維甲酸通過抑制沉默調節因子1誘導P19細胞分化為神經細胞的機制

張俊士　王　瓊　賀維亞　趙雪艷

(河南大學淮河醫院神經內科，河南　開封　475000)

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維甲酸通過抑制沉默調節因子1誘導P19細胞分化為神經細胞的機制

張俊士王瓊賀維亞趙雪艷

(河南大學淮河醫院神經內科，河南開封475000)

目的探討維甲酸(RA)誘導P19向神經分化的潛在分子機制。方法適當濃度RA誘導P19細胞4 d，觀察是否有神經細胞標志物β-Tubulin產生，同時觀察對SIRT1和Notch1的影響。RT-PCR和Western印跡實驗檢測敲低SIRT1對β-Tubulin和Notch1的影響。Western印跡實驗檢測高表達Notch1是否對β-Tubulin表達水平產生影響。結果RA誘導P19細胞4 d內β-Tubulin表達水平逐漸升高，SIRT1和Notch1表達水平明顯降低，表明RA在4 d內能夠明顯地刺激P19細胞向神經細胞方向分化，并能夠抑制SIRT1和Notch1信號通路。敲低SIRT1后，與對照組比較誘導分化4 d后神經分化標志物β-Tubulin水平升高，Notch1水平下降。高表達Notch1組在誘導神經分化4 d后β-Tubulin水平相對較低。結論RA可能通過降低SIRT1而抑制Notch1信號通路，促使P19細胞向神經分化。

維甲酸；P19細胞；神經分化；SIRT1；Notch1

小鼠胚胎性癌細胞P19是McBurney等〔1〕從C3H/He雄性小鼠睪丸畸胎瘤中分離出來的，體外常用于探究胚胎分化發育分子機制。在設定濃度的全反式維甲酸(RA)的刺激下，P19細胞能夠向多種類型的神經元和神經膠質細胞方向分化。沉默調節因子(SIRT)1在胚胎發育過程中起到重要作用〔2〕。Notch1信號通路對神經干細胞的分化起調控作用，Notch1上調對細胞分化起抑制作用，而下調則促進其分化〔3〕。本實驗通過RA處理誘導P19細胞向神經分化，觀察誘導的前4 d SIRT1和Notch1表達的變化，探討SIRT1和Notch1是否參與RA誘導P19細胞向神經分化的過程。

1　材料和方法

1.1細胞及主要試劑P19細胞購于美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)。α-MEM培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)購自廣州市達暉生物技術有限公司，RA購自美國Sigma公司，胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購自美國Gibco公司，β-Tubulin抗體、SIRT1抗體、Notch1抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Abcam公司，二喹寧甲酸(BCA)蛋白定量分析試劑盒和增強化學發光法(ECL)化學發光底物購自美國Thermo公司，二甲亞砜(DMSO)購自上海國藥集團。

1.2主要儀器設備CO2培養箱購自德國NERAEVS公司，超凈工作臺購自上海躍進醫療器械廠，酶標儀購自美國Molecular Devices公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養及向神經細胞分化的誘導培養基為α-MEM培養基，其中包含10% FBS、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素。P19細胞于37℃、5%CO2孵箱中貼壁培養，每隔2 d更換1次培養液。至細胞匯合達到90%，棄去舊培養基，用0.25%胰蛋白酶消化。計數后選取1×105個細胞/ml密度接種于含終濃度為0.5 μmol/L的RA培養基中，于37℃、5%CO2孵箱中誘導4 d，收集成團細胞用于免疫印跡和RT-PCR檢測。誘導當天計為第1天，以此類推。

1.3.2細胞轉染P19細胞轉染pcDNA-Notch1前24 h使用胰酶消化、計數，以1×105/ml的密度接種于6孔板中培養，至細胞匯合至40%～50%時行細胞轉染。轉染嚴格依照試劑說明書，轉染后細胞轉入完全培養基中繼續培養24～48 h后收集。為了轉染針對SIRT1基因的特異siRNA慢病毒載體，將P19細胞分為轉染組(si-SIRT1組)和慢病毒轉染對照組(si-con組)。取上述各組細胞懸液，接種于培養基中于37℃、5%CO2條件下培養24 h。將含si-SIRT1的慢病毒載體或空白病毒各100 μl在轉染試劑下轉染至各組P19細胞，實驗過程嚴格按照流程說明書執行。

1.3.3免疫印跡收集各組P19細胞，加入裂解液后提取總蛋白，其濃度由BCA法測定。變性后冷卻，行12%分離膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜、室溫用脫脂奶粉封閉2 h、一抗4℃過夜孵育、二抗室溫孵育2 h后，利用ImageJ對所得各組條帶進行成像分析，β-actin作為內參。蛋白質相對表達水平用目標蛋白質灰度值比β-actin灰度值來表示。

1.3.4實時反轉錄PCR(RT-PCR)各組P19細胞完成實驗后，提取總RNA，將RNA反轉錄成cDNA。所用SIRT1基因引物序列，上游：5′-GCA TGC ATG GAA CCT TTG CCT CAT CTA CA-3′，下游：5′-GAT TAC CCT CAA GCC GCT TA-3′；內參GAPDH基因引物序列,上游:5′-ACT CCA CTC ACG GCA AAT TCA-3′，下游:5′-GCC TCA CCC CAT TTG ATG TT-3′。

1.4觀察指標①RA誘導不同時間對P19細胞神經分化特異性標志物β-Tubulin、SIRT1和Notch1的影響。②敲除SIRT1后，RA對P19細胞β-Tubulin和Notch1表達水平的影響。③高表達Notch1后，RA對P19細胞β-Tubulin表達水平的影響。

1.5統計學方法采用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1RA誘導P19細胞向神經細胞分化P19細胞在RA的誘導下，每天檢測神經分化特異性標志物β-Tubulin的變化。RA誘導前(第0天)幾乎檢測不到β-Tubulin(設為1)。當0.5 μmol/L的RA誘導時，隨著時間的增加，β-Tubulin表達水平遞增(1、2、3、4 d時分別為2.3±0.26，5.2±0.57，11.6±1.36，25.8±2.36)，說明RA可以明顯地刺激P19細胞向神經細胞方向分化，也證實了此神經分化模型的有效性。見圖1。

2.2RA降低P19細胞中SIRT1表達水平對照組無RA誘導下，P19細胞SIRT1表達水平較高。但經過0.5 μmol/L的RA誘導不同時間后，SIRT1表達水平逐漸降低，在0～4 d內呈時間依賴性(0、1、2、3、4 d時分別為1，0.86±0.09，0.61±0.07，0.44±0.06，0.26±0.04)。由此推測，SIRT1在RA誘導P19細胞向神經細胞分化的過程中可能起到重要作用。見圖2。

2.3RA抑制P19細胞中Notch1通路與對照組比較，RA誘導P19細胞分化的過程中，Notch1的表達水平明顯降低，并呈時間依賴性(0、1、2、3、4 d時分別為1，0.89±0.07，0.76±0.08，0.53±0.06，0.42±0.07)。Notch1信號通路具有調控干細胞分化的功能，此結果表明Notch1信號通路參與了RA誘導P19分化過程。見圖3。

2.4Notch1信號通路受SIRT1調控由以上實驗結果提出假設，Notch1信號通路受SIRT1調控，進而影響P19細胞的分化。為了驗證此假設，敲除SIRT1的P19細胞在RA誘導4 d后檢測神經分化特異性標志物β-Tubulin和Notch1的水平變化。si-ton組設為1，si-SIRT1組SIRT1 mRNA及蛋白水平分別為0.10±0.02，0.15±0.03，成功降低SIRT1 mRNA和蛋白的表達水平。0 d時si-con組β-Tubulin及Notch1水平均設為1，si-SIRT1組分別為0.98±0.05，1.06±0.11。與si-con組(26.84±2.81、0.52±0.08)比較，誘導分化4 d后si-SIRT1組神經分化標志物β-Tubulin水平升高(37.80±4.23)，Notch1水平下降(0.31±0.06)，驗證了SIRT1在RA誘導的神經分化中起到重要作用，并且推測SIRT1調控下游Notch1信號通路。見圖4。

圖1　RA對P19細胞神經分化的影響

圖2　RA對P19細胞中SIRT1的影響

圖3　RA對P19細胞中Notch1的影響

2.5激活Notch1對RA誘導P19細胞向神經細胞分化的影響為了證實Notch1信號通路對神經分化起作用，高表達Notch1的P19細胞在RA誘導4 d后檢測β-Tubulin的表達水平。0 d時，對照組β-Tubulin表達量設為1，高表達Notch1組β-Tubulin表達量為0.97±0.04。結果發現，與對照組(23.81±2.40)相比，高表達Notch1組在誘導神經分化4 d后β-Tubulin水平相對較低(14.92±1.84)(圖5)，表明Notch1對神經分化起作用。

1:si-con;2:si-SIRT1圖4　敲降SIRT1對P19細胞神經分化和Notch1的影響

1:pcDNA-con;2:pcDNA-Notch1圖5　高表達Notch1對P19細胞神經分化的影響

3　討　論

實驗證實可Sox6促進RA誘導的P19細胞向神經方向分化〔4〕。Boudjelal等〔5〕發現Stra13高表達的P19細胞有向神經分化的功能，而野生P19細胞則向中胚層/外胚層分化。此外，RA能誘導P19細胞Stra13表達，Stra13可能是RA早期目標基因，參與抑制P19細胞向中胚層/外胚層分化以及誘導神經分化過程。κ-Casein(CSN3)在RA誘導P19細胞神經分化的過程中亦高表達，證實了CSN3在此過程中的重要作用〔6〕。TAL2在RA誘導P19細胞后的第3 h表達水平開始增加，至第24 h時恢復至常態，表明TAL2在腦發育中調控著干細胞向神經分化〔7〕。盡管以上實驗明確了RA誘導的P19神經分化過程的多種調控機制，但其他機制仍需要探究。

SIRT1與包括神經發育在內的多種生理活動聯系緊密〔8〕。研究顯示，誘導神經前體細胞分化過程中，SIRT1的位置從細胞質轉移到細胞核，從而調控神經前體細胞向神經細胞的方向分化〔9〕。人類胚胎干細胞分化過程中，在RNA-結合蛋白HuR和精氨酸甲基轉移酶(CARM1)的調控下，SIRT1 mRNA和蛋白水平都顯著降低，繼而激活若干種發育相關基因，例如Delta樣配體4(DLL4)、T-框蛋白3(TBX3)和配對核基因6(PAX6)，從而調控干細胞分化方向〔10〕。干細胞分化過程中SIRT1的水平亦受若干miRNAs的調控。實驗已經證實SIRT1蛋白水平在小鼠胚胎干細胞(mESCs)中水平高于處在分化階段的mESCs，而SIRT1的3′非編碼區mRNA與多種mRNAs直接相互作用，例如miR-181a/b、miR-9、miR-204、miR-135a和miR-199b〔11〕。在SIRT1的參與下，某些轉錄因子如FOXO3發生去乙酰化，亦會影響細胞分化〔12〕。RA誘導P19細胞神經分化的過程中SIRT1水平明顯降低，而此誘導過程如果加入SIRT1的誘導劑白藜蘆醇，神經分化標志物nestin就會受到抑制，即P19細胞向神經分化的能力受到抑制〔13〕。本實驗表明誘導初期SIRT1對分化起到關鍵作用，進一步驗證了SIRT1下調可抑制Notch1信號通路，而Notch1的抑制對分化起到促進作用。

Notch1信號通路對維持干細胞特性、調節神經干細胞分化等方面意義重大。神經干細胞經親神經復合物百日咳桿菌氣管定植因子(tCFA15)處理，Notch1的表達受到抑制，最終促使神經干細胞向神經分化而非星形膠質細胞分化〔14〕。肖迎等〔15〕在誘導小鼠胚胎干細胞分化為神經細胞中發現Notch1在誘導前表達較高，而隨著RA誘導的進行，Notch1的表達越來越低，神經細胞數亦逐漸增多，說明抑制Notch1增強神經分化趨勢。Jing等〔16〕在研究小鼠骨髓間充質干細胞的過程中發現，受miR-9調控的Notch1下調可以誘導神經細胞標志物和微管相關蛋白(MAP)-2，促進向神經細胞的分化。最近的一項研究表明，從中藥植物中提取的紅景天苷可以誘導小鼠骨髓間充質干細胞向神經細胞方向分化，表現為誘導后神經表型標志物神經元烯醇酶(Eno)2、MAP-2、β-tubulin Ⅲ表達的增加，其機制部分依賴于Notch1信號通路〔17〕。以上研究指明，Notch1信號通路是參與神經分化的重要信號通路。本研究結果與上述研究結果一致。

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2Wang RH，Sengupta K，Li C，etal.Impaired DNA damage response，genome instability，and tumorigenesis in SIRT1 mutant mice 〔J〕.Cancer Cell，2008；14(4)：312-23.

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4Hamada-Kanazawa M，Ishikawa K，Nomoto K，etal.Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid 〔J〕.FEBS Lett，2004；560(1-3)：192-8.

5Boudjelal M，Taneja R，Matsubara S，etal.Overexpression of Stra13，a novel retinoic acid-inducible gene of the basic helix-loop-helix family，inhibits mesodermal and promotes neuronal differentiation of P19 cells 〔J〕.Genes Dev，1997；11(16)：2052-65.

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7Kobayashi T，Komori R，Ishida K，etal.Tal2 expression is induced by all-trans retinoic acid in P19 cells prior to acquisition of neural fate 〔J〕.Sci Rep，2014;4:4935.

8Said RS，El-Demerdash E，Nada AS，etal.Resveratrol inhibits inflammatory signaling implicated in ionizing radiation-induced premature ovarian failure through antagonistic crosstalk between silencing information regulator 1(SIRT1)and poly(ADP-ribose)polymerase 1(PARP-1)〔J〕.Biochem Pharmacol，2016；103(2)：140-50.

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17Zhao HB，Qi SN，Dong JZ，etal.Salidroside induces neuronal differentiation of mouse mesenchymal stem cells through Notch and BMP signaling pathways 〔J〕.Food Chem Toxicol，2014；71：60-7.

〔2016-01-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.007

河南省高等學校重點科研項目(No.16A320003)；河南省教育廳國際合作項目(No.162102410089)

趙雪艷(1975-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事神經科基礎研究。

張俊士(1979-)，男，碩士，主治醫師，主要從事神經科基礎研究。

R74

A

1005-9202(2016)14-3365-03；