酶解法提取白鰱魚油的工藝研究及品質分析

駱 婷， 許學勤， 夏文水， 姜啟興， 許艷順

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

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酶解法提取白鰱魚油的工藝研究及品質分析

駱 婷， 許學勤， 夏文水， 姜啟興， 許艷順

(江南大學食品學院，江蘇無錫 214122)

[目的]為淡水魚加工副產物的綜合利用及淡水魚油的提取提供方法和依據。[方法]采用酶解法對白鰱腹部進行魚油提取，研究酶的種類、液固比、酶解溫度、pH和酶用量等因素對魚油提取率的影響，并對得到的粗魚油進行理化性質和脂肪酸組成分析。[結果]試驗表明，堿性蛋白酶對腹部魚油的提取效果最好，在液固比1.0∶1mL/g的條件下進行響應面優化得到最佳的工藝參數為：酶解溫度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，此條件下酶解3h得到魚油提取率為64.32%，魚油過氧化值為5.48mmol/kg，碘價為1 204.20g/kg，皂化價為169.21mg/g，酸價為3.56mg/g，其中二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的含量分別為6.54%和4.53%，n-3/n-6值為2.89。[結論]所得魚油的各項指標符合1級粗魚油標準，營養價值較高，應用前景廣闊。

魚油；酶解；提??；脂肪酸組成

作為全球淡水魚生產消費大國，我國的淡水漁業一直處于持續增長階段。根據中國漁業統計年鑒，2015年我國淡水養殖產量為2 935.76萬t，占淡水產品產量的92.74%[1]?，F有的淡水魚深加工主要集中于魚糜及魚糜產品的加工，其綜合利用率只有30%～50%，要提高淡水漁業的綜合產值、降低淡水魚制品的成本，就要對其加工下腳料進行充分的加工與利用[2]。

目前淡水魚加工下腳料主要用于低值魚粉的加工，并產生魚油等加工副產物，這兩者主要用于制作飼料和飼料添加物，魚油的綜合產量低且品質較差、附加產值低。與海水魚相比，淡水魚油的應用和研究較少，主要是因為淡水魚魚體組織中的魚油含量較低。根據GuipuLi等的研究，在對29種淡水魚、海水魚以及蝦的脂肪含量和脂肪酸組成進行比較發現，大多數淡水魚的n-3/n-6值要小于1，n-3多不飽和脂肪酸含量低于n-6，但還有一些大宗淡水魚，例如白鰱、鳙魚等具有接近海水魚油的n-3/n-6值[3]。

現在研究較多的魚油提取方法有蒸煮壓榨法、溶劑提取法、水酶法以及淡堿水解法等。研究工藝改進的主要目的在于提高提取率、減少加工過程中雜質對環境的污染[4]。采用添加外源酶的方法分解蛋白獲得魚油的方法稱為酶解法。酶解法一般采用商業經濟的食品級蛋白酶，是一種十分具有發展前景的提取方法，也是現在研究最為廣泛的提取方法之一。與其他提取方法相比，酶解法在提取效率以及能源重復利用率方面都具有一定的優勢。筆者選擇大宗淡水魚之一的白鰱作為試驗原料，研究不同酶解條件對白鰱腹部魚油提取率以及相關品質的影響，并對所得魚油進行性質分析和脂肪酸組成分析，為開發高價值的魚油產品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。原料：白鰱，購于華潤萬家超市(2.5～3.0kg),選用部位為腹部。主要試劑：乙醇、氯仿、碘化鉀、淀粉、冰醋酸、氫氧化鉀等，國藥集團化學試劑有限公司，試劑均為分析純；堿性蛋白酶，諾維信生物技術有限公司；胰蛋白酶、風味蛋白酶、胃蛋白酶，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設備。JB5374-91電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司；UV1000紫外-可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；UltraScanPro1166高精度分光測色儀，美國Hunterlab公司。

1.2方法

1.2.1原料預處理工藝。取新鮮的白鰱腹部，清洗干凈、去膜、打碎，冷凍備用。

1.2.2酶解法魚油提取工藝。取冷凍的魚腹部下腳料，于4 ℃條件下低溫解凍，按照一定的液固比加入蒸餾水進行打漿。將其水浴加熱到規定反應溫度后，添加稀鹽酸或稀氫氧化鈉調整pH，加入一定量的酶，并在反應溫度下進行酶解。到規定時間后，在95 ℃水浴下加熱10min進行滅酶，冷卻后在5 000r/min條件下離心20min，分離上層清油以及中層乳化層，將乳化層按照1∶3的比例加入正己烷并在35 ℃條件下靜置分層，將分離得到的有機相進行旋轉蒸發得到魚油，合并兩部分魚油，進行提取率的計算以及相關品質分析。

1.2.3提取率計算。魚油提取率按式(1)計算：

(1)

式中,R為魚油提取率(%)；m1為所得魚油質量(g)；m2為原料中魚油的質量(g)。

1.2.4理化指標的測定。皂化價測定：按GB/T5534—1998執行；過氧化值測定：按GB5538—2005執行；酸價測定：按GB/T5530—2005執行；碘價測定：按GB/T5532—1995執行。

1.2.5脂肪酸組成分析。采用氣相色譜法測定。樣品前處理：取適量油脂樣品于離心管中，加入2mL0.5mol/L的NaOH-甲醇溶液，置于60 ℃水浴加熱40min，冷卻后加入2mL25%BF3-甲醇溶液，繼續放入60 ℃水浴中進行酯化反應30min，冷卻后加入2mL正已烷振蕩，最后加入飽和NaCl2mL溶液振蕩，離心取上層有機相于離心管中進行脂肪酸組成分析。分析條件參照文獻[5]。

2　結果與分析

2.1蛋白酶種類對魚油提取率的影響在液固比為1.2∶1mL/g、酶添加量為10 000U/g的條件下，根據酶種類選擇合適的酶解pH，在最適反應溫度條件下反應3h，所得魚油的提取率見表1。

表1　不同蛋白酶對酶解效果的影響

從表1可以看出，在上述條件下，對于白鰱腹部下腳料中魚油的提取，堿性蛋白酶的提取率最高，同時堿性蛋白酶水解液中的蛋白回收率最高。從資源再利用以及經濟角度考慮，選用堿性蛋白酶作為下一步的酶解試驗用酶。

2.2加酶量對魚油提取率的影響在液固比1.2∶1mL/g、溫度55 ℃、pH8.5的條件下酶解3h，分別考察酶添加量4 000、6 000、8 000、10 000、12 000U/g時魚油提取率的變化情況。從圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，魚油提取率仍然呈現先增大后減小的趨勢。這是因為在底物未達到飽和的情況下，酶量的增加可以促進蛋白質的水解，當達到飽和之后，由于酶自身的水解或者抑制作用，酶解程度降低[6]，因而使油脂釋放不完全，導致提取率降低。結果表明，在酶添加量為8 000U/g時，所得魚油提取率最高。

圖1　不同酶添加量對魚油提取率的影響Fig.1　Effects of enzyme dosage on extraction rate of fish oil

2.3酶解溫度對魚油提取率的影響在液固比1.2∶1mL/g、酶添加量10 000U/g、pH8.5的條件下酶解3h，考察酶解溫度45、50、55、60、65、70 ℃條件下魚油提取率的變化情況。從圖2可以看出，在酶解溫度55 ℃以下時，溫度的升高使得魚油的提取率有較為明顯的提升。其原因可能是因為溫度升高使得酶活性得到提升，而且能夠加快體系內分子的熱運動，使得酶解效率提高，酶促反應更加完全。當溫度超過55 ℃之后，魚油提取率隨溫度的升高呈現下降的趨勢。這是因為蛋白酶本身作為一種大分子蛋白質，其結構特性也會受到溫度的影響，因而穩定性變差最終發生蛋白質變性，從而失去活性。此外，較高的溫度也會在一定程度上加快魚油的氧化，使魚油顏色變深、品質變差。結果表明，較為適宜的酶解溫度為55 ℃。

圖2　不同酶解溫度對魚油提取率的影響Fig.2　Effects of enzymolysis temperature on extraction rate of fish oil

2.4酶解pH對魚油提取率的影響在液固比1.2∶1mL/g、酶添加量10 000U/g、溫度55 ℃的條件下酶解3h，考察pH7.0、8.0、8.5、9.0、9.5以及10.0的條件下魚油提取率的變化情況。從圖3可以看出，隨著pH的增加，魚油提取率同樣呈現先增加后降低的趨勢。這是由于不同的酸堿性對于底物分子和酶分子的帶電性都有影響，同時酶分子的穩定性也會受到影響，因此在特定條件下，每種酶都有作用的最適pH。提取率最高時即為堿性蛋白酶在此條件下的最適pH，此時酶活性最高，酶解效果最好。結果表明，該反應的最適pH為8.5。

圖3　不同pH對魚油提取率的影響Fig.3　Effects of pH on extraction rate of fish oil

2.5液固比對魚油提取率的影響在酶添加量10 000U/g、溫度55 ℃、pH8.5的條件下酶解3h，分別考察液固比0.5∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.5∶1以及1.8∶1mL/g對魚油提取率的影響。從圖4可以看出，在一定范圍內，隨著體系中水添加量的增多，酶解效果增強，魚油提取率升高。這是因為體系中的水分可以幫助蛋白酶與底物充分接觸，使得酶解速度加快，酶解程度增加，同時也有利于脂肪的溶出；而超過一定含量，水分的增加就會導致提取率的降低，這可能是因為底物濃度降低、酶解反應不完全導致的。結果表明，液固比在1.0∶1mL/g的條件下，魚油提取率最高，為61.20%。

圖4　不同液固比對魚油提取率的影響Fig.4　Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of fish oil

2.6響應面優化試驗根據上述的單因素試驗結果，選擇酶解溫度、酶解pH以及加酶量進行3因素3水平的響應面優化試驗，因素水平設計見表2。根據表2的設計進行3因素3水平的響應面優化試驗，以魚油提取率為考察指標，所得試驗結果見表3。

響應面試驗所得回歸方程為：Y(%)=64.92-3.71X1+ 0.97X2+ 1.67X3-0.41X1X2-0.53X1X3+ 0.27X2X3-7.87X12-3.16X22-5.77X32。方差分析顯示，F模型=94.59，P模型< 0.000 1**；FX1=148.74,PX1< 0.000 1**；FX2=10.24，PX2=0.015 1*；FX3=30.24，PX3=0.000 9*；FX1X2=0.89，PX1X2=0.377 4；FX1X3=1.54,PX1X3=0.255 3；FX2X3=0.38,PX2X3=0.557 0;FX12=352.83，PX12< 0.000 1**；FX22=56.94，PX22=0.000 1*；FX32=189.63，PX32< 0.000 1**；F失擬=0.52，P失擬=0.691 0。由此可見，回歸方程極顯著，失擬不顯著，說明所得方程擬合性較好，能夠較好地預測試驗結果。根據F值可以看出，所測3個因素對于魚油提取率的影響大小依次為：酶解溫度、酶解pH、酶添加量。其中因素之間的交互作用影響見圖5、6和7。從3D曲線以及等高線橢圓弧度來看，酶解溫度對于白鰱腹部魚油的提取率影響最大，曲線變化最為顯著，在溫度一定的條件下，圖7中的等高線呈橢圓形，說明pH和加酶量之間的交互作用對魚油的提取率影響較大。

表2響應面3因素3水平設計

Table2Threefactorsandthreelevelsofresponsesurfaceexperimentaldesign

水平Level因素Factor溫度(X1)Temperature∥℃加酶量(X2)Enzymedosage∥U/gpH(X3)15070008.025580008.536090009.0

表3　響應面分析試驗及結果

利用響應面優化得到試驗范圍內的最優提取條件為：酶解溫度53.77 ℃，加酶量8 176.45U/g，pH8.58，理論魚油提取率為65.59%，為方便實際操作，將上述條件修正為酶解溫度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，在此條件下進行3次平行驗證試驗，所得平均魚油提取率為64.32%。

圖5　溫度和加酶量對魚油提取率的影響Fig.5　Effects of temperature and enzyme dosage on extraction rate of fish oil

圖6　溫度和pH對魚油提取率的影響Fig.6　Effects of temperature and pH on extraction rate of fish oil

2.7粗魚油的理化性質分析從表4可以看出，其中所有指標均達到了國家1級粗魚油的標準，魚油品質較好。其中魚油的過氧化值較高，可能與酶解時間較長發生氧化作用有關，另外還含有一些蛋白質、色素等雜質，會影響魚油的進一步加工利用，因此還需要進行一系列精煉過程才能用于工業生產或食用。

圖7　pH和加酶量對魚油提取率的影響Fig.7　Effects of pH and enzyme dosage on extraction rate of fish oil

2.8粗魚油的脂肪酸分析從表5可以看出，白鰱魚油中的19種脂肪酸以長鏈脂肪酸為主，其中單不飽和脂肪酸的含量為43.01%，多不飽和脂肪酸的含量為28.82%，EPA和DHA的含量分別為6.54%和4.53%。n-3/n-6 高達2.89，高于文獻報道的1.7[7]和2.0[8]，其中原因可能與所選原料的來源、部位以及提取方法有關。研究表明，合理的n-3/n-6多不飽和脂肪酸比例對機體健康有重要意義[9]，n-3/n-6比例較高的油脂可以起到增強免疫反應和非特異性抗性的作用，而n-3脂肪酸能夠將低密度和極低密度膽固醇轉化為高密度脂蛋白，從而使膽固醇從細胞內轉移到肝臟中，使膽固醇被肝臟代謝[10]。該試驗提取得到白鰱腹部魚油具有較高的n-3/n-6值，是一種品質較好且具有廣闊開發前景的功能性油脂。

表4　白鰱粗魚油的理化性質

表5　白鰱粗魚油的脂肪酸組成

3　結論

以白鰱腹部下腳料為原料，采用酶解法制備魚油時，蛋白酶種類的選擇以及酶解時的工藝條件都會對魚油的提取率產生影響。通過試驗確定，在酶解時間為3h的前提下，最優的提取條件為：液固比1.0∶1mL/g，酶解溫度54 ℃，加酶量8 200U/g，pH8.6，此條件下魚油的提取率為64.32%。各項理化指標均符合國家1級粗魚油標準，且EPA和DHA的含量分別為6.54%和4.53%，高于白鰱魚頭魚油[11]，n-3/n-6值為2.89，明顯高于白鰱內臟魚油的2.0[12]，這與原料來源以及采取部位有關，但表明所得魚油的營養價格較高。此工藝過程較為簡單，提取條件溫和，資源回收利用率較高，所得魚油品質較好，可作為提高淡水魚加工附產值的有效方法。

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TechnologyResearchandQualityAnalysisofFishOilfromSilverCarpbyEnzymeHydrolysisMethod

LUOTing,XUXue-qin,XIAWen-shuietal

(CollegeofFood,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122)

[Objective]Toprovidemethodandreferencefortheextractionoffreshwaterfishoilandthecomprehensiveutilizationofprocessingby-productsoffreshwaterfish.[Method]Fishoilwasextractedfromthebellypartofsilvercarpbyenzymehydrolysismethod.Weresearchedtheeffectsofenzymetype,liquid-solidratio,hydrolysistemperature,pHandenzymedosageontheextractionrateoffishoil.Then,thephysicochemicalpropertyandfattyacidcompositionofobtainedcrudefishoilwereanalyzed.[Result]Alkalineproteasehadtheoptimalextractioneffectsonfishoilfrombellypart.Undertheconditionof1.0∶1liquid-solidratio,theresponsesurfaceoptimizationwascarriedout.Theoptimaltechnologywasasfollows： 54 ℃hydrolysistemperature,8 200U/genzymedosage,pH8.6and3henzymolysistime.Underthiscondition,theextractionrateoffishoilwas64.32%.Thefishoilperoxidevaluewas5.48mmol/kg;iodinevaluewas1 204.2g/kg;saponificationvaluewas169.21mg/gandacidvaluewas3.56mg/g.Amongthem,contentsofEPAandDHAwere6.54%and4.53%,respectively.Then-3/n-6was2.89.[Conclusion]Thefishoilindexesreachthefirstgradestandardofcrudefishoil,whichhashighnutritionalvalueandbroadapplicationprospect.

Fishoil;Enzymolysis;Extraction;Fattyacidcomposition

國家大宗淡水魚產業技術體系建設專項項目(CARS-46)。

駱婷(1990- )，女，山東蓬萊人，碩士研究生，研究方向：食品加工。

2016-04-06

S986

A

0517-6611(2016)17-096-05