維甲酸通過抑制沉默調(diào)節(jié)因子1誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制

張俊士　王　瓊　賀維亞　趙雪艷

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南　開封　475000)

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維甲酸通過抑制沉默調(diào)節(jié)因子1誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞的機(jī)制

張俊士王瓊賀維亞趙雪艷

(河南大學(xué)淮河醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南開封475000)

目的探討維甲酸(RA)誘導(dǎo)P19向神經(jīng)分化的潛在分子機(jī)制。方法適當(dāng)濃度RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞4 d，觀察是否有神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物β-Tubulin產(chǎn)生，同時(shí)觀察對(duì)SIRT1和Notch1的影響。RT-PCR和Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)敲低SIRT1對(duì)β-Tubulin和Notch1的影響。Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高表達(dá)Notch1是否對(duì)β-Tubulin表達(dá)水平產(chǎn)生影響。結(jié)果RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞4 d內(nèi)β-Tubulin表達(dá)水平逐漸升高，SIRT1和Notch1表達(dá)水平明顯降低，表明RA在4 d內(nèi)能夠明顯地刺激P19細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，并能夠抑制SIRT1和Notch1信號(hào)通路。敲低SIRT1后，與對(duì)照組比較誘導(dǎo)分化4 d后神經(jīng)分化標(biāo)志物β-Tubulin水平升高，Notch1水平下降。高表達(dá)Notch1組在誘導(dǎo)神經(jīng)分化4 d后β-Tubulin水平相對(duì)較低。結(jié)論RA可能通過降低SIRT1而抑制Notch1信號(hào)通路，促使P19細(xì)胞向神經(jīng)分化。

維甲酸；P19細(xì)胞；神經(jīng)分化；SIRT1；Notch1

小鼠胚胎性癌細(xì)胞P19是McBurney等〔1〕從C3H/He雄性小鼠睪丸畸胎瘤中分離出來的，體外常用于探究胚胎分化發(fā)育分子機(jī)制。在設(shè)定濃度的全反式維甲酸(RA)的刺激下，P19細(xì)胞能夠向多種類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。沉默調(diào)節(jié)因子(SIRT)1在胚胎發(fā)育過程中起到重要作用〔2〕。Notch1信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的分化起調(diào)控作用，Notch1上調(diào)對(duì)細(xì)胞分化起抑制作用，而下調(diào)則促進(jìn)其分化〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過RA處理誘導(dǎo)P19細(xì)胞向神經(jīng)分化，觀察誘導(dǎo)的前4 d SIRT1和Notch1表達(dá)的變化，探討SIRT1和Notch1是否參與RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞向神經(jīng)分化的過程。

1　材料和方法

1.1細(xì)胞及主要試劑P19細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection)。α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)購(gòu)自廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司，RA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胰蛋白酶和青鏈霉素混合液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，β-Tubulin抗體、SIRT1抗體、Notch1抗體、β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，二喹寧甲酸(BCA)蛋白定量分析試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，二甲亞砜(DMSO)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。

1.2主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)NERAEVS公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及向神經(jīng)細(xì)胞分化的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為α-MEM培養(yǎng)基，其中包含10% FBS、100 U/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素。P19細(xì)胞于37℃、5%CO2孵箱中貼壁培養(yǎng)，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。至細(xì)胞匯合達(dá)到90%，棄去舊培養(yǎng)基，用0.25%胰蛋白酶消化。計(jì)數(shù)后選取1×105個(gè)細(xì)胞/ml密度接種于含終濃度為0.5 μmol/L的RA培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2孵箱中誘導(dǎo)4 d，收集成團(tuán)細(xì)胞用于免疫印跡和RT-PCR檢測(cè)。誘導(dǎo)當(dāng)天計(jì)為第1天，以此類推。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染P19細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-Notch1前24 h使用胰酶消化、計(jì)數(shù)，以1×105/ml的密度接種于6孔板中培養(yǎng)，至細(xì)胞匯合至40%～50%時(shí)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格依照試劑說明書，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后收集。為了轉(zhuǎn)染針對(duì)SIRT1基因的特異siRNA慢病毒載體，將P19細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組(si-SIRT1組)和慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)照組(si-con組)。取上述各組細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。將含si-SIRT1的慢病毒載體或空白病毒各100 μl在轉(zhuǎn)染試劑下轉(zhuǎn)染至各組P19細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照流程說明書執(zhí)行。

1.3.3免疫印跡收集各組P19細(xì)胞，加入裂解液后提取總蛋白，其濃度由BCA法測(cè)定。變性后冷卻，行12%分離膠十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜、室溫用脫脂奶粉封閉2 h、一抗4℃過夜孵育、二抗室溫孵育2 h后，利用ImageJ對(duì)所得各組條帶進(jìn)行成像分析，β-actin作為內(nèi)參。蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平用目標(biāo)蛋白質(zhì)灰度值比β-actin灰度值來表示。

1.3.4實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)各組P19細(xì)胞完成實(shí)驗(yàn)后，提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。所用SIRT1基因引物序列，上游：5′-GCA TGC ATG GAA CCT TTG CCT CAT CTA CA-3′，下游：5′-GAT TAC CCT CAA GCC GCT TA-3′；內(nèi)參GAPDH基因引物序列,上游:5′-ACT CCA CTC ACG GCA AAT TCA-3′，下游:5′-GCC TCA CCC CAT TTG ATG TT-3′。

1.4觀察指標(biāo)①RA誘導(dǎo)不同時(shí)間對(duì)P19細(xì)胞神經(jīng)分化特異性標(biāo)志物β-Tubulin、SIRT1和Notch1的影響。②敲除SIRT1后，RA對(duì)P19細(xì)胞β-Tubulin和Notch1表達(dá)水平的影響。③高表達(dá)Notch1后，RA對(duì)P19細(xì)胞β-Tubulin表達(dá)水平的影響。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化P19細(xì)胞在RA的誘導(dǎo)下，每天檢測(cè)神經(jīng)分化特異性標(biāo)志物β-Tubulin的變化。RA誘導(dǎo)前(第0天)幾乎檢測(cè)不到β-Tubulin(設(shè)為1)。當(dāng)0.5 μmol/L的RA誘導(dǎo)時(shí)，隨著時(shí)間的增加，β-Tubulin表達(dá)水平遞增(1、2、3、4 d時(shí)分別為2.3±0.26，5.2±0.57，11.6±1.36，25.8±2.36)，說明RA可以明顯地刺激P19細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，也證實(shí)了此神經(jīng)分化模型的有效性。見圖1。

2.2RA降低P19細(xì)胞中SIRT1表達(dá)水平對(duì)照組無RA誘導(dǎo)下，P19細(xì)胞SIRT1表達(dá)水平較高。但經(jīng)過0.5 μmol/L的RA誘導(dǎo)不同時(shí)間后，SIRT1表達(dá)水平逐漸降低，在0～4 d內(nèi)呈時(shí)間依賴性(0、1、2、3、4 d時(shí)分別為1，0.86±0.09，0.61±0.07，0.44±0.06，0.26±0.04)。由此推測(cè)，SIRT1在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中可能起到重要作用。見圖2。

2.3RA抑制P19細(xì)胞中Notch1通路與對(duì)照組比較，RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞分化的過程中，Notch1的表達(dá)水平明顯降低，并呈時(shí)間依賴性(0、1、2、3、4 d時(shí)分別為1，0.89±0.07，0.76±0.08，0.53±0.06，0.42±0.07)。Notch1信號(hào)通路具有調(diào)控干細(xì)胞分化的功能，此結(jié)果表明Notch1信號(hào)通路參與了RA誘導(dǎo)P19分化過程。見圖3。

2.4Notch1信號(hào)通路受SIRT1調(diào)控由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出假設(shè)，Notch1信號(hào)通路受SIRT1調(diào)控，進(jìn)而影響P19細(xì)胞的分化。為了驗(yàn)證此假設(shè)，敲除SIRT1的P19細(xì)胞在RA誘導(dǎo)4 d后檢測(cè)神經(jīng)分化特異性標(biāo)志物β-Tubulin和Notch1的水平變化。si-ton組設(shè)為1，si-SIRT1組SIRT1 mRNA及蛋白水平分別為0.10±0.02，0.15±0.03，成功降低SIRT1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。0 d時(shí)si-con組β-Tubulin及Notch1水平均設(shè)為1，si-SIRT1組分別為0.98±0.05，1.06±0.11。與si-con組(26.84±2.81、0.52±0.08)比較，誘導(dǎo)分化4 d后si-SIRT1組神經(jīng)分化標(biāo)志物β-Tubulin水平升高(37.80±4.23)，Notch1水平下降(0.31±0.06)，驗(yàn)證了SIRT1在RA誘導(dǎo)的神經(jīng)分化中起到重要作用，并且推測(cè)SIRT1調(diào)控下游Notch1信號(hào)通路。見圖4。

圖1　RA對(duì)P19細(xì)胞神經(jīng)分化的影響

圖2　RA對(duì)P19細(xì)胞中SIRT1的影響

圖3　RA對(duì)P19細(xì)胞中Notch1的影響

2.5激活Notch1對(duì)RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響為了證實(shí)Notch1信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)分化起作用，高表達(dá)Notch1的P19細(xì)胞在RA誘導(dǎo)4 d后檢測(cè)β-Tubulin的表達(dá)水平。0 d時(shí)，對(duì)照組β-Tubulin表達(dá)量設(shè)為1，高表達(dá)Notch1組β-Tubulin表達(dá)量為0.97±0.04。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(23.81±2.40)相比，高表達(dá)Notch1組在誘導(dǎo)神經(jīng)分化4 d后β-Tubulin水平相對(duì)較低(14.92±1.84)(圖5)，表明Notch1對(duì)神經(jīng)分化起作用。

1:si-con;2:si-SIRT1圖4　敲降SIRT1對(duì)P19細(xì)胞神經(jīng)分化和Notch1的影響

1:pcDNA-con;2:pcDNA-Notch1圖5　高表達(dá)Notch1對(duì)P19細(xì)胞神經(jīng)分化的影響

3　討　論

實(shí)驗(yàn)證實(shí)可Sox6促進(jìn)RA誘導(dǎo)的P19細(xì)胞向神經(jīng)方向分化〔4〕。Boudjelal等〔5〕發(fā)現(xiàn)Stra13高表達(dá)的P19細(xì)胞有向神經(jīng)分化的功能，而野生P19細(xì)胞則向中胚層/外胚層分化。此外，RA能誘導(dǎo)P19細(xì)胞Stra13表達(dá)，Stra13可能是RA早期目標(biāo)基因，參與抑制P19細(xì)胞向中胚層/外胚層分化以及誘導(dǎo)神經(jīng)分化過程。κ-Casein(CSN3)在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化的過程中亦高表達(dá)，證實(shí)了CSN3在此過程中的重要作用〔6〕。TAL2在RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞后的第3 h表達(dá)水平開始增加，至第24 h時(shí)恢復(fù)至常態(tài)，表明TAL2在腦發(fā)育中調(diào)控著干細(xì)胞向神經(jīng)分化〔7〕。盡管以上實(shí)驗(yàn)明確了RA誘導(dǎo)的P19神經(jīng)分化過程的多種調(diào)控機(jī)制，但其他機(jī)制仍需要探究。

SIRT1與包括神經(jīng)發(fā)育在內(nèi)的多種生理活動(dòng)聯(lián)系緊密〔8〕。研究顯示，誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞分化過程中，SIRT1的位置從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而調(diào)控神經(jīng)前體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的方向分化〔9〕。人類胚胎干細(xì)胞分化過程中，在RNA-結(jié)合蛋白HuR和精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(CARM1)的調(diào)控下，SIRT1 mRNA和蛋白水平都顯著降低，繼而激活若干種發(fā)育相關(guān)基因，例如Delta樣配體4(DLL4)、T-框蛋白3(TBX3)和配對(duì)核基因6(PAX6)，從而調(diào)控干細(xì)胞分化方向〔10〕。干細(xì)胞分化過程中SIRT1的水平亦受若干miRNAs的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)SIRT1蛋白水平在小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)中水平高于處在分化階段的mESCs，而SIRT1的3′非編碼區(qū)mRNA與多種mRNAs直接相互作用，例如miR-181a/b、miR-9、miR-204、miR-135a和miR-199b〔11〕。在SIRT1的參與下，某些轉(zhuǎn)錄因子如FOXO3發(fā)生去乙酰化，亦會(huì)影響細(xì)胞分化〔12〕。RA誘導(dǎo)P19細(xì)胞神經(jīng)分化的過程中SIRT1水平明顯降低，而此誘導(dǎo)過程如果加入SIRT1的誘導(dǎo)劑白藜蘆醇，神經(jīng)分化標(biāo)志物nestin就會(huì)受到抑制，即P19細(xì)胞向神經(jīng)分化的能力受到抑制〔13〕。本實(shí)驗(yàn)表明誘導(dǎo)初期SIRT1對(duì)分化起到關(guān)鍵作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了SIRT1下調(diào)可抑制Notch1信號(hào)通路，而Notch1的抑制對(duì)分化起到促進(jìn)作用。

Notch1信號(hào)通路對(duì)維持干細(xì)胞特性、調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞分化等方面意義重大。神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)親神經(jīng)復(fù)合物百日咳桿菌氣管定植因子(tCFA15)處理，Notch1的表達(dá)受到抑制，最終促使神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)分化而非星形膠質(zhì)細(xì)胞分化〔14〕。肖迎等〔15〕在誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Notch1在誘導(dǎo)前表達(dá)較高，而隨著RA誘導(dǎo)的進(jìn)行，Notch1的表達(dá)越來越低，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)亦逐漸增多，說明抑制Notch1增強(qiáng)神經(jīng)分化趨勢(shì)。Jing等〔16〕在研究小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的過程中發(fā)現(xiàn)，受miR-9調(diào)控的Notch1下調(diào)可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物和微管相關(guān)蛋白(MAP)-2，促進(jìn)向神經(jīng)細(xì)胞的分化。最近的一項(xiàng)研究表明，從中藥植物中提取的紅景天苷可以誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，表現(xiàn)為誘導(dǎo)后神經(jīng)表型標(biāo)志物神經(jīng)元烯醇酶(Eno)2、MAP-2、β-tubulin Ⅲ表達(dá)的增加，其機(jī)制部分依賴于Notch1信號(hào)通路〔17〕。以上研究指明，Notch1信號(hào)通路是參與神經(jīng)分化的重要信號(hào)通路。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

1McBurney MW，Rogers BJ.Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns 〔J〕.Dev Biol，1982；89(2)：503-8.

2Wang RH，Sengupta K，Li C，etal.Impaired DNA damage response，genome instability，and tumorigenesis in SIRT1 mutant mice 〔J〕.Cancer Cell，2008；14(4)：312-23.

3Artavanis-Tsakonas S，Rand MD，Lake RJ.Notch signaling：cell fate control and signal integration in development 〔J〕.Science，1999；284(5415)：770-6.

4Hamada-Kanazawa M，Ishikawa K，Nomoto K，etal.Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid 〔J〕.FEBS Lett，2004；560(1-3)：192-8.

5Boudjelal M，Taneja R，Matsubara S，etal.Overexpression of Stra13，a novel retinoic acid-inducible gene of the basic helix-loop-helix family，inhibits mesodermal and promotes neuronal differentiation of P19 cells 〔J〕.Genes Dev，1997；11(16)：2052-65.

6Komori R，Kobayashi T，Matsuo H，etal.Csn3 gene is regulated by all-trans retinoic acid during neural differentiation in mouse P19 cells 〔J〕.PLoS One，2013；8(4)：e61938.

7Kobayashi T，Komori R，Ishida K，etal.Tal2 expression is induced by all-trans retinoic acid in P19 cells prior to acquisition of neural fate 〔J〕.Sci Rep，2014;4:4935.

8Said RS，El-Demerdash E，Nada AS，etal.Resveratrol inhibits inflammatory signaling implicated in ionizing radiation-induced premature ovarian failure through antagonistic crosstalk between silencing information regulator 1(SIRT1)and poly(ADP-ribose)polymerase 1(PARP-1)〔J〕.Biochem Pharmacol，2016；103(2)：140-50.

9Hisahara S，Chiba S，Matsumoto H，etal.Histone deacetylase SIRT1 modulates neuronal differentiation by its nuclear translocation 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2008；105(40)：15599-604.

10Calvanese V，Lara E，Suárez-Alvarez B,etal.Sirtuin 1 regulation of developmental genes during differentiation of stem cells 〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2010；107(31)：13736-41.

11Saunders LR，Sharma AD，Tawney J，etal.miRNAs regulate SIRT1 expression during mouse embryonic stem cell differentiation and in adult mouse tissues 〔J〕.Aging(Albany NY)，2010；2(7)：415-31.

12Kim MJ，Ahn K，Park SH，etal.SIRT1 regulates tyrosine hydroxylase expression and differentiation of neuroblastoma cells via FOXO3a 〔J〕.FEBS Lett，2009；583(7)：1183-8.

13Kang MR，Lee SW，Um E，etal.Reciprocal roles of SIRT1 and SKIP in the regulation of RAR activity：implication in the retinoic acid-induced neuronal differentiation of P19 cells 〔J〕.Nucleic Acids Res，2010；38(3)：822-31.

14Bouissac J，Garwood J，Girlanda-Jungès C，etal.tCFA15，a trimethyl cyclohexenonic long-chain fatty alcohol，affects neural stem fate and differentiation by modulating Notch1 activity 〔J〕.Eur J Pharmacol，2013；718(1)：383-92.

15肖迎，王琪，唐仕波，等.Notch1 蛋白在胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中的表達(dá) 〔J〕.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008；12(25)：4967-70.

16Jing L，Jia Y，Lu J,etal.MicroRNA-9 promotes differentiation of mouse bone mesenchymal stem cells into neurons by Notch signaling 〔J〕.Neuroreport，2011；22(5)：206-11.

17Zhao HB，Qi SN，Dong JZ，etal.Salidroside induces neuronal differentiation of mouse mesenchymal stem cells through Notch and BMP signaling pathways 〔J〕.Food Chem Toxicol，2014；71：60-7.

〔2016-01-11修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.007

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(No.16A320003)；河南省教育廳國(guó)際合作項(xiàng)目(No.162102410089)

趙雪艷(1975-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)科基礎(chǔ)研究。

張俊士(1979-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)科基礎(chǔ)研究。

R74

A

1005-9202(2016)14-3365-03；