抑肽酶對白兔跟腱斷裂模型修復過程的影響

白　楊　王　虎　單　臣

(吉林省人民醫院，吉林　長春　130021)

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抑肽酶對白兔跟腱斷裂模型修復過程的影響

白楊王虎單臣

(吉林省人民醫院，吉林長春130021)

目的觀察抑肽酶對家兔跟腱斷裂修復過程的影響。方法選用60只新西蘭白兔，隨機分為3組，每組6只。正常組不予任何處理；模型組和治療組手術制作跟腱斷裂模型，治療組白兔在損傷周圍部位注射抑肽酶，按10 000 kIU/ml注射1 ml，模型組每天注射等量生理鹽水。于造模后第3天及第1、2、3、4周進行標本采集，觀察跟腱斷裂部位的病理形態及轉化生長因子(TGF)-β1表達。結果抑肽酶治療組術后纖維細胞增生較早(第3天可見)，炎性細胞少量浸潤，后期(2～4 w)膠原纖維排列較規則、緊密、成熟，而模型組炎性細胞浸潤時間長，膠原纖維排列不規則。TGF-β1表達量在術后第3天及第1周抑肽酶治療組高于模型組，但第2～4周時抑肽酶治療組中表達量明顯減少且低于模型組。結論抑肽酶可通過調控TGF-β1的表達量，減輕炎癥的反應，促進膠原細胞的增生，對跟腱斷裂的修復有一定促進作用。

抑肽酶；跟腱斷裂；轉化生長因子-β1

跟腱斷裂是骨科常見的一種疾病，因其供血較差，易導致組織營養不良、退行性變以及壞死等并發癥，目前臨床主要是是保守治療及手術治療，但都不能避免并發癥的發生〔1，2〕。抑肽酶是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑。研究表明，抑肽酶對肝、腦、心等多種組織的缺血再灌注損傷有明顯的保護作用〔3，4〕。但把抑肽酶應用于骨科的研究報道甚少。本研究旨在探討局部注射抑肽酶的家兔跟腱斷裂恢復情況及可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物來自吉林大學實驗動物中心提供的新西蘭白兔，同月齡、體重為(2.8±0.2)kg。所有實驗動物在室溫20℃～28℃，相對濕度40%～70%的動物房內飼養。

1.2模型制備造模前12 h開始禁食，不禁水，直至實驗結束。將白兔固定于手術臺上，實施跟腱局部麻醉后，用手術刀切斷跟腱內側1/2組織，使中央部分成“V”字缺損。跟腱周圍被膜絲線連續縫合，絲線間斷縫合皮膚。術后無菌紗布包扎傷口，并扎緊，防止脫落。每只家兔肌肉注射青霉素(1次/d，40萬U/次)，連續3 d。傷口不給予更換紗布，不給予夾板固定，給予籠外放養，自由活動。

1.3分組及方法取60只新西蘭白兔，隨機分為3組，正常組(不做任何處理)，模型組，抑肽酶治療組(制備模型縫合腱周膜后，損傷周圍部位注射抑肽酶，按10 000 kIU/ml注射，縫合皮膚)。模型組和抑肽酶組家兔皮膚傷口處愈合良好，未見感染。各組動物均能存活至實驗結束。

1.4病理觀察于造模后第3天及第1、2、3、4周取樣，將跟腱組織后置于10%甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成厚度為4 μm切片，進行HE染色，普通光學顯微鏡下觀察跟腱組織的病理變化。

1.5免疫組織化學染色于造模后，觀察跟腱斷裂部位的病理形態及轉化生長因子(TGF)-β1表達，注射抑肽酶后第3天及第1、2、3、4周處死白兔，進行標本采集。固定于10%甲醛，經石蠟包埋后，縱切厚4 μm標本，進行免疫組織化學檢測。

2　結　果

2.1各組家兔跟腱病理組織結構的變化圖1，圖2可見，術后第3天，模型組斷面可見大量炎性細胞浸潤，纖維細胞較少，組織間水腫明顯；術后第1周，炎性細胞仍多見，膠原纖維少，排列雜亂；術后第2周斷面有肉芽組織形成，同時可見薄壁新生毛細血管生成；術后第3周炎性細胞少量浸潤，成纖維細胞數量增多，但未成熟細胞較多，細胞呈圓形或軟圓形部分；術后第4周，斷面可見瘢痕形成，膠原纖維排列不規則，可見少量的炎性細胞。

抑肽酶治療組術后第3天斷面附近有一定量的炎性細胞，纖維細胞可見，組織水腫不明顯；術后第1周，大量的成纖維細胞增生，膠原纖維多，炎性細胞少量浸潤；術后第2周，膠原纖維排列較規則，術后第3周時膠原纖維排列緊密，且縱向生長呈條索狀；術后第4周可見成熟呈梭型的纖維細胞，未見明顯炎性細胞。

2.2TGF-β1在抑肽酶對家兔跟腱斷裂模型跟腱修復中的表達TGF-β1在正常家兔跟腱有少量表達，而在模型組及抑肽酶治療組可見大量表達，主要在斷端組織中的炎性細胞、新生毛細血管內皮細胞、成纖維細胞中表達；術后第3天及第1周抑肽酶治療組表達量高于模型組，但第2～4周時抑肽酶治療組中表達量明顯減少且低于模型組，見圖3，圖4。

圖2　治療組各時間點兔跟腱病理組織結構變化(HE，×200)

圖3　正常組及模型組兔跟腱組織TGF-β1表達(DAB，×200)

圖4　治療組兔跟腱組織中TGF-β1的表達(DAB，×200)

3　討　論

跟腱斷裂是目前骨科學和運動醫學面臨的主要傷病之一。跟腱斷裂后可以導致膠原基質和肌腱細胞的變化。組織病理學顯示，膠原變性，膠原纖維紊亂和稀疏，血管和細胞增多，肌腱細胞梭形結構消失〔5〕。本研究說明成功地制造出家兔跟腱斷裂模型。 抑肽酶是一種廣譜非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，因其有很強的血小板保護作用，能減少術后出血量和縮短創面滲血時間〔6〕；而且抑肽酶通過抑制炎癥反應介質的釋放，預防細胞因子級聯反應，減少細胞黏附、聚集反應〔7〕，被廣泛用于體外循環的心血管手術和多種疾病的治療。近年來學者也嘗試把抑肽酶應用于骨科疾病的治療。靳啟國〔8〕利用抑肽酶對各類蛋白酶均有不同程度的抑制作用，從而防止蛋白或肽類藥物的降解而增加其利用度〔9〕，把與適量抑肽酶與Ⅱ型膠原一起灌服給關節炎模型大鼠，得到抑肽酶可以增強Ⅱ型膠原的治療效果。但Brown等〔10〕報道在隨機對照試驗抑肽酶治療26例跟腱腱病中，在治療結果上沒有發現明顯的統計學差異，可能與其樣本量不足，所得結果缺乏意義有關。 本研究提示把抑肽酶局部注射到血液供應較差的肌腱損傷處，可以減輕炎癥的反應，促進膠原細胞的增生，對肌腱斷裂的修復有一定促進作用。

TGF-β是一組具有多功能的蛋白質，在骨組織、血小板和軟骨組織中含量豐富。目前人體內已經發現了 3種類型的TGF-β，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β的生理功能主要是促進細胞增殖、分化，促進細胞外基質分泌與合成，參與骨的重建等生理過程〔11〕。其中TGF-β1在近年來的實驗研究證實對肌腱的形成、生長及修復過程起著重要的作用，在老鼠跟腱局部予TGF-β1治療后可以提高Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維mRNA的表達〔12〕，用含有TGF-β1的多聚乳酸涂層的髓內針固定大鼠脛骨骨折后，骨折愈合時間明顯縮短〔13〕。本實驗結果進一步驗證了TGF-β參與了跟腱愈合的整個過程。但在術后第3天至1 w時檢測發現，抑肽酶組的TGF-β1高于模型組，這種現象說明抑肽酶可以通過改變TGF-β1的提前表達加速跟腱組織的愈合，而在術后第2～4周時檢測發現，抑肽酶組的TGF-β1的表達量卻低于模型組，這一結果可能和TGF-β1在預防跟腱粘連方面有關。文獻報道，TGF-β1這種細胞因子的過度表達可以致瘢痕形成導致粘連，而適當的抑制TGF-β1表達，抑制膠原細胞的增生，減少膠原纖維的形成，從而抑制跟腱的外源性愈合機制，可以減少粘連的產生〔14〕。由此推測跟腱斷裂術后注射抑肽酶，后期TGF-β1表達下降，是通過抑制了跟腱的外源性愈合機制，進而轉化為依靠腱細胞自身的分化增殖的內源性愈合機制促進跟腱的愈合，減輕了粘連，使跟腱更趨于成熟。

1Maffuli N，Kader D.Tendinopathy of tendo achillis〔J〕.J Bone Joint Surg (Br)，2002；84(1)：1.

2Hess GW.Achilles tendon rupture：a review of etiology，population，anatomy，risk factors，and injury prevention〔J〕.Foot Ankle Spec，2010；3(1)：29-32.

3Vande Vusse LK，Zacharski LR，Dumas MG，etal.Prohemostatic therapy：the rise and fall of aprotinin〔J〕.Semin Thromb Hemost，2010；36(1)：103-12.

4Edmunds LH Jr.Managing fibrinolysis without aprotinin〔J〕.Ann Thorac Surg，2010；89(1)：324-31.

5Fritschy D，Wallensten R.Surgical treatment of patellar tendinitis〔J〕.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，1993；1(2)：131-3.

6Ozer Z，Sudu N，Dusmez D，etal.The effect of aprotinin on ischemia-reperfusion injury in the rabbit kidney〔J〕.Pharmacol Res，2001；44(6)：455-60.

7Landis RC，Asimakopoulos G，Poullis M，etal.The antithrombotic and anti inflammatory mechanisms of action of aprotinin〔J〕.Ann Thorac Surg，2001；72(6)：2169-75.

8靳啟國.口服Ⅱ型膠原及抑肽酶對佐劑型關節炎大鼠治療作用研究〔J〕.泰山醫學院學報，2007；28(9)：677-80.

9Morishita M，Morishita I，Takayama K，etal.Hypoglycemic effect of novel oral microspheres of insulin with protease inhibitor in normal and diabetic rats〔J〕.Int J Pharm，1992；78(1)：9-16.

10Brown R，Orchard J，Kinchington M，etal.Aprotinin in the management of Achilles tendinopathy：a randomised controlled trial〔J〕.Br J Sports Med，2006；40(3)：275-9.

11Wildemann B，Schmidmaier G，Brenner N，etal.Quantification，ioealization，and expression of IGF-1 and TGF-beta 1 during growth factor stimulated fracture healing〔J〕.Galcif Tissue Int，2004；74(4)：388-97.

12Kashiwagi K，Mochizuki Y，Yasunaga Y，etal.Effects of transforming growth factor-β1 on the early stages of healing of the achilles tendon in a rat model〔J〕.J Plast Reconstr Surg Hand Surg，2004；38(2)：193-7.

13Schmidmaier G，Wildemann B，Ostapowicz D，etal.Long-term effects of local growth factor(IGF-1 and TGF-beta 1)treatment on fracture healing.A safety study for using growth factors〔J〕.J Orthop Res，2004；22(3)：514-9.

14Chang J，Thunder R，Most D，etal.Studies in flexor tendon wound healing：neutralizing antibody to TGF-bl increases postoperative range of motion〔J〕.Plast Reconstr Surg，2000；105(1)：148-55.

〔2015-12-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.008

吉林省自然科學基金項目(201215199)

單臣(1968-)，男，主任醫師，主要從事周圍神經及軟組織損傷的研究。

白楊(1971-)，女，主管護師，主要從事護理及心理康復教育研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3368-03；