內嗎啡肽-1對高糖環(huán)境下樹突細胞免疫功能的影響

楊小淮　周　誠　潘治宇　楊麗娟　李正紅

(蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，安徽　蚌埠　233030)

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內嗎啡肽-1對高糖環(huán)境下樹突細胞免疫功能的影響

楊小淮1周誠潘治宇楊麗娟李正紅

(蚌埠醫(yī)學院生理學教研室，安徽蚌埠233030)

目的觀察內嗎啡肽(EM)-1對高糖環(huán)境下樹突細胞(DC)免疫功能的影響。方法從正常人外周血中提取和分離單個核細胞，誘導成為未成熟DC；使用高濃度葡萄糖作為刺激因素，不同濃度的EM-1作為干預因素；分別設高糖組(HG組)、高糖加10-6mmol/L EM-1組(A組)、高糖加10-8mmol/L EM-1組(B組)、高糖加10-10mmol/L EM-1組(C組)。流式細胞術檢測DC表型變化；酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測DC分泌的細胞因子的變化；DC與自體淋巴細胞共培養(yǎng)，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)法檢測T淋巴細胞的增殖能力。結果與HG組比較，A組CD83、CD86、趨化因子受體(CCR)7和CD36表達均上調，B組和C組CD86、CCR7和CD36表達上調；與HG組比較，A組、B組和C組白細胞介素(IL)-12和IL-10的分泌均減少，T淋巴細胞增殖指數均降低，以A組作用明顯。結論EM-1上調高糖環(huán)境下DC表面分子CD83、CD86、CCR7和CD36表達，抑制DC分泌炎性細胞因子IL-12和IL-10，抑制DC的T淋巴細胞增殖能力。

樹突細胞；高糖；內嗎啡肽-1；動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病，免疫和炎癥是致其發(fā)病和發(fā)展的關鍵〔1,2〕。AS是糖尿病(DM)最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生的機制尚未完全清楚，而高血糖作為DM患者體內最具有特征性的改變，在DM血管并發(fā)癥中起著始動和關鍵作用，被認為是AS的獨立危險因素〔3,4〕。樹突細胞(DC)是目前已知功能最強的專職抗原遞呈細胞，最大特點是能刺激初始型T淋巴細胞活化和增殖，而其他的抗原遞呈細胞，如巨噬細胞和B淋巴細胞僅能刺激已活化的T淋巴細胞或記憶T淋巴細胞，因此DC是特異性免疫應答的始動者，其激活T淋巴細胞能力也是巨噬細胞1 000倍。研究表明，DC參與了AS發(fā)生發(fā)展的全過程，在激活和放大AS的炎癥免疫反應中起重要的調控作用〔1〕。高糖可以促進DC成熟和激活T淋巴細胞的能力，并通過自身釋放一些炎癥因子，加速和放大炎癥免疫反應〔5〕。內嗎啡肽(EM)-1是1997年新發(fā)現的內源性阿片肽，被認為是Mu阿片受體(MOR)的內源性配體〔6〕，具有廣泛的生物學作用，如鎮(zhèn)痛、心血管效應和免疫應答等。最新研究發(fā)現EM-1能抑制巨噬細胞吞噬脂質，下調單核-巨噬細胞源性泡沫細胞表面CD36的表達，影響腫瘤壞死因子(TNF)-α 和干擾素(IFN)-γ的釋放，而影響動脈斑塊的形成，可能具有抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用〔7〕。那么EM是否能通過影響DC的分化成熟和免疫功能，而參與AS的形成和發(fā)展，目前尚未見報道。本實驗通過觀察EM-1對高糖環(huán)境下人DC的成熟和免疫功能的影響，以探討EM可能對AS發(fā)生發(fā)展的影響。

1　材料和方法

1.1藥品與試劑淋巴細胞分離液(天津TBD生物技術公司)；無糖型RPMI1640溶液(杭州吉諾公司)；EM-1和D-葡萄糖(SIGMA公司)；抗體：CD83-FITC和CD86-PE(Invitrogen公司)，CD36-FITC、HLA DR-PERCP和CD11c-APC(eBioscience公司)，CD3-APC(天津協科生物公司)；人白細胞介素(rhIL)-10 和rhIL-12酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(R&D公司)。

1.2標本來源用于DC培養(yǎng)的健康人外周血取自本院學生志愿者，年齡18～22(平均20)歲。均排除心臟病或DM史。

1.3DC的誘導培養(yǎng)Ficoll 密度梯度離心法分離正常人外周血得到外周血單個核細胞(PBMC)，用RPMI1640洗滌2 次，用RPMI1640 完全培養(yǎng)基(含10%滅活新生牛血清)調節(jié)PBMC 密度至1×107cell/ml，加入6孔板中，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，洗去非貼壁細胞即淋巴細胞，凍存淋巴細胞。貼壁細胞用含人粒-單集落刺激因子(rhGM-CSF)、rhIL-4的無糖RPMI1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；每隔2 d半量換液，補充等量細胞因子；第7天收獲未成熟DC(imDC)。

1.4高糖環(huán)境下DC的分組誘導培養(yǎng)用無糖RPMI1640完全培養(yǎng)基定濃收集的imDC，按照每孔1×106cell/ml的濃度種進24孔板，每孔加入相同濃度的D-葡萄糖(終濃度為25 mmol/L)和不同濃度的EM-1(HG組、A組、B組、C組的EM-1濃度分別為0、10-6、10-8、10-10mmol/L)，放置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 d。分別收集上清液500 μl，凍存。

1.5鏡下觀察細胞形態(tài)和流式檢測DC表面分子在鏡下觀察各組細胞后，分別收集各組細胞，離心定容后移至流式上樣管，并用CD83-FITC、CD86-PE、CD36-FITC和CCR7-PE熒光標記抗體染色，混勻后避光室溫染色30 min，經磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，2%含多聚甲醛(PFA)200 μl重懸后上流式細胞儀檢測，并用Cellquest軟件和Flow Jo軟件分析。

1.6檢測T淋巴細胞增殖復蘇凍存的同體淋巴細胞，用無糖不完全RPMI1640重懸細胞并調節(jié)濃度為106個/ml。加入羧基熒光素二蠟酸鹽琥珀酰亞胺脂(CFSE)貯存液(終濃度為1 μmol/L)，置37℃水浴箱染色15 min，用無糖完全RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次。取出少部分CFSE染色后的淋巴細胞標記的抗CD3-APC抗體作為原代細胞，置于4℃冰箱內避光保存?zhèn)溆?。收集各組DC細胞，用PBS洗滌3次，洗凈高糖和EM-1。每組按照5 000個DC和106個標記CFSE的淋巴細胞混合加入96孔板中，放置CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 d。分別吸出各組全部細胞，用PBS洗滌3次后，移至流式上樣管，并用抗CD3-APC抗體染色，混勻后避光室溫染色30 min，經PBS洗滌2次，2% PFA 200 μl重懸后上流式細胞儀檢測，用Flow Jo軟件分析得出各組的DC刺激T淋巴細胞的增殖指數(PI)。

1.7ELISA法檢測DC分泌細胞因子IL-10和IL-12的含量解凍各組DC上清液，離心10 min除去顆粒和聚合物，按照ELISA試劑盒中說明書的步驟測定。繪制擬合曲線，R2>0.99，保證了由該曲線及其方程求出的樣本濃度具有很強的可信性。

1.8統計學分析應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、q檢驗。

2　結　果

2.1高糖環(huán)境下EM-1對DC形態(tài)學的影響在葡萄糖濃度為25 mmol/ml環(huán)境下，第9天DC的形態(tài)并沒因EM-1的干預發(fā)生明顯改變。見圖 1。

2.2高糖環(huán)境下EM-1誘導DC表型的變化見表1。與HG組相比，A組CD83、CD86、CCR7和CD36表達均上調，B組和C組CD86、CCR7和CD36表達上調。

圖1　高糖環(huán)境下不同濃度EM-1誘導DC的形態(tài)學變化(×200)

組別CD83CD86CCR7CD36HG組29.56±1.5349.15±2.9528.40±1.2528.25±2.19A組33.78±2.851)58.21±1.272)43.36±3.932)42.02±1.8320)B組29.53±0.993)56.12±0.692)37.24±1.712)3)34.72±1.212)4)C組31.51±3.0255.21±1.692)32.61±1.511)4)5)30.81±1.064)5)F/P值4.0/<0.0522.18/<0.0137.08/<0.0167.13/<0.01

與HG組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與A組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與B組比較：5)P<0.01

2.3高糖環(huán)境下EM-1誘導DC與淋巴細胞共培養(yǎng)后的T淋巴細胞增殖情況變化HG組PI值最高(2.13±0.02)，明顯高于原代(1.21±0.01)，說明高糖作用下的DC能促進T淋巴細胞增殖；3組不同濃度的EM-1干預后的T淋巴細胞的增殖指數分別是A組(1.56±0.04)、B組(1.98±0.03)、C組(1.96±0.03)，均顯著低于HG組(P<0.01)，高濃度A組EM-1作用顯著高于B組和C組(P<0.01)。

2.4高糖環(huán)境下EM-1誘導DC分泌IL-10和IL-12的變化EM-1能顯著抑制高糖環(huán)境下DC炎性因子IL-12和IL-10的分泌。見表2。

表2　高糖環(huán)境下EM-1誘導DC分泌的IL-10和IL-12含量

與HG組比較：1)P<0.01；與A組比較：2)P<0.05，3)P<0.01；與B組比較：4)P<0.01

3　討　論

2型糖尿病(T2DM)致死致殘的重要原因之一就是AS〔8〕，AS是一種與脂質在動脈壁聚集相關和各種炎性細胞參與的慢性炎癥過程，其基本病變是動脈內膜的脂質沉積、內膜灶狀纖維化、粥樣斑塊形成。文獻〔9〕報道DC在人AS病變中的數量明顯增加，而且在炎性浸潤區(qū)域聚集。其中一部分DC吞噬脂質形成泡沫細胞；另一部分DC以成熟形式為主，呈遞抗原激活和促進T淋巴細胞的增殖，并與巨噬細胞和活化的T淋巴細胞聚集一起形成斑塊，在不穩(wěn)定斑塊中DC數量更是增多明顯，并參與斑塊破裂的發(fā)生。

CD36是清道夫受體B家族的一員，主要分布于血管內皮細胞、單核巨噬細胞、DC、血小板和脂肪細胞等。CD36與氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)識別、攝取和泡沫細胞的形成及血管病損處炎癥反應關系密切，是AS發(fā)生發(fā)展過程中非要重要的受體〔10,11〕。EMs是生物體內產生天然的具有阿片樣活性的物質，文獻〔12,13〕報道EMs能通過與免疫細胞表面的MOR結合，影響一些炎性細胞的免疫功能，達到抑制炎癥的作用。EMs還可以保護高糖對內皮細胞的損害〔14〕，通過抑制巨噬細胞源泡沫細胞其表面分子CD36的表達和TNF-α與IFN-γ的釋放，影響動脈斑塊的形成〔7〕。

已有文獻〔5〕報道，高糖可以促進DC成熟、上調CD86等表型的表達和加強DC激活T淋巴細胞的能力，并通過自身釋放一些炎癥因子，加速和放大炎癥免疫反應，從而促進AS的形成。本實驗結果提示EM-1可能進一步活化DC，促進其趨向成熟、加速其遷移活動，增強DC的炎癥免疫反應；EM-1加強DC吞噬脂質能力，參與AS的形成；EM-1抑制DC釋放炎性因子IL-10和IL-12，并抑制T淋巴細胞的增殖，可能具有抗炎和抑制動脈斑塊形成的作用。EM-1對DC免疫功能影響的復雜性，有待進一步研究。

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〔2015-07-25修回〕

(編輯馮超/王一涵)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.009

安徽省教育廳自然科學研究重點項目(KJ2011A202)；蚌埠醫(yī)學院科技發(fā)展基金重點項目(Bykf13A10)

李正紅(1970-)，女，教授，博士，碩士生導師，主要從事免疫性疾病研究。

楊小淮(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事慢性炎癥研究。

R587.1

A

1005-9202(2016)14-3370-03；

1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科