán)豹)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(HEIDOLPH-ADVANTAGE，德國(guó)海道爾夫)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1煙葉動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。設(shè)30m2煙田為一小區(qū)，每個(gè)處理3次重復(fù)。在煙草旺長(zhǎng)中后期，按照甲維鹽3.375ga.i./hm2葉面噴霧，施藥時(shí)保證煙葉均勻著藥。于施藥后1h，1、3、5、7、14、21、28、35、42d采集煙葉樣品。將采集的煙葉樣品去除煙梗，切成1cm2左右，混勻后采用四分法留樣200g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

1.3.2土壤動(dòng)態(tài)試驗(yàn)。選一塊15m2的空白地塊，按照甲維鹽3.375ga.i./hm2地面均勻噴霧，于施藥后1h，1、3、5、7、10、14、21、28、35、42d隨機(jī)取點(diǎn)5～10個(gè)，用土鉆采集0～10cm土壤1～2kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣300g，裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。

1.3.3最終殘留量試驗(yàn)。在煙草旺長(zhǎng)后期，設(shè)30m2煙田為一小區(qū)。按照甲維鹽2.250、3.375ga.i./hm22個(gè)劑量葉面噴霧，分別施藥2、3次(交叉施藥次數(shù)和劑量，共4個(gè)處理)，施藥間隔期7d。分別于最后一次施藥后7、14、21d采集煙葉樣品，在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集上、中、下部正常成熟的煙葉樣品不少于100片，煙葉經(jīng)三段式烘烤工藝(不超過(guò)68 ℃)烘烤、去主脈，粉碎混勻后，采用四分法留樣200g。同時(shí)采集土壤樣品，用土鉆采集0～15cm的土壤1～2kg，除去土壤中的碎石、雜草和植物根莖等雜物，混勻后采用四分法留樣300g。分別裝入樣本容器中，粘好標(biāo)簽，貯存于-20 ℃冰柜中保存。每個(gè)處理重復(fù)3次，另設(shè)清水空白對(duì)照，處理間設(shè)保護(hù)帶。

1.4分析方法

1.4.1提取。鮮煙葉：稱(chēng)取鮮煙葉10.0g，盛于250mL三角瓶中，加入80mL乙腈，振蕩提取1h，加入6gNaCl，振蕩15min，靜置，濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確量取40mL，45 ℃濃縮至近干，用2mL乙腈定容，待凈化。

干煙葉：稱(chēng)取干煙葉2.0g，盛于250mL三角瓶中，加8mL蒸餾水，輕搖使樣品潤(rùn)濕，靜置10min。加入60mL乙腈，振蕩提取1h，加入6gNaCl，振蕩15min，靜置，濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確量取30mL，45 ℃濃縮至近干，用2mL乙腈定容，待凈化。

土壤：稱(chēng)取土壤20.0g，盛于250mL三角瓶中，加入適量蒸餾水，輕搖使樣品潤(rùn)濕，靜置10min。加入60mL乙腈，回旋式振蕩器振蕩提取1h，加入6gNaCl，再振蕩15min，靜置，濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確量取30mL，45 ℃濃縮至近干，用2mL乙腈定容，經(jīng)0.22μm微膜過(guò)濾至樣品瓶中，再準(zhǔn)確吸取0.5mL于棕色樣品小瓶中，待衍生化。

1.4.2凈化。移取提取液上清液1.5mL于盛有150mg無(wú)水硫酸鎂和25mgPSA的 1.5mL離心管中，于漩渦混合振蕩儀上漩渦振蕩2min，再以6 000r/min離心2min，上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，再準(zhǔn)確吸取0.5mL于棕色樣品小瓶中，待衍生化。

1.4.3柱前衍生化。為避免強(qiáng)光照射，向待衍生化的棕色樣品瓶中，分別加入0.25mLN-甲基咪唑(NMIM)和0.25mL三氟乙酸酐(TFAA)，立即蓋上瓶蓋，用手振蕩搖勻，避光衍生化20min后，進(jìn)行HPLC-FLD測(cè)定。

1.4.4檢測(cè)條件。WatersAlliancee2695/2475高效液相色譜儀-熒光檢測(cè)器(HPLC-FLD)；WatersSunFireTMC18色譜柱(5.0μm，4.6mm×150mm)；流動(dòng)相:乙腈∶水溶液(95∶5，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：熒光激發(fā)波長(zhǎng)365nm，發(fā)射波長(zhǎng)：475nm；進(jìn)樣量：10μL。在此條件下，甲維鹽的相對(duì)保留時(shí)間16min左右。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用外標(biāo)法定量。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.01g甲維鹽標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至100mL，配制成100mg/L的甲維鹽母液；以100mg/L標(biāo)準(zhǔn)品母液用乙腈逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.002、0.020、0.100、0.200、1.000、2.000、10.000mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用“1.4.3”的方法進(jìn)行衍生化，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，所對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性方程Y=58 715 037X-1 769 997，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，其中，Y為甲維鹽測(cè)定峰面積，X為甲維鹽進(jìn)樣濃度。

2.2方法靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度

2.2.1靈敏度。以最小添加濃度作為方法的最低檢測(cè)濃度(LOQ)，則甲維鹽在鮮煙葉、干煙葉和土壤中LOQ分別為0.004、0.008、0.000 5mg/kg。

2.2.2準(zhǔn)確度及精密度。用鮮煙葉、干煙葉和土壤的空白樣品分別進(jìn)行3個(gè)不同濃度的添加回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)5次。按樣品處理方法提取、凈化、衍生后用外標(biāo)法進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)添加濃度在0.004～1.000mg/kg時(shí)，鮮煙葉中甲維鹽平均添加回收率為90.7%～93.5%，RSD為2.4%～5.0%；當(dāng)添加濃度在0.008～0.200mg/kg時(shí)，干煙葉中甲維鹽平均添加回收率為90.5%～92.2%，RSD為2.9%～5.5%；當(dāng)添加濃度在0.000 5～0.1000mg/kg時(shí)，土壤中甲維鹽平均添加回收率為90.4%～92.5%，RSD為2.3%～4.9%(表1)。這表明該方法的準(zhǔn)確度及精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表1甲維鹽農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度及精密度

Table1Accuracyandprecisionofthedetectionmethodofemamectinbenzoateresidues

樣品Sample添加濃度Addedconcent-ration∥mg/kg平均回收率Averagerecoveryrate∥%RSD%鮮煙葉0.00490.75.0Freshtobaccoleaf0.10093.52.41.00093.22.8干煙葉0.00890.55.5Curedtobaccoleaf0.02092.24.30.20092.22.9土壤Soil0.000590.44.90.010091.43.00.100092.52.3

2.3甲維鹽在煙葉及土壤中的消解動(dòng)態(tài)于2014～2015年在山東青島、四川南昌進(jìn)行[14]。甲維鹽在山東、四川兩地?zé)熑~及土壤中的殘留消解結(jié)果表明，甲維鹽在煙葉和土壤中的消解曲線均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，其消解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。由表2可知， 甲維鹽在煙葉和土壤中的半衰期均較短，分別為4.4～5.4 和1.6～2.6d，降解速率較快。

2.4甲維鹽在煙葉中的最終殘留量2014～2015年的最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，3.4%甲維鹽懸浮劑按照2.250、3.375ga.i./hm2分別施藥2、3次，施藥間隔期7d，于最后一次施藥后7、14、21d采集煙葉樣品，并按照三段式烘烤工藝烘烤。山東、四川2年煙葉和土壤最終樣品中甲維鹽殘留量均小于方法LOQ(煙葉0.008mg/kg，土壤0.000 5mg/kg)。

表2　甲維鹽在煙葉和土壤中的消解動(dòng)態(tài)

3　結(jié)論

采用分散固相萃取凈化、柱前衍生、高效液相色譜-熒光法測(cè)定甲維鹽在煙葉及土壤中的殘留量，結(jié)果表明，該方法操作簡(jiǎn)便，有機(jī)溶劑用量少，符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)技術(shù)對(duì)靈敏度、準(zhǔn)確度及精密度的要求。

該試驗(yàn)對(duì)甲維鹽在煙葉和土壤中的殘留消解動(dòng)態(tài)及最終殘留量進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，甲維鹽在煙葉和土壤中降解速率較快，半衰期分別為4.4～5.4和1.6～2.6d。按照2.250和3.375ga.i./hm2于煙草旺長(zhǎng)中后期噴霧施藥2～3次，安全間隔期 7d時(shí)，烤后煙葉樣品中甲維鹽殘留量均低于0.008mg/kg。國(guó)際煙草合作研究中心(CORESTA)尚未規(guī)定甲維鹽在煙草上的指導(dǎo)性殘留限量。GB2763—2014規(guī)定阿維菌素在干辣椒中的最大殘留限量(MRL)為0.2mg/kg[15]。由于干辣椒和煙草的膳食結(jié)構(gòu)比例相似，以阿維菌素在干辣椒中的MRL(0.2mg/kg)為參考進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，甲維鹽在煙草上的使用劑量和方法用于煙草煙青蟲(chóng)的防治，其殘留量是安全的。

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DissipationandResidueofEmamectinBenzoateinTobaccoandSoilUsingHighPerformanceLiquidChromatographyCoupledtoFluorescenceDetection

XUJin-li，YOUXiang-wei*，WANGXiu-guoetal

(TobaccoResearchInstituteofCAAS，KeyLaboratoryofTobaccoPestMonitoringControlling&IntegratedManagement，Qingdao，Shandong266101)

[Objective]Toestablishahighperformanceliquidchromatographywithfluorescencedetection(HPLC-FLD)methodforthedeterminationofemamectinbenzoateresidueintobaccoleavesandsoil. [Method]Thesamplewasextractedbyacetonitrileandthencleanedupbydispersivesolidphaseextraction.AfterprecolumnderivatizationwithN-methylimidazoleandthreetrifluoroaceticanhydride，thederivativesweredeterminedbyHPLC-FLD. [Result]Intherangeof0.000 5-1.000mg/kg，theaveragerecoveriesofemamectinbenzoatewerehigherthan90%，withtherelativestandarddeviation(RSD) 2.3%-5.5%.Thelimitsofquantification(LOQ)ofemamectinbenzoateinfreshtobaccoleaves，curedtobaccoleavesandsoilwere0.004，0.008and0.000 5mg/kg，respectively.ThedissipationandresiduelevelsofemamectinbenzoateinShandongandSichuanin2014-2015wereinvestigatedusingtheestablishedmethod.Thefieldtrialsresultsshowedthatthehalf-livesofemamectinbenzoateintobaccoleavesandsoilwere4.4-5.4dayand1.6-2.6day，respectively.Whenappliedatthedosageof2.25and3.375ga.i./hm2for2-3times，theterminalresiduesofemamectinbenzoateincuredtobaccoleaveswithapre-harvestintervalof7dayswerelowerthan0.2mg/kg. [Conclusion]Thismethodhasthecharacteristicsofsimpleoperation，smalldosageoforganicsolvent，whichmeetstherequirementsofsensitivity，accuracyandprecisionofpesticideresiduesdetectiontechnology.

HPLC-FLD;Emamectinbenzoate;Tobaccoleaf;Soil;Residue;Degradation

徐金麗(1963- )，女，山東濰坊人，實(shí)驗(yàn)師，從事農(nóng)藥殘留方面的研究。*通訊作者，助理研究員，博士，從事農(nóng)藥殘留方面的研究。

2016-05-11

S482.3

A

0517-6611(2016)17-070-03