鐵離子引起的DNA電荷逆轉和凝聚

郭子龍,王艷偉,楊光參

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

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鐵離子引起的DNA電荷逆轉和凝聚

郭子龍,王艷偉*,楊光參*

(溫州大學物理與電子信息工程學院，浙江 溫州 325035)

摘要：在生物體中，DNA會凝聚成緊密結構，對于遺傳信息的儲存和轉錄有重要意義。對于DNA的凝聚以及伴隨的電荷逆轉已經有了比較深入的研究，這些研究大多集中于一些水解性較弱的離子，而對于那些易水解對于溶液pH影響較大的金屬離子(例如鐵離子)的研究較少。本文系統地研究了鐵離子引起的DNA電荷逆轉和凝聚，通過與DNA在三氯六氨絡合鈷凝聚的對比，探索了鐵離子引起的DNA的電荷逆轉和凝聚的可能機制。

關鍵詞：鐵離子；DNA；電荷逆轉；凝聚

DNA作為一種重要的生物大分子，在體液環境中帶有較高的負電荷，并且被溶液中的帶有正電的平衡離子所包圍著。在DNA參與的生理過程中，平衡離子與DNA之間的相互作用發揮著至關重要的作用。例如:在真核細胞內，帶有大量正電的組蛋白會使DNA發生凝聚，并且組蛋白作為凝聚核；當這個凝聚體系周圍的鹽溶液的濃度升高時，凝聚會受到抑制，形成相對松散的凝聚結構[1-2]。帶電聚電解質(例如DNA和蛋白質)與溶液中多價平衡離子作用會導致兩種相互伴隨的現象：凝聚和電荷逆轉。對于DNA的電荷逆轉和凝聚現象的深入研究不僅詮釋了DNA如何參與生理過程，并且各種凝聚劑對于DNA的電荷逆轉作用在基因轉染過程中也已經有了廣泛的應用[3]。

DNA的電荷逆轉指的是，帶負電DNA吸附溶液中的帶有異種電荷的平衡離子，平衡離子的價態達到三價以上，便可能會使大分子表面帶有的凈電荷的電性發生變化[4]。在正價離子的作用下，DNA本身的形貌也會發生變化，帶有負電的基因片段之間會相互吸引，線型的DNA會凝聚成球形、桿狀或是“面包圈”等形狀[5-6]。這兩種現象是相互伴隨出現的，當DNA的表面的電荷被平衡離子中和為0 的時候，相應的測量的DNA的凝聚力應該是最大的[7]。最近幾十年，相當多的實驗研究了DNA的電荷逆轉，所使用的手段包括動態光散射(dynamiclightscattering,DLS)、熒光電泳(fluorescentmicroscopyandsinglemoleculeelectrophoresis)和原子力顯微鏡(atomicforcemicroscopy,AFM)。動態光散射和熒光電泳主要測量溶液中大分子的電泳遷移率和Zeta電位情況，從而確定DNA表面的凈電荷量。Luan等[8]的研究指出，電泳遷移率的逆轉是可以充分說明DNA表面電荷逆轉的。被廣泛接受的結論是三價以及高于三價的平衡離子可以引起凝聚現象，但是并沒有確定的實驗現象表明三價離子可以引起電荷逆轉現象。

我們詳細地研究了不同濃度的鐵離子溶液中的DNA的電泳遷移率，以及在相應濃度下的DNA的凝聚現象，并且與三氯六氨合鈷的溶液中的DNA電泳遷移和凝聚做了對比，發現鐵離子引起的DNA的凝聚和電荷逆轉，除了鐵離子的價態，溶液的pH也是重要的影響因素。

1　原理

常用于研究DNA凝聚和電荷逆轉的凝聚劑包括三氯六氨合鈷、精胺(spermine)和亞精胺(spermidine)[9]。之前對于DNA的電荷逆轉的研究主要使用的是一些水解較弱的離子，例如 [Ru(NH3)6]3+和[Fe(CN)6]3+等正價離子的絡合物或是聚胺類物質[10]。二價的鎂離子本身不會引起DNA的凝聚，但向溶液中加入高分子(聚乙二醇)也會使DNA發生凝聚[11]。當引起DNA凝聚的離子是兩性離子的時候，溶液pH會對于凝聚產生較大的影響[12]。即使是精胺、亞精胺這類酸度系數(pKa)值較高的離子在作為凝聚劑時，溶液pH的升高也會抑制DNA的凝聚[13]。在不同pH的水溶液中，鐵離子存在如下的水解過程：

(1)

這種水解過程一方面降低了溶液中鐵離子的有效電荷，另一方面溶液中的氫離子的濃度會有所升高，會抑制以上的水解過程。水解過程中，溶液的pH會下降。當溶液的pH低于DNA的等電點時，DNA的溶解度會下降，也伴隨著變性的發生。另一方面，溶液的pH也影響著鐵離子在水溶液中的價態，鐵離子的pK0=2.2，pK1=3.5，pK2=6.0。研究表明，在較低的溶液pH環境中的整條DNA趨于變性[14]。由于堿基對的暴露，堿基對會在較低pH的溶液中帶有正電荷(DNA的等電點在4到4.5之間)。在這種情況下，DNA是否會正常的電荷逆轉或者凝聚很少有相關研究涉及，這類實驗在理論解釋中也存在一定空白，現有的解釋DNA電荷逆轉或是凝聚的理論[15](Manning)都是以DNA作為一個帶有面電荷密度為-1.44×10-19C/nm2的桿狀模型去研究的，當DNA由于溶液pH發生變化時帶電量變化或DNA變性時與平衡離子的相互作用并無相關理論涉及，所以我們對于鐵離子引起的DNA的電荷逆轉和凝聚的研究有重要的理論和實踐意義。

2　實驗方法及材料

2.1實驗材料

實驗中使用的氯化鐵、三氯六氨合鈷([Co(NH3)6]3+，cobalthexammol，Cohex)和TRIS(hydroxymethylaminoethane)等藥品都購自Simga公司；使用的DNA統一為λ-phageDNA(48502bp),購自NewEnglandBiolabs；在磁鑷實驗中使用的PBS磷酸緩沖液含有10mmol/L的磷酸根，140mmol/L的鈉離子，pH為8.0。實驗中所有溶液使用去離子水配置，采用Milli-QWaterPurificationSystem(MilliporeCorporation,American)制備純化處理。所有的實驗至少重復兩次，以保證其可重復性。

2.2DNA電泳遷移率的測量

采用動態光散射測量技術測量DNA在不同濃度的凝聚劑中的電泳遷移率，使用的設備為MalvernZetasizernanoZS90。Zeta電位()可以通過對于電泳遷移率的測量計算得到，Zeta電位反映的是帶電大分子在溶液中的粘滯層的帶電量和所帶電荷的電性[16]。我們在實驗過程中使用了1mmol/L，pH=8.0的TRIS緩沖液，使鐵離子等水解引起的pH變化適當減弱，以便我們觀察不同濃度的鐵離子溶液對于DNA電泳遷移率的影響。鐵離子、鑭離子和三氯六氨合鈷使溶液pH變化程度見表1。

表1　金屬陽離子溶解在1 mmol/L的TRIS緩沖液的pH變化

2.3磁鑷裝置

圖1　磁鑷裝置原理Fig.1　Schematic diagram of magnetic tweezers

凝聚力測量采用橫向磁鑷設備如圖1所示，在磁鑷實驗中我們在λ-phageDNA的兩端分別修飾帶有單鏈的12個堿基對的寡核苷酸，分別帶有生物素和地高辛(3’biotin-cccgccgctgga和3’digoxygenindig-tccagcggcggg)[17]。在蓋玻片側壁用砂紙磨光并修飾抗地高辛與DNA帶有地高辛的一端連接，DNA另一端與修飾有鏈親和素的順磁球連接。觀測順磁球的布朗運動便可求得對于DNA施加的拉力[18]。這樣操作相當于給DNA一端裝上了可以操作的“手柄”。詳細的實驗操作可見實驗小組之前發表的文章[11，19]。整個連接系統處于PBS溶液中，為了排除鈉離子對于實驗的影響，我們在沖入實驗所用離子之前使用300μL的1mmol/LTRIS緩沖液以10μL/min的速度沖洗實驗用的樣品槽，樣品槽的容量大約是130μL左右。

3　實驗結果

3.1DNA電泳遷移率測量結果

圖2中比較了不同濃度的鐵離子和Cohex引起的DNA的電泳遷移率的變化。DNA電泳遷移率隨著Cohex濃度的增大而升高，但并不會發生電荷逆轉。而DNA在鐵離子溶液中時，隨著鐵離子濃度的升高，DNA的電泳遷移率發生了明顯的改變。在0.01mmol/L和0.1mmol/L的時候，DNA在鐵離子溶液中的遷移率遠低于在鈷離子溶液中。當濃度升高到0.5mmol/L以上時，DNA電泳遷移率明顯升高，并且發生電荷逆轉。

圖2　不同濃度的鈷離子六胺絡合物和鐵離子對于DNA電泳遷移率的影響Fig.2　 Impact of different concentrations cobalt hexamine and ferric ion on electrophoretic migration rate of condensed DNA

3.2DNA力譜結果

圖3a為DNA在PBS緩沖液中，最初施加在DNA上的拉力為5.6pN，每隔2min施加在DNA的拉力減小一次。圖3b為DNA在1mmol/L的Cohex溶液中，以同樣的方式減小對于DNA的拉力。圖3c為DNA受到的拉力減小的速度更慢，在pH=3水溶液中得到的力譜。圖3d為DNA在1mmol/L，pH=3的Cohex溶液中發生凝聚，減小力的過程與(c)相同。我們可以發現相對無多價離子的對照(圖3a)來說，加入Cohex溶液中的DNA在大約700s時的(圖3b中箭頭所示)長度發生了突然的減小，此時作用在DNA上的拉力(4.5pN)我們稱之為凝聚力，凝聚力的大小為DNA的自由能和長度之比。圖3c顯示溶液的pH降到3.0，DNA上施加的拉力慢慢減小時，DNA并不會因為溶液pH的降低發生凝聚；而在圖3d中，DNA處在1mmol/L的Cohex溶液中，pH為3.0，此時DNA發生了凝聚，主要由于部分DNA發生變性，DNA凈電荷量的減少，使DNA剛性受到影響，此時DNA凝聚不再有圖3b中那樣的臺階狀的凝聚。已經有研究[20]表明，當溶液的pH較低時，常溫下DNA會發生變性。

圖3　DNA力譜圖Fig.3　DNA force spectrum

圖4a為DNA在0.1mmol/L的鐵離子溶液中的力譜圖，此時DNA在鐵離子溶液中并無明顯的凝聚現象。圖4b為DNA在1mmol/L的鐵離子溶液中的力譜圖。圖4c顯示當溶液中鐵離子的濃度上升到10mmol/L的時候，對DNA的拉力為18.7pN并且在施加的拉力未減小的情況下DNA發生了凝聚，DNA的長度隨著時間的推移而變短。此時溶液的pH為2.35，溶液中的鐵離子水解較弱，大部分應該以Fe3+的形式存在。圖4d顯示在10mmol/L的鐵離子溶液中，DNA收縮達到穩定后，我們繼續減小施加在DNA上的拉力，DNA繼續凝聚。這主要因為溶液的pH低于DNA的等電點時，DNA發生了變性。圖2中，1mmol/L鐵離子溶液中電泳遷移率為正，表明溶液中DNA的凈電荷為正；但此時DNA并未發生凝聚，二價或三價離子本身并不能使DNA發生如此明顯的電荷逆轉，說明部分DNA變性，堿基此時帶有正電荷。這也可以很好地解釋在1mmol/L鐵離子溶液中的，DNA在更大拉力的作用下長度相對于0.1mmol/L時更短。此時溶液中存在兩方面的機制使DNA發生凝聚，一方面溶液中的三價的鐵離子濃度較高，會使DNA發生凝聚；另一方面由于溶液的pH較低，使DNA發生了變性，堿基在溶液較低pH的作用下帶有正電荷提高了電荷補償率，從而使DNA發生凝聚。

圖4　DNA在鐵離子溶液中的力譜圖Fig.4　Force spectrum of DNA in ferric ion solution

在我們的實驗中，DNA有鐵離子引起的凝聚僅僅發生在濃度為10mmol/L時，此時溶液pH較低，DNA發生變性，與pH為3.0時六氨合鈷所引起的DNA凝聚較為相似；與pH為8.0時，三價離子引起的DNA凝聚不同，凝聚過程不再帶有臺階狀的力譜。

4　結論

DNA在0.1mmol/L的鐵離子溶液中并不會發生電荷逆轉或凝聚，此時溶液中鐵離子由于水解主要以Fe(OH)2+的形式存在；當鐵離子的濃度提高到1mmol/L時，由于DNA部分發生變性且此時溶液的pH低于等電點，所以可以觀測到DNA的電荷逆轉和初始長度的縮短，并不會發生凝聚；當鐵離子濃度上升到10mmol/L的時候，由于此時溶液中存在三價Fe3+且pH低于等電點，所以DNA會發生明顯的凝聚現象，這種凝聚不僅是與三價離子引起的電荷補償有關，DNA的變性也使凝聚的力譜發生了改變。

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DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.04.018

收稿日期：2016-04-19

基金項目：國家自然科學基金(11274245, 10974146, 11304232, 11444006)

作者簡介：郭子龍，男，碩士研究生，研究方向為生命現象中的凝聚態物理。 *通信作者，楊光參，Email:yanggc@wzu.edu.cn; 王艷偉，Email:wangyw@wzu.edu.cn

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1002-4026(2016)04-0093-06

Ferric ion induced DNA charge inversion and condensation

GUO Zi-long, WANG Yan-wei*, YANG Guang-can*

(School of Physics and Electronic Information Engineering, Wenzhou University, Wenzhou 325035, China)

Abstract∶The fact that DNA is condensed into a compact structure in an organism is very important for the storage and transcription of genetic information. Previous intensive studies involve DNA condensation and associated charge inversion. Most of them highlight polyamines and worse hydrolytical ions, but less of them involve easy hydrolytical and pH greatly influenced metallic ion (such as ferric ion). We systematically investigate ferric ion induced DNA charge inversion and condensation.By comparison with cobalt hexamine, we explore a possible mechanism of ferric ion induced DNA charge inversion and condensation.

Key words∶ferric ion;DNA; charge inversion; condensation