舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響

趙　方　銀　瑞

(鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院麻醉科，河南　南陽　473000)

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舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響

趙方銀瑞1

(鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院麻醉科，河南南陽473000)

目的研究不同濃度舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡和分化的影響。方法從孕14 d的Wistar大鼠中分離胚胎神經(jīng)干細胞并培養(yǎng)，采用神經(jīng)干細胞標記蛋白Nestin免疫熒光染色對胚胎神經(jīng)干細胞進行鑒定；BrdU滲入法檢測不同濃度舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞增殖的影響；采用流式細胞儀檢測不同濃度舒芬太尼對胚胎干細胞凋亡的影響；NeuN/DAPI、GFAP/DAPI雙染標記神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞以檢測不同濃度蘇芬太尼對胚胎干細胞分化的影響。結(jié)果從孕14 d的Wistar大鼠中分離得到大鼠胚胎神經(jīng)干細胞，經(jīng)過不同濃度的舒芬太尼處理后，發(fā)現(xiàn)低濃度(0.5 nmol/L)的舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化沒有明顯影響，而隨著劑量增大至中濃度(5 nmol/L)時可以引起細胞的凋亡和分化，增加至高濃度(50 nmol/L)時可以抑制胚胎神經(jīng)干細胞的增殖。結(jié)論高劑量的舒芬太尼可能通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

舒芬太尼；神經(jīng)干細胞；胚胎神經(jīng)干細胞；增殖；凋亡；分化

在所有阿片類制劑中，舒芬太尼的鎮(zhèn)痛效果最強〔1〕，但是，目前舒芬太尼對神經(jīng)干細胞的影響尚未見報道。神經(jīng)干細胞具有多向分化的潛能，還具有很強的跨系或跨胚層分化潛能，能夠轉(zhuǎn)化為造血細胞并重建造血系統(tǒng)，還能夠分化為肌細胞。因此，神經(jīng)干細胞也被稱為神經(jīng)多潛能干細胞〔2～5〕。另外，神經(jīng)干細胞具有自我維持和更新能力，通過對稱分裂和不對稱分裂，能夠在某一確定部位維持穩(wěn)定的數(shù)量，并在必要時進行增殖〔6〕。本研究旨在研究不同濃度舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響。

1　材料和方法

1.1材料實驗于2014年6月至2015年8月在鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院病理實驗室完成。舒芬太尼(枸櫞酸舒芬太尼注射液)購買自宜昌人福藥業(yè)有限公司，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成母液(100 nmol/L)，-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩istar大鼠20只購自中國科學院上海實驗動物中心。分為對照組(等體積PBS緩沖液)，低濃度組(0.5 nmol/L)，中濃度組(5 nmol/L)及高濃度組(50 nmol/L)。BrdU(美國Sigma-Aldrich)，DMEM/F12細胞培養(yǎng)液(美國Hyclone)，B27添加劑、N2添加劑、BFGF、EGF(美國Sigma-Aldrich)，Nestin單克隆抗體、NeuN單克隆抗體、GFAP單克隆抗體、BrdU單克隆抗體(美國Chemicon)，F(xiàn)ITC熒光標記二抗(北京中杉公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，免疫熒光分析儀(美國perkin Elmer)。

1.2方法

1.2.1胚胎神經(jīng)干細胞的分離及培養(yǎng)將孕14 d的Wistar大鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)分離出胚胎大腦，PBS沖洗，無菌條件下去除頭皮及腦膜，分離出腦組織。將分離出的腦組織剪切成細小組織塊，胰蛋白酶消化，吹打，過濾后，離心。細胞沉淀用無血清培養(yǎng)液(DMEM/F12 1∶1)洗滌2次，加入神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液〔DMEM/F12，含2%B27，1% N2添加劑，20 ng/ml表皮生長因子(EGF)，20 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，青霉素200 U/L及鏈霉素100 U/L，pH7.4〕。將細胞吹打成單細胞懸液后，臺盼藍染色進行細胞計數(shù)，培養(yǎng)瓶中接種密度為4×109/L。原代克隆形成后，6～9 d克隆傳代1次，每2～3 d半量換液，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。

1.2.2胚胎神經(jīng)干細胞鑒定取傳代2次的細胞懸液滴入多聚賴氨酸包被的玻片上，待細胞貼壁后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次，加入0.25%的Triton-100孵育5 min，再以山羊血清封閉30 min。封閉結(jié)束后，加入抗Nestin單克隆抗體4℃過夜，PBS清洗3次后，加入異硫氰基熒光素(FITC)標記的二抗，室溫孵育60 min，PBS清洗3次，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3細胞增殖檢測將細胞以5×104個/孔接種于多聚賴氨酸包被過得48孔板中。待細胞貼壁后，藥物處理組加入舒芬太尼，使終濃度為0.5、5、50 nmol/L，對照組加入等體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔5 μmol/L BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗后95%乙醇固定30 min，BrdU和4′-6-二脒基-二苯基吲哚(DAPI)雙染，熒光顯微鏡下觀察，記錄陽性細胞數(shù)。

1.2.4細胞凋亡檢測取傳代2次的神經(jīng)干細胞球，吹打成單細胞懸液，并將計數(shù)后的細胞懸液加入6孔板中，每孔約5×105個。待細胞完全貼壁后，加入舒芬太尼，使終濃度為0.5、5、50 nmol/L，對照組加入等體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。孵育完成后，胰蛋白酶消化并收集每孔的細胞，預冷的PBS清洗3次。70%的乙醇固定，4℃過夜，離心棄去固定液，PBS清洗2次，再用Binding Buffer重懸，每孔加入各5 μl的Annexin V-FITC和PI，室溫避光反應后，流式細胞儀進行分析，計算細胞凋亡率。

1.2.5胚胎神經(jīng)干細胞分化檢測將傳代2～3次生長良好的神經(jīng)球吹打成單細胞懸液，以1×105/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被過的48孔板中，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液中加入工作濃度為0.5、5、50 nmol/L的舒芬太尼，空白對照加入等體積的PBS緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液為不含藥物的干細胞培養(yǎng)液，72 h后固定細胞，分別進行NeuN/DAPI、GFAP/DAPI雙染標記神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞，觀察細胞并計數(shù)。

1.3主要觀察指標大鼠胚胎神經(jīng)干細胞的分離及鑒定，不同濃度的舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS14.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1大鼠胚胎神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果在分離出的胚胎干細胞原代培養(yǎng)2～3 d后可見由單個細胞形成的神經(jīng)球或數(shù)個細胞聚集形成的神經(jīng)球懸浮于培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)5～7 d后可見懸浮的神經(jīng)球數(shù)目明顯增多，經(jīng)過幾代培養(yǎng)后，只有具備自我更新能力的神經(jīng)干細胞能夠存活并增殖成懸浮生長的神經(jīng)干細胞球。利用Nestin免疫熒光染色觀察結(jié)果顯示，神經(jīng)干細胞增殖形成的細胞團有顯著的熒光這色現(xiàn)象，證明了神經(jīng)干細胞呈現(xiàn)Nestin陽性，神經(jīng)球主要是由神經(jīng)干細胞組成的。見圖1。

圖1　Nestin免疫熒光染色結(jié)果(×100)

2.2舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞增殖的影響對照組的陽性細胞比例為(45.68±6.98)%，舒芬太尼低濃度劑量組為(42.95±3.96)%，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；中濃度劑量組為(39.95±4.56)%，與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；高濃度劑量組為(32.26±3.25)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞凋亡的影響不同濃度的舒芬太尼處理大鼠胚胎干細胞48 h后，對照組細胞的凋亡率為(21.92.26±2.98)%，低濃度處理組為(24.56±2.59)%，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；中濃度處理組為(31.65±3.36)%，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；高濃度組為(38.86±4.26)%，與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。

2.4舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞分化的影響使用NeuN/DAPI、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)/DAPI雙染標記神經(jīng)元細胞及星形膠質(zhì)細胞，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，對照組中神經(jīng)元細胞的比例為(15.16±1.87)%，星形膠質(zhì)細胞的比例為(14.89±1.68)%；舒芬太尼低劑量組分別為(18.59±1.36)%，(16.20±1.68)%，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；中劑量組分別為(21.56±3.69)%，(25.56±2.45)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；高劑量組分別為(26.23±2.35)%和(28.26±2.65)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

3　討　論

隨著對舒芬太尼研究的不斷深入，其應用范圍也在不斷地擴大。楊金鳳等〔7〕報道，舒芬太尼在臨床常用劑量范圍內(nèi)對肝癌細胞的增殖和凋亡無明顯影響，但隨著濃度的增加，舒芬太尼可以抑制肝癌細胞的增殖、誘導細胞的凋亡、并將細胞周期阻滯在G1期。高巍等〔8〕報道，不同濃度的舒芬太尼處理肝癌(Hep3B)細胞可以降低細胞活性、使細胞周期阻滯在G0/G1期，誘導細胞凋亡、降低survivin蛋白的表達量，提高(caspase-3)蛋白的表達量。還有研究顯示，不同濃度的舒芬太尼可以抑制H9C2細胞缺氧復氧后損傷，提高細胞的活力，說明舒芬太尼可以濃度依賴性的增強細胞抗缺氧復氧損傷能力〔9〕。

神經(jīng)干細胞的分離主要是利用培養(yǎng)基篩選出能夠在該條件下存活并增殖的神經(jīng)干細胞群(神經(jīng)球)，而成熟的神經(jīng)細胞則無法較長時間的存活。首先將神經(jīng)組織通過機械方法制備成單細胞并培養(yǎng)與含有特殊營養(yǎng)添加劑和促增殖因子的無血清培養(yǎng)基中，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可獲得呈神經(jīng)球狀生長的神經(jīng)干細胞群體〔10〕。本實驗神經(jīng)干細胞呈神經(jīng)球狀生長，將神經(jīng)球吹打分散成單細胞后，單個細胞即可增殖成神經(jīng)球，也可由數(shù)個細胞聚集形成小神經(jīng)球結(jié)構(gòu)，這種小的神經(jīng)球再增殖成較大的神經(jīng)球。

BrdU是胸腺嘧啶核苷類似物，可以取代可代替胸腺嘧啶核苷插入正在復制的DNA雙鏈中并進入子代細胞中，通過檢測DNA中BrdU的含量來特異性的顯示增殖狀態(tài)的細胞，實驗動物體內(nèi)無內(nèi)源性的BrdU存在〔11〕。本研究提示高劑量的舒芬太尼可能干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)干細胞的增殖，從而對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

Bovill等〔12〕報道，臨床上有效靶控舒芬太尼的低、中劑量濃度為0.4～0.8 ng/ml，大劑量濃度為4～6 ng/ml，可單位換算為0.01～0.016 μmol/L。本研究結(jié)果提示，高劑量的舒芬太尼可能通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

1Hakkim A，Kirubahar R，Kanna V，etal.Comparative study of 0.5% hyperbaric bupivacaine with sufentanil(5 μg)and 0.5% hyperbaric bupivacaine for spinal anesthesia〔J〕.Int J,2015；20151193.

2Song J，Zhong C，Bonaguidi MA，etal.Neuronal circuitry mechanism regulating adult quiescent neural stem-cell fate decision〔J〕.Nature,2012；489：150-4.

3Streckfuss-B?meke K，Wolf F，Azizian A，etal.Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells，hair keratinocytes，and skin fibroblasts〔J〕.Eur Heart J,2013；34(33)：2618-29.

4Azim K，F(xiàn)ischer B，Hurtado-Chong A，etal.Persistent wnt/β-catenin signaling determines dorsalization of the postnatal subventricular zone and neural stem cell specification into oligodendrocytes and glutamatergic neurons〔J〕.Stem Cells,2014；32(5)：1301-12.

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6Azevedo-Pereira RL，Daadi MM.Isolation and purification of self-renewable human neural stem cells for cell therapy in experimental model of ischemic stroke〔J〕.Methods Mol Biol,2013;1059：157-67.

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8高巍，張曉琪，景桂霞，等.舒芬太尼抑制肝癌HepGb細胞活性及促進凋亡作用〔J〕.西安交通大學學報：醫(yī)學版，2015；36(3)：479-82.

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11Duque A，Rakic P.Identification of proliferating and migrating cells by brdu and other thymidine analogs：benefits and limitations〔J〕.Immunocytochem Relat Techniq，2015;(101)：123-39.

12Bovill JG，Sebel PS，Blackburn CL，etal.The pharmacokinetics of sufentanil in surgical patients〔J〕.Anesthesiology,1984；61(5)：502-6.

〔2015-10-26修回〕

(編輯袁左鳴)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.022

趙方(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事麻醉學基礎(chǔ)研究。

R614

A

1005-9202(2016)14-3402-03；

1鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院胸外科