可可西里豆科植物根瘤內生細菌系統發育及促生特性研究

王金平， 齊雅琳， 韓素貞

(首都師范大學生命科學學院， 北京 100048)

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可可西里豆科植物根瘤內生細菌系統發育及促生特性研究

王金平， 齊雅琳， 韓素貞*

(首都師范大學生命科學學院， 北京 100048)

[目的]研究可可西里豆科植物根瘤內生細菌系統發育、抗菌特性和分泌IAA能力。[方法]對分離自可可西里的豆科植物OxytropisfalcateBunge的根瘤內生細菌進行了16S rDNA全序列分析、抗菌試驗以及IAA分泌能力檢測。[結果]16S rDNA全序列分析結果表明，17株供試菌有12株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)；有1株供試菌CNU097903與短桿菌屬Brevibacteriumhalotolerans處于同一分支，相似性達99.9%；菌株CNU097916與Agrobacteriumtumefaciens處于同一分支，相似性達99.8%；菌株CNU097914和CNU097915處于一個單獨的分支，其系統發育地位有待進一步確定。抗菌試驗結果表明，10株供試菌對G-黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)、G+金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、番茄灰霉(Botrytiscinerea)和瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)4種指示菌表現出不同程度的抗性:菌株CNU097906抗菌譜最廣，對4種指示菌都有抗性；菌株CNU097902對番茄灰霉的抗性最強，抑菌圈直徑達38 mm；菌株CNU097908對黃單胞桿菌的抗性最強，抑菌圈直徑達38 mm；菌株CNU097901對金黃色葡萄球菌的抗性最強，抑菌圈直徑達41 mm。采用 Salkowski 比色法測定供試菌分泌 IAA 的能力，結果表明，10供試菌都具有分泌IAA的能力。[結論]該研究為進一步探究內生細菌的生防機制和途徑奠定基礎，為可可西里內生菌資源的研究和合理開發利用提供理論依據。

根瘤內生菌；系統發育；抗菌活性；IAA

Endophytic nodule bacteria; Phylogeny; Antimicrobial activity; IAA

近年來，從根瘤中分離到非共生菌的報道越來越多[1-3]。內生菌對宿主植物的主要作用有促進生長、抗蟲害、抗病害、抗逆 性、促進次生代謝產物合成等[4]。可可西里位于我國西北部，是青藏高原上最大的高寒地區，具有海拔高、年降雨量較少、日照時間長和溫差較大等高寒氣候特征，有“人類生存禁區”之稱。此前對該地區豆科植物根瘤內生菌的研究較少，筆者對可可西里豆科植物OxytropisfalcateBunge根瘤內生細菌的系統發育及其抗菌特性和分泌IAA能力進行研究，旨在豐富根瘤菌內生菌種質資源，為其應用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料對采集自青海可可西里的豆科植物OxytropisfalcataBunge根瘤進行表面滅菌[5]，用無菌鑷子將其夾碎，于YMA 平板劃線分離，置于20 ℃培養2～6 d后，挑取單菌落劃線純化。獲得的單菌落即為供試菌，用20%甘油保存于-80 ℃冰箱待用。選用供試菌株共17株，詳情見表 1。

1.216S rDNA 全序列分析 DNA提取步驟參考文獻[6]，以總DNA為模板，引物P1為5′-AGAGTTTGATCCTGGCT-

表1　供試菌詳情

CAGAACGAACGCT-3′，其序列對應于E.coli16S rDNA 基因第8～37 堿基位置；P6為5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′，其序列為對應第1 479～1 506 堿基位置[7]。16S rDNA PCR方法步驟參考文獻[8]。PCR產物經電泳檢測后交由上海生工生物公司進行測序，將測得序列與GenBank中已知種序列通過MEGA 5.0 中的ClustalW 進行多序列比對。系統發育樹的構建采用鄰接法(Neighbour-joining)[9]，相似性計算采用Kimura two-parameter模型[10]，自展值(Bootstrap)[11-12]為1 000并計算各菌株之間的相似性距離。

1.3抑菌試驗指示菌采用G-黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)、G+金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、番茄灰霉(Botrytiscinerea)和瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)。黃單胞桿菌和金黃色葡萄球菌用液體牛肉膏蛋白胨培養基振蕩培養過夜，番茄灰霉和瓜果腐霉用液體馬鈴薯培養基振蕩培養2～3 d。

將供試菌接種于200 mL YMA液體培養基，130 r/min、20 ℃振蕩培養3～5 d。將發酵液8 000 r/min離心5 min后用0.22 μm過濾膜過濾后，40 ℃、0.02 bar懸蒸至發酵液剩余2～3 mL，將剩余發酵液于40 ℃烘箱烘干，溶于20 mL甲醇，保存待用。

取 100 μL指示菌液分別均勻涂布于YMA平板，平板中放入3個滅菌牛津杯，分別加入200 μL濃縮發酵液、未濃縮發酵液和甲醇，置于20 ℃培養3 d后用游標卡尺測量抑菌圈大小，計算平均值。

1.4供試菌分泌IAA能力的檢測采用 Salkowski 比色法測定供試菌分泌 IAA 的能力[12]。

2　結果與分析

2.116S rDNA 全序列分析對17株供試菌進行了 16S rDNA 全序列測定，并根據測序結果構建了系統發育樹狀圖(圖1)。由圖1可知，17株供試菌有12株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中，CNU097902、CNU097904與Bacillusaryabhattai的相似性為100%，CNU097909、 CNU097911和CNU097912與Bacillussubtilis的相似性為100%，CNU097905與Bacillusaxarquiensis的相似性為99.9%， CNU097910、CNU097913、CNU097908、CNU097907和CNU097906與Bacillusmojavensis聚在一起，相似性達100%；CNU097901在Bacillus中處于一個單獨的分支，有可能是一個新種，有待進一步試驗確定。有1株供試菌CNU097903與短桿菌屬Brevibacteriumhalotolerans處于同一分支，相似性達99.9%。菌株CNU097916與Agrobacteriumtumefaciens處于同一分支，相似性達99.8%。菌株CNU097914和CNU097915處于一個單獨的分支，其系統發育地位有待進一步確定。

圖1　根瘤內生菌16S rDNA全序列系統發育樹狀圖Fig.1　Phylogenetic tree of the complete sequence of 16S rDNA in the root nodule

2.2部分內生菌的抗菌特性采用2種農作物常見病害真菌瓜果腐霉和番茄灰霉及2種農作物常見病害細菌金黃色葡萄球菌和黃單胞桿菌作為供試菌，測定10株供試菌抗真菌和抗細菌活性，結果見表2。從表2可以看出，10株供試菌對4種指示菌表現出不同程度的抗性。菌株CNU097906抗菌譜最廣，對4種指示菌都有抗性；菌株CNU097902對3種指示菌有抗性，僅對瓜果腐霉不敏感；菌株CNU097901和 CNU097903對瓜果腐霉和金黃色葡萄球菌有抗性，菌株CNU097905對瓜果腐霉和黃單胞桿菌有抗性；菌株CNU097904、CNU097909和 CNU097910 對番茄灰霉有抗性，

注：A.CNU097905 抗番茄灰霉;B.CNU097903 抗金黃色葡萄球菌。　Note:A.CNU097905 resistance to Botrytis cinere,B.CNU097903 resistance to Staphylococcus aureus.圖 2　供試菌抑菌圈Fig.2　Bacterial inhibition zone

菌株CNU097907和CNU097908對黃單胞桿菌有抗性。供試菌抑菌圈見圖2。菌株CNU097902對番茄灰霉抗性最強，抑菌圈直徑達38 mm；菌株CNU097908對黃單胞桿菌的抗性最強，抑菌圈直徑達38 mm；菌株CNU097901對金黃色葡萄球菌抗性最強，抑菌圈直徑達41 mm。

表2　10株供試菌對4種常見病菌的抑菌率

2.5IAA產生能力由圖3可知，10供試菌都具有分泌IAA的能力。各菌株分泌IAA的能力有差異；用NA培養基培養菌株分泌IAA的量少于用King2培養的菌株分泌IAA的量。供試菌無論用NA還是用King2都能分泌IAA，色氨酸是供試菌產生IAA的重要前體物質。

注：1～20依次為CNU097901～CNU097910(兩兩一組前為NA培養，后為KING 2 培養)，21為標準品對照，22為空白對照。Note:1-20.CNU097901- CNU097910(two of a group,the left was NA culture,the right was KING 2 culture,21 was standard CK,22 was blank CK.圖3　IAA分泌能力測試結果Fig.3　Detection results of secreting IAA capacity

3　討論

3.1根瘤內生細菌的多樣性許多研究者從豆科植物根瘤內分離出多種根瘤內生細菌，它們大多分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等[13-15]。代金霞等[16]從荒漠植物檸條根瘤內分離到40 株內生細菌，其中，21株屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，7株屬于固氮螺菌屬(Inquilinus)，3株屬于申氏桿菌屬(Shinella)，2株屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)。鄧振山[17]從西北地區苦馬豆根瘤中分離到的65株內生細菌分別屬于副球菌屬(Paracoccus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、固氮螺菌屬(Inquilinus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、沙雷氏菌屬(Serratia)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、鏈霉菌屬(Strptomyces)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、短短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、Lysinibacillus、葡萄球菌屬(Staphylococcus)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，其中，芽孢桿菌為優勢菌，占所分離菌株的58.5%。龔明福等[18]對新疆苦豆子根瘤內生細菌進行調查，分離出的60株菌分屬于Bacillussp.和Aerobacillussp。由此可知，根瘤內生細菌具有極大的多樣性，而芽孢桿菌屬是根瘤內優勢內生細菌。

該研究從青海可可西里豆科植物OxytropisfalcataBunge根瘤分離了17株內生細菌，除2株分類地位需進一步試驗確定外，12株屬于芽孢桿菌屬，1株屬于短桿菌屬(Brevibacterium)，2株屬于土壤桿菌屬(Agrobacterium)，與目前報道結果相一致。芽孢桿菌抗逆性強，其在高寒地區豆科植物根瘤內占優勢地位，可能是與環境相適應的結果。

3.2根瘤內生細菌的促生作用根瘤內生細菌在根瘤菌與豆科植物共生固氮過程中，與宿主、根瘤菌相互作用，在復雜環境條件下可能對根瘤菌的共生固氮具有促進作用。2002年，Bai等[19]發現部分Bacillus屬的菌株在與B.japonicum共同接種大豆時，能夠增加大豆重量。Mhamdi等[20]研究發現，土壤桿菌屬的細菌影響根瘤菌的結瘤特性，它們能通過與根瘤菌共接種侵入根瘤。某些根瘤內生細菌可以產生植物生長調節物質，如乙烯、生長素(IAA)、細胞激動素等，促進植物根系發育，進而有利于根瘤菌與豆科植物的根系相互作用并共生結瘤固氮[21]。李麗[22]發現從甘草根瘤中分離到的內生細菌中，有75%的菌株具有產生IAA的能力，且Agrobacterium屬的菌株最強。根瘤中分離到的內生細菌普遍具有抗菌活性[23]，潘巧娜[24]發現從黃芪根瘤中分離到的內生菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用明顯高于大腸桿菌。Velazhahan 等[25]指出,植物內生細菌在宿主中可以產生具有拮抗性、競爭性的次級代謝產物或酶類,能夠直接或間接地抑制或殺死病原菌。

該研究抗菌試驗結果表明，10株供試菌對G-黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)、G+金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、番茄灰霉(Botrytiscinerea)和瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)4種指示菌表現出不同程度的抗性:菌株CNU097906抗菌譜最廣，對4種指示菌都有抗性；菌株CNU097902對番茄灰霉抗性最強，抑菌圈直徑達38 mm；菌株CNU097908對黃單胞桿菌的抗性最強，抑菌圈直徑達38 mm；菌株CNU097901對金黃色葡萄球菌抗性最強，抑菌圈直徑達41 mm。這表明試驗菌株的抗菌譜較廣，對植物病原真菌和細菌均有抑制作用。分離到的試驗菌株對金黃色葡萄球菌、黃單胞桿菌、 瓜果腐霉、番茄灰霉的抑制活性不同。其中，CNU097902對番茄灰霉以及CNU097908對黃單胞桿菌的抑制率都達40%以上。從菌株數量和抑制率看，試驗菌株對于瓜果腐霉的抑制作用相對較低。采用 Salkowski 比色法測定供試菌分泌 IAA 的能力，結果表明，10供試菌都具有分泌IAA的能力。

特殊生境下植物內生菌的研究具有重要的理論意義和應用價值，是極具開發潛力的微生物資源；內生菌所發揮的重要生理和生態作用己在農業、林業和醫藥領域表現出來，內生菌及其次生代謝產物己成為發現新的天然藥物和生物活性成分的重要資源庫[26]。對青海可可西里OxytropisfalcataBunge根瘤內生菌抑菌活性和IAA分泌能力的研究，旨在為進一步探究內生細菌的生防機制和途徑奠定基礎，為可可西里內生菌資源的研究和合理開發利用提供理論依據。

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Study on the Phylogeny and Growth Promoting Effect of Endophytes Isolated from Legume Root Nodules in Hoh Xil

WANG Jin-ping,QI Ya-lin,HAN Su-zhen*

(College of Life Science,Capital Normal University,Beijing 100048)

[Objective] The aim was to study the phylogeny,antimicrobial activity and secreting IAA capacity of endophytes isolated from legume root nodules in Hoh Xil.[Method] The endophyte strains isolated from the nodules ofOxytropisfalcateBunge in Hoh Xil were used to do the 16s sequences analysis,antimicrobial test and IAA detection.[Result] The result of 16s rDNA sequence analysis showed that 12 of 17 test strains belong to Bacillus.CNU097903 and Brevibacterium halotolerans,CNU097916 and Agrobacterium tumefaciens were at the same branch respectively,which similarity were as high as 99.9% and 99.8%.CNU097914 and CNU097915 were in a separate branch and their system development status remained to be further confirmed.The antimicrobial experiment result showed that 10 strains had the different degrees of resistance to Xanthomonas campestris,Staphylococcusaureus,Botrytiscinerea,andPythiumaphanidermatum.CNU097906 had the highest resistant spectrum which could resist to all 4 indicator bacteria.CNU097902 and CNU097908 had the strongest resistance toBotrytiscinerea,Xanthomonascampestrisrespectively and the bacteriostatic circle of 38 mm in diameter.CNU097901 had the strongest resistance forStaphylococcusaureus,and the bacteriostatic circle of 41 mm in diameter.The Salkowski colorimetric method showed that all the 10 selected strains had the ability to secrete IAA.[Conclusion] The study lays a foundation for further research on prevention mechanism and ways of endophytic bacteria,provides theoretical basis for research of endophytic bacteria in Hoh Xil and rational decelopment.

A

0517-6611(2016)17-177-04

王金平(1988- )，男，山東日照人，碩士研究生，研究方向：細菌分類。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導師，從事細菌分類研究。

2016-05-19

S 432.4+2