茶樹花蛋白質堿提和酶提工藝優化及其功能性質

侯玲， 沈嫻， 陳琳， 金恩惠， 吳媛媛， 屠幼英

(浙江大學農業與生物技術學院茶學系,中國國際茶樹花研究中心，杭州 310058)

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茶樹花蛋白質堿提和酶提工藝優化及其功能性質

侯玲， 沈嫻， 陳琳， 金恩惠， 吳媛媛*， 屠幼英*

(浙江大學農業與生物技術學院茶學系,中國國際茶樹花研究中心，杭州 310058)

采用Osboren蛋白質分類法對茶樹花蛋白質進行分類，通過正交試驗研究茶樹花蛋白質堿法和酶法提取的最佳工藝，并對用這2種方法所提蛋白質的功能特性進行比較研究。結果表明：茶樹花蛋白質組成以清蛋白為主，適合用堿法提取。堿提法最佳組合為NaOH濃度0.15 mol/L，提取時間2.5 h，提取溫度75 ℃，液固比30∶1，在此條件下的蛋白質提取率達到91.45%，蛋白質純度達到90%。酶法提取工藝的最佳條件為堿性蛋白酶添加量5%，液固比50∶1，提取時間2 h，提取溫度60 ℃，提取率為79.12%，蛋白質純度為55%。堿法提取的茶樹花蛋白質純度、持水性、乳化穩定性和起泡性優于酶法提取，而酶法提取的茶樹花蛋白質的乳化性、吸油性、泡沫穩定性、溶解性優于堿法提取。此外，茶樹花堿提和酶提蛋白質對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)自由基的清除率分別達到50.79%和56.04%，具有一定的抗氧化功能。

茶樹花蛋白質； 堿法提取； 酶法提取； 功能性質

Summary Tea flower is a new food resource with high protein and low fat, but there are few reports on the total protein extraction of tea flower so far.

In this work, the tea flower protein was classified by Osboren method, and alkaline and enzymatic extractions were used for obtaining the total protein of the tea flower, and the functional properties of the protein were further analyzed. The single factor design of alkaline extraction was four levels of NaOH concentration (0.01, 0.05, 0.10 and 0.30 mol/L), five levels of time (0.5, 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 h), four levels of temperature (40, 60, 80 and 90 ℃) and five levels of liquid-solid ratio (8∶1, 15∶1, 20∶1, 30∶1 and 60∶1). Screening test result showed that the alkaline protease was the most suitable enzyme for enzymatic extraction, and the single factor design of enzymatic extraction was four levels of the amount of alkaline protease (0.1%, 1.0%, 4.0% and 8.0%), four levels of liquid-solid ratio (10∶1, 20∶1, 30∶1 and 40∶1), four levels of time (0.5, 1.0, 2.0 and 3.0 h) and three levels of temperature (30, 50 and 70 ℃).

The results of Osboren experiment showed that the tea flower proteins were mainly composed of albumin, accounting for 53.86%, which was suitable for alkaline extraction. Based on the results of single factor test and orthogonal array design, the optimal conditions of alkaline extraction were 0.15 mol/L NaOH, 2.5 h, 75 ℃ and liquid-solid ratio of 30∶1, and the highest protein extraction rate and purity were 91.45% and 90%, respectively. The optimal condition of enzymatic extraction were 5% alkaline protease, liquid-solid ratio of 50∶1, 2 h and 60 ℃, and the highest protein extraction rate and purity were 79.12% and 55%, respectively.

The functional properties of the tea flower protein from alkaline and enzymatic extractions were different. The purity, water retention capacity, emulsion stability and foamability from alkaline extraction were 90%, 4.00 mL/g, 85.18% and 100.00%, which were higher than those (55%, 3.60 mL/g, 30.76% and 80.00%) of enzymatic extraction. The emulsibility, oil absorption capacity, foam stability and solubility of the tea flower protein from enzymatic extraction were 83.87%, 4.40 mL/g, 72.92% and 89.00%, which were higher than those (77.14%, 4.00 mL/g, 40.00% and 60.60%) of alkaline extraction. Besides, the protein from alkaline and enzymatic extractions had good abilities on scavenging 1,1-dipheny-2-picryhydrazyl (DPPH) free radical with the rate of 50.79% and 56.04% respectively, suggesting anti-oxidative function of the tea flower protein.

In sum, the present work provides optimization methods on the extraction of tea flower protein. The good functional properties with water retention capacity, oil absorption capacity, emulsibility, foamability and anti-oxidative ability and so on of the protein will expand the application of tea flower in the field of food and cosmetics.

茶樹花作為茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]的主要生殖器官之一，具有“花期長、開花量大”的特點[1]。有研究顯示，成齡茶園鮮花可采收量達200～300 kg/667 m2[2]；2014年的統計數據顯示，全國茶園面積274 hm2，按60%茶園采摘茶樹花計，全國茶區可產茶花600多萬t/a。隨著茶園面積的擴大，茶樹花的可采數量不斷增加，是一種相當豐富的資源。

蘇松坤等[3]比較全面地測定了茶花粉中的多種營養成分，結果表明，茶樹花所含成分種類與茶葉基本相同，如茶多糖和茶蛋白等，對人體具有解毒、抑菌、防癌抗癌和增強免疫力等功效。伍錫岳等[4]在進行茶樹花茶的研制中發現茶樹花具有“高蛋白、低脂肪”的特點。關于茶葉蛋白質的研究顯示，其蛋白質不僅具有很好的營養品質，還具有較強的清除氧自由基的能力[5]；非水溶性茶蛋白質降脂效果明顯，對于抗動脈粥樣硬化及冠心病有一定預防作用[6]。茶樹花作為一種蛋白質新資源，目前開發和利用得較少。本文采用工藝簡單、成本較低的堿法和酶法提取茶樹花蛋白質，研究堿法(NaOH)和酶法(堿性蛋白酶)提取茶樹花蛋白質的工藝優化及茶樹花蛋白質的功能特性，為建立綠色環保、低能耗的茶樹花蛋白質制備方法提供理論和實踐依據。

1　 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗原料

茶樹花干花，由浙江益龍芳茶業有限公司提供。

1.1.2主要試劑

中性蛋白酶、復合風味蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶(江蘇銳陽生物科技有限公司)，氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)等化學試劑均為國產分析純。

1.1.3主要儀器

UV7595紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；離心機(德國Eppendorf公司)；數顯恒溫水浴鍋(江蘇省常州市國華電器有限公司)；FE20精密pH計(上海瑞紡儀器有限公司)；JB90-S高速電動攪拌器(上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)；CHRIST冷凍干燥機(北京奧創興業科技發展有限公司)；KDN-2C型凱式定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1茶樹花水分、蛋白質總量及Osboren蛋白質分類與組成測定

茶樹花干花水分參照GB/T 8304—2013茶水分測定；茶樹花總蛋白質參照GB 5009.5—2010食品中蛋白質的測定(凱氏定氮法)。

Osboren蛋白質分類及各蛋白質組分含量測定：以茶樹花(80目)為材料進行Osboren蛋白質分類提取，方法參見文獻[7]，提取得到的茶樹花清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白采用凱氏定氮法測定，并計算各種蛋白質的含量。

1.2.2茶樹花蛋白質堿法提取流程及單因子試驗設計

堿法提取：80目茶樹花粉末→加堿溶液→控溫堿提→冷卻、離心→取上清液、測蛋白質→提取液脫色、酸沉→透析脫鹽、冷凍干燥→功能性質評價。

按照提取流程，分別對堿法提取中NaOH濃度、提取時間、提取溫度和液固比4個因子對蛋白質提取率的影響進行研究；單因子水平設計如表1所示。

1.2.3茶樹花蛋白質酶法提取流程及單因子試驗

酶法提取： 80目茶樹花粉末→加酶→控溫酶提→滅酶活→冷卻、離心→取上清液、測蛋白質→提取液脫色、酸沉→透析脫鹽、冷凍干燥→功能性質評價。

按照提取流程，分別對酶法提取中酶添加量、液固比、提取時間和提取溫度4個因子對蛋白質提取率的影響進行研究；單因子水平設計如表2所示。

1.2.4茶樹花蛋白質酶法提取的酶類篩選試驗

用復合風味蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶4種酶按照1.2.3節中的酶法提取流程分別提取茶樹花蛋白質，以蛋白質提取率為評價標準，篩選出具最佳提取率的酶用于單因子及正交試驗。

1.2.5 堿法和酶法提取正交試驗設計

對茶樹花蛋白質堿提法和酶提法單因子試驗進行顯著性分析，根據單因子試驗結果，設計4因子3水平L9(34)正交方案進行堿提和酶提條件優化；正交試驗設計見表3和表4。

表3茶樹花蛋白質堿法提取正交試驗因子水平表

Table 3Factors and levels used in orthogonal array design of alkaline extraction of tea flower protein

水平Level因子FactorANaOH濃度NaOHconcentration/(mol/L)B提取時間Extractiontime/hC提取溫度Extractiontemperature/℃D液固比Liquid-solidratio10.050.54510∶120.151.56020∶130.252.57530∶1

表4　茶樹花蛋白質酶法提取正交試驗因子水平表

1.2.6堿提和酶提蛋白質的功能特性評價方法

蛋白質溶解性、持水性、吸油性、乳化性及穩定性、起泡性及泡沫穩定性評價方法參見文獻[8-10]。自由基清除能力測定采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)法[11]。

1.2.7茶樹花蛋白質純化方法

將堿法與酶法蛋白質浸提液進行脫色、透析、酸沉、冷凍干燥：將活性炭與浸提液混合進行脫色處理[12]，然后離心分離，將上層脫色液的pH調節為茶樹花蛋白質的等電點，使蛋白質沉淀[13]，將沉淀物冷凍干燥，獲得茶樹花蛋白質提取物，并測定提取的蛋白質純度。

1.2.8蛋白質提取率和純度計算

蛋白質提取率/%=提取樣品中蛋白質質量/原料中總蛋白質質量×100。

蛋白質純度/%=提取樣品中蛋白質質量/提取樣品質量×100。

1.2.9數據統計分析

所有試驗重復3次，數據結果以平均值±標準偏差表示，采用SAS 9.1軟件進行統計分析。

2　結果與分析

2.1茶樹花含水量、蛋白質總量及其組成

茶樹花干花含水量為7.1%，在其適宜儲存的含水率范圍內。經凱氏定氮法測定得出，茶樹花總蛋白質為14.94%。

采用Osboren蛋白質分類法測得茶樹花蛋白質含有清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白4種；用凱氏定氮法測定表明，在茶樹花蛋白質組分中含有大量的水溶性清蛋白，達53.86%(圖1)，適于堿法提取。

2.2茶樹花蛋白質堿法提取試驗結果與分析

2.2.1單因子試驗結果與分析

在堿提法中各因子對茶樹花蛋白質提取率的影響見圖2。由圖2A可知，隨著NaOH濃度的增大，茶樹花蛋白質提取率逐漸提高。這是由于堿液能破壞蛋白質分子的次級鍵，使得某些極性基團解離，從而使蛋白質表面分子具相同電荷，增加了蛋白質分子溶解作用[14]。但當NaOH濃度大于0.10 mol/L之后，蛋白質提取率提高較慢。這是由于在過高的堿

圖1　經Osboren分類的茶樹花蛋白質組成及含量Fig.1　Composition and content of tea flower protein by Osboren classification

濃度下，加快了美拉德反應[15]，使可溶性蛋白質與還原糖發生反應，使蛋白質變性和水解。由圖2B可知，提取溫度由40 ℃上升到80 ℃左右時，提取率隨溫度上升而增大，但超過80 ℃后，提取率開始降低。這可能是由于溫度上升使蛋白質構象發生改變，分子立體結構變得伸展，有利于蛋白質分子和水分子相互作用，使蛋白質的溶解性增大，提高了茶樹花蛋白質的提取率[16]。當提取溫度繼續升高時，由于維持蛋白質空間構象的次級鍵被破壞，促進了蛋白質分子間相互結合而形成沉淀[17-19]，從而使提取率不再增加。

圖2　堿法提取因子對茶樹花蛋白質提取率的影響Fig.2　Effect of alkaline extraction factors on extraction yield of tea flower protein

由圖2C可以看出，隨提取時間的增加，蛋白質提取率升高。這是因為隨著時間增長，提取液中的蛋白質逐漸增多；而根據水平間顯著分析，2 h與4 h的提取率間沒有顯著差異，考慮到生產成本，在正交試驗中設提取時間不超過4 h。圖2D顯示，在液固比為10∶1～15∶1時，蛋白質提取率增加較快。原因是隨著液固比提高，體系的黏度降低，加快了傳質過程[20]。但之后隨著液固比的增大，蛋白質提取率增加較慢。這是由于茶樹花顆粒與液體的接觸已達到了飽和狀態，繼續增加液固比也不會提高蛋白質的溶出。因此，為了節約水和堿，應盡量減少液固比；且經SAS 9.1軟件單因子顯著性分析發現，除了提取時間外，各因子水平間均達顯著或極顯著水平。

2.2.2正交試驗結果及分析

由表5可以看出：根據4個因子的極差R值大小可得出各個因子對茶樹花蛋白質提取率的影響，從大到小依次為提取溫度(C)、NaOH濃度(A)、提取時間(B)、液固比(D)；根據因子中各水平總和K值可以得出，最優的水平組合為A2B3C3D3，即NaOH濃度0.15 mol/L，提取時間2.5 h，提取溫度75 ℃，液固比30∶1。在此條件下重復進行提取，平均提取率可達到91.45%。

2.3茶樹花蛋白質酶法提取試驗結果與分析

2.3.1酶類篩選試驗結果

從圖3中可以看出，在各種酶類適宜的反應條件下，堿性蛋白酶提取率最高，達到50%以上；因此，

表5　茶樹花蛋白質堿法提取L9(34)正交試驗設計及結果

K1,K2,K3分別為各水平的和；R：極差。

K1,K2,K3represent sum value of each level, respectively;R: Range.

圖3　不同酶類對茶樹花蛋白質提取率的影響Fig.3　Effect of different enzymes on extraction rate of tea flower protein

本文選取堿性蛋白酶用于酶法提取茶樹花蛋白質試驗。

2.3.2單因子試驗結果與分析

酶法提取各因子對茶樹花蛋白質提取率的影響見圖4。由圖4A可以看出，在堿性蛋白酶添加量較低時提取率隨酶量的增加而提高。這是由于堿性蛋白酶為內切酶，可以使大的蛋白質分子降解為小分子而有利于茶樹花蛋白質的溶出。而當加酶量繼續增加時，提取率并未增加，反而有所降低。這可能是由于加酶量增加到一定程度時，對不溶性蛋白質的水解能力達到飽和。除此之外，由于加酶量提高，部分蛋白質會被水解為更小的肽，導致蛋白質提取總量降低[20]。

由圖4B可見，隨著液固比增大提取率增大而沒有達到平衡。說明此單因子試驗設計的最大液固比偏小，在正交試驗設計中應適當增加最大液固比。從圖4C可以看出，隨著提取時間的增加，提取率并未有顯著增加。說明提取時間對堿性蛋白酶酶解效率的影響較小，從生產成本及節約能源出發，提取時間可選擇小于3 h。由圖4D可知，溫度對提取率的影響較為顯著。隨著溫度的增加，提取率先增大后減小。表明堿性蛋白酶的最適溫度為50 ℃左右，此時的提取率達最大。利用SAS 9.1軟件的單因子顯著性分析發現，除酶添加量外，各因子水平間均達顯著或極顯著水平。

2.3.3正交試驗結果與分析

由表6可以看出：根據4個因子的極差R值可得出各個因子對茶樹花蛋白質提取率的影響，從大到小依次為液固比(b)、提取時間(c)、提取溫度(d)、酶添加量(a)；根據各水平總和K值可以得出，最優的水平組合為a3b3c2d3，即酶加量5%，液固比50∶1，提取時間2 h，提取溫度60 ℃。并在此條件下重復試驗，蛋白質的平均提取率可達79.12%。

圖4　堿性蛋白酶提取因子對茶樹花蛋白質提取率的影響Fig.4　Effect of alkaline protease extraction factors on extraction yield of tea flower protein

序號Numbera酶添加量Amountofenzyme/%b液固比Liquid-solidratioc提取時間Extractiontime/hd提取溫度Extractiontemperature/℃蛋白質提取率Proteinextractionrate/%11(1)1(30∶1)1(1)1(40)54.81212(40∶1)2(2)2(50)70.01313(50∶1)3(3)3(60)78.5942(3)12366.805223171.956231262.2273(5)13263.178321372.959332178.20K1203.41184.78189.98204.97K2200.96214.92215.01195.40K3214.33219.01213.71218.34R13.3734.2325.0322.40

K1,K2,K3分別為各水平的和；R：極差。

K1,K2,K3represent sum value of each level, respectively;R: Range.

2.4堿法與酶法提取的茶樹花蛋白質功能性質分析

從蛋白質純化過程中得出，m(活性炭)/g∶V(浸提液)/mL=1∶15，溫度60 ℃，時間1 h的脫色處理效果較好。在pH調節為2～3時茶樹花蛋白質達到等電點，開始沉淀。測得堿提和酶提茶樹花蛋白質的純度分別為90%和55%。這可能是由于在酶解過程中大量大分子蛋白質被水解成了較小的多肽而使得最終的蛋白質純度較低。

同時，對堿法和酶法提取茶樹花蛋白質提取物的溶解性、持水性、吸油性、乳化性及穩定性、起泡性及泡沫穩定性、對DPPH自由基清除率等功能性質進行了比較，結果見表7。從中可知：酶提蛋白質的溶解度明顯高于堿提蛋白質。這可能是由于堿性蛋白酶的水解作用使蛋白質結構改變，多肽鏈斷裂，使其中的離子化羧基和氨基暴露出來，分子的極性增大，蛋白質之間親水作用增強，酶提蛋白質的溶解性提高[9]。2種方法提取的茶樹花蛋白質均具有良好的持水性及吸油性。對于乳化性，堿提和酶提蛋白質的效果相當，但乳化穩定性卻表現出極大的差異，堿提茶樹花蛋白質的乳化穩定性明顯優于酶提蛋白質。就起泡性而言，堿提茶樹花蛋白質明顯優于酶提蛋白質，可能是由于酶提蛋白質被堿性蛋白酶過度水解，產生了較多小分子蛋白質多肽，從而降低了蛋白質的起泡性。蛋白質的發泡性能不僅與蛋白質分子表面基團的極性有關，同時也與蛋白質的分子大小有關，蛋白質的水解度大，不利于泡沫的形成。同時，堿提和酶提蛋白質對DPPH自由基的清除率分別達到了50.79%和56.04%，表現出一定的抗氧化活性，且2種蛋白質的抗氧化性相當。

表7茶樹花堿提和酶提蛋白質的功能性質對比

Table 7Comparison of protein function by alkaline and enzymatic extractions

功能性質 Functionalproperties堿法提取 Alkalineextraction酶法提取 Enzymaticextraction溶解度Solubility/%60.6089.00持水性Waterretentioncapacity/(mL/g)4.003.60吸油性Oilabsorptioncapacity/(mL/g)4.004.40乳化性Emulsibility/%77.1483.87乳化穩定性Emulsionstability/%85.1830.76起泡性Foamability/%100.0080.00泡沫穩定性Foamstability/%40.0072.92DPPH清除率ScavengingrateofDPPHfreeradical/%50.7956.04

3　討論

茶樹花是2013年公布的食品新資源之一，是一種附加值很高的天然植物資源。本研究采用Osboren蛋白質分類法將茶樹花蛋白質分類，測定結果表明，茶樹花蛋白質適合用堿法提取。在茶樹花蛋白質中部分醇溶蛋白質直接用水難以提取，我們在堿法提取的同時也研究了酶法提取對蛋白質提取率的影響，并通過正交試驗優化了酶法提取方案；同時，對比分析了堿法和酶法提取的茶樹花蛋白質的理化及其功能性質。植物蛋白質作為常用的食品基料，具有持水性、吸油性、乳化性、起泡性、抗氧化性[8]等重要的功能性質。在本研究中,堿法和酶法提取的蛋白質均具有上述良好的功能性質。

該研究結果為茶樹花的深度開發及其在食品和日化等領域的進一步應用提供了理論和實踐依據。

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HOU Ling, SHEN Xian, CHEN Lin, KIM Eunhye, WU Yuanyuan*, TU Youying*

(InternationalTeaFlowerResearchCenter,DepartmentofTeaSciences,CollegeofAgricultureandBiotechnology,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

tea flower protein; alkaline extraction; enzymatic extraction; functional property

浙江省重大科技專項(2013C02024-4)；浙江省茶產業科技創新團隊項目(2011R50024)；浙江省自然科學基金(LY16C200004).

Corresponding authors)：吳媛媛(http://orcid.org/0000-0001-8022-6736),E-mail:yywu@zju.edu.cn；屠幼英(http://orcid.org/0000-0002-9539-1678)，E-mail:youytu@zju.edu.cn

聯系方式：侯玲(http://orcid.org/0000-0001-8466-7838)，E-mail:littleh@zju.edu.cn

2015-08-05；接受日期(Accepted)：2015-10-10；網絡出版日期(Published online)：2016-07-19

TS 201.1; TS 272

A

URL:http://www.cnki.net/kcms/detail/33.1247.S.20160719.1838.006.html