不同頻率電針足三里對運動大鼠腓腸肌核因子-κB、血清腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的影響

孫　彬　李福紅

(濟南市民族醫院，山東　濟南　250012)

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不同頻率電針足三里對運動大鼠腓腸肌核因子-κB、血清腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的影響

孫彬李福紅1

(濟南市民族醫院，山東濟南250012)

目的研究不同頻率電針對運動大鼠腓腸肌核因子(NF)-κB、血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的影響。方法采用Bedford漸增負荷跑臺跑運動模型，用韓式電針儀對運動性疲勞大鼠雙側足三里穴進行2/15 Hz、2/100 Hz兩種不同頻率的刺激，觀察血清睪酮/皮質酮比值、腓腸肌NF-κB含量、血清TNF-α和IL-1β含量的變化。結果①與安靜對照組比較，運動組大鼠血清睪酮/皮質酮比值顯著降低(P<0.05，P<0.01)；②運動組大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β顯著升高(P<0.05，P<0.01)；③運動+2/15 Hz電針組和運動+2/100 Hz電針組兩組大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β與運動后60 min組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；④運動+2/15 Hz電針組大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β與運動+2/100 Hz電針組比較，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。結論①急性運動后可顯著增加大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β含量；②不同頻率電針均可降低急性運動后大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β的含量；③2/15 Hz可能是要篩選的電針消除運動性疲勞的最佳頻率。

電針頻率；運動性疲勞；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-1β

電針抗運動性疲勞實驗已有報道〔1～3〕,提示電針可促進運動性疲勞恢復，但電針抗運動性疲勞的適宜頻率目前仍不清楚。本研究采用Bedford漸增負荷跑臺跑運動模型建立急性運動性疲勞大鼠模型，測定安靜組、運動組大鼠及在不同頻率電針刺激運動性疲勞大鼠后腓腸肌細胞核因子(NF)-κB、血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-1β的變化，探討不同頻率電針抗運動性疲勞的效應，以便篩選更有效的針刺頻率。

1　材料和方法

1.1實驗動物選取50只健康、運動能力正常、體重(260±5)g的雄性SD大鼠，分籠飼養，每籠5只。動物房內保持室溫(20±2)℃，相對濕度45%～65%，自然晝夜節律變化光照，自由進水和食物(國家標準固體混合飼料，購自北京維通利華實驗動物中心)。

1.2實驗分組及選模大鼠常規飼養并適應環境2 d后，隨機分為：安靜對照組、運動后即刻組、運動后60 min組、運動+2/15 Hz電針組和運動+2/100 Hz電針組。造模方案參照Bedford漸增負荷跑臺跑運動模型〔4〕，總運動時間為120 min左右，運動中采用木棒刺激維持運動強度。

1.3治療手段取材當天，于運動后30 min對大鼠進行電針治療30 min，采用28號1寸毫針，75%酒精穴位消毒后針刺大鼠足三里穴(腓骨小頭下0.5 cm)〔5〕，連接韓氏電針儀，頻率不同，波型為疏密波，電流強度為2 mA。安靜對照組：不運動，也不進行電針治療。運動后即刻組：按計劃進行運動訓練，運動后即刻取材。運動后60 min組：按計劃進行運動訓練，運動后60 min后取材。運動+2/15 Hz電針組：運動訓練30 min后，進行電針治療，頻率為 2 Hz、15 Hz交替。電針后即刻取材。運動+電針2/100 Hz組：運動訓練30 min后，進行電針治療，頻率為2 Hz、100 Hz交替。電針后即刻取材。

1.4取材用大鼠專用斷頭大剪刀將大鼠斷頭處死。取全血約5 ml，靜置于4℃冰箱中30 min，待凝固后以3 000 r/min的速度離心20 min，分離血清，分裝于EP管中，置于-80℃冰箱低溫保存，待測。迅速取大鼠腓腸肌適量，浸泡于4%多聚甲醛液中固定，待測。

1.5指標檢測

1.5.1一般情況在實驗過程中詳細記錄大鼠的進食、進水情況，觀察動物皮毛色澤、神態活動、運動能力等。造模開始前及實驗過程中每天記錄大鼠體重變化。

1.5.2血清皮質酮(C)的測定采用放射免疫法測定。將待測血清樣本、125I標記的C和C抗體充分搖勻后，經37℃溫育45 min，加入分離劑混勻，在室溫中靜置15 min，離心15 min，吸棄上清液后，測沉淀物的放射性計數。計算出B/Bo%，查標準曲線得出血清C濃度。

1.5.3血清睪酮(T)的測定采用放射免疫法測定。將待測血清樣本、125I標記的T和T抗體充分搖勻后，經37℃溫育1 h后，加入分離劑混勻，在室溫中靜置30 min，4℃ 3 500 r/min離心15 min，吸棄上清液后，測沉淀物的放射性計數。計算出樣本的B/Bo%，查標準曲線得出血清T濃度。

1.5.4血清IL-1β和TNF-α的測定采用放射免疫法測定。將待測血清樣本、125I標記的IL-1β、IL-1β抗體和TNF-α、TNF-α抗體充分搖勻后，4℃放置24 h以上，加入分離劑混勻，在室溫中靜置15 min，4℃3 500 r/min離心15 min，棄上清液后，測沉淀物的放射性計數。計算出樣本的B/Bo%，查標準曲線得出血清IL-1β和TNF-α濃度。

1.5.5腓腸肌NF-κB的測定取大鼠腓腸肌適量浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h，常規石蠟包埋、切片。NF-κB p65的檢測用免疫組織化學染色法，按試劑盒說明書將切片常規脫蠟至水后，用新鮮3%H2O2滅活內源性酶10 min，PBS洗5 min×2次；置于檸檬酸緩沖液中(pH 6.0)微波修復抗原5 min×2次，PBS洗5 min×2次；滴加一抗(兔抗鼠NF-κB p65亞單位的多克隆抗體，經預實驗定為稀釋度1∶100)，冰箱4 ℃過夜，PBS洗5 min×3次；滴加二抗(羊抗兔IgG)，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×2次；滴加SABC試劑30 min，PBS洗5 min×2次；DAB顯色，顯微鏡觀察，自來水充分沖洗；蘇木素輕度復染；梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，計數腓腸肌細胞中染色陽性的細胞核(呈棕黃色)，以其細胞核陽性數占細胞核總數的百分比，即細胞核的陽性率，作為腓腸肌細胞NF-κB活性的反映。

1.6統計學處理采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2　結　果

2.1血清T/C比值的變化運動后60 min組大鼠血清T/C比值較安靜對照組顯著降低(P<0.01)，運動后即刻組較安靜對照組亦明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1　運動大鼠血清T、C及T/C比值變化

與安靜對照組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

2.2腓腸肌NF-κB含量的變化運動后即刻組大鼠腓腸肌NF-κB的含量〔(16.5±2.8)%〕明顯高于安靜對照組〔(11.2±2.9)%(P<0.05)〕。運動后60 min組大鼠腓腸肌NF-κB的含量〔(41.6±6.0)%〕顯著高于安靜對照組(P<0.01)。運動+2/15 Hz電針組〔(30.5±3.8)%〕和運動+2/100 Hz電針〔(34.9±3.9)%〕組與運動后60 min組相比，前兩組大鼠腓腸肌NF-κB的含量明顯低于后者(P<0.01)。運動+2/15 Hz電針組和運動+2/100 Hz電針組相比，前者腓腸肌NF-κB的含量明顯低于后者(P<0.05)。

2.3血清TNF-α含量的比較運動后即刻組大鼠血清TNF-α含量〔(0.849±0.228)ng/ml〕均明顯高于安靜對照組〔(0.569±0.136)ng/ml，(P<0.05)〕。運動后60 min組大鼠血清TNF-α含量〔(1.009±0.332)ng/ml〕顯著高于安靜對照組(P<0.01)。運動+2/15Hz電針組〔(0.47±0.135)ng/ml〕與運動后60 min組相比，前者大鼠血清TNF-α含量明顯低于后者(P<0.01)。運動+2/100 Hz電針組〔(0.735±0.192)ng/ml〕與運動后60 min組相比，前者大鼠血清TNF-α含量明顯低于后者(P<0.05)。運動+2/15 Hz電針組和運動+2/100 Hz電針組相比，前者血清TNF-α亦明顯低于后者(P<0.05)。

2.4血清IL-1β含量的比較運動后即刻組〔(0.268±0.033)ng/ml〕和運動后60 min組〔(0.277±0.038)ng/ml〕大鼠血清IL-1β含量均高于安靜對照組〔(0.222±0.064)ng/ml(P<0.05)〕。運動+2/15 Hz電針組〔(0.161±0.031)ng/ml〕和運動+2/100 Hz電針組〔(0.203±0.038)ng/ml〕與運動后60 min組相比，前兩組大鼠血清IL-1β含量明顯低于后者(P<0.01)。運動+ 2/15 Hz電針組和運動+2/100 Hz電針組相比，前者血清IL-1β含量明顯低于后者(P<0.05)。

3　討　論

血清T/C比值是評定運動性疲勞的常用指標，本實驗結果表明運動性疲勞動物模型造模成功。

NF-κB活化是機體效應細胞大量釋放促炎細胞因子的關鍵環節〔6〕。在TNF-α啟動子上存在著NF-κB 結合位點,有實驗也證明NF-κB 對TNF-α的表達具有調節作用〔7〕。TNF-α是運動中最早產生的關鍵的細胞因子,可誘導產生多種炎癥介質,如IL-1β、IL-6等的產生。有研究顯示〔8，9〕，運動激活肌肉中NF-κB繼而引起炎癥的級聯放大效應，加重肌肉損傷。而運動尤其是大強度運動可導致腓腸肌NF-κB和血漿IL-1β、TNF-α升高。Veneroso等〔10〕報道小鼠急性運動(速度為25 m/min，10%坡度，持續時間為60 min)后，骨骼肌中NF-κB活性升高，血清TNF-α、IL-1濃度亦升高。Richard〔11〕報道小鼠在跑臺上以20 m/min運動5～60 min后，在訓練后的1～3 h，在腓腸肌的紅肌中，NF-κB活性增加了50%。朱榮〔12〕報道大鼠進行1次大強度上坡跑運動(25 m/min，5%坡度,1 h)，發現對照組運動后1h細胞核NF-κB結合DNA能力非常顯著高于安靜時(P<0.01)。Liao等〔13〕觀察到SD大鼠以25 m/min在-10%跑臺上運動1、2 h后，血清中TNF-α明顯升高。Moldoveanu等〔14〕讓受試者在60%～65%VO2max強度運動3 h，血漿IL-1β濃度在運動至1 h顯著增加，運動至3 h達到最高值。本實驗結果提示電針可降低運動性疲勞大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β的含量，有緩解運動性疲勞的作用。在刺激強度、刺激時間等因素固定的情況下，2/15 Hz電針緩解運動性疲勞的效果優于2/100 Hz電針。這與以往的研究報道一致〔15,16〕。因此，低頻電針可能是電針消除運動性疲勞的最佳頻率。

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10Veneroso C,Tunon MJ,Gonzalez-Gallego J,etal.Melatonin reduces cardiac inflammatory injury induced by acute exercises 〔J〕.J Pineal Res,2009；47(2):184-91.

11Richard CH.Regulation of I kappa B kinase and NF-kappa B in contracting adult rat skeletal muscle〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol ,2005;289(4):794-801.

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13Liao P,Zhou J,Zhang Y，etal.Eccentric contraction induces inflammatory responses in rat skeletal muscle:role of tumor necrosis factor-α〔J〕.Am J Physiol Integr Comp Physiol,2010；298:R599-607.

14Moldoveanu AI,Shephard RJ,Shek PN.Exercise elevates plasma levels but not gene expression of IL-1 beta，IL-6,and TNF-alpha in blood mononuclear cells 〔J〕.J Appl Physiol,2000；89(4):1499-504.

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〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.016

孫彬(1972-)，女，碩士，副主任醫師，主要從事全科醫學研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3387-03；

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