Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的作用

周翔宇　田　琳　周　悅　戴　樂　劉　爽　周慶偉

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林　長春　130033)

?

Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的作用

周翔宇田琳1周悅2戴樂劉爽1周慶偉1

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林長春130033)

目的研究Lipofectamine2000下轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞C6的作用。方法取對(duì)數(shù)生長期的C6細(xì)胞隨機(jī)分為Mack組、Scramble組和pSiRNA-STAT3組采用MTT法檢測C6細(xì)胞在不同時(shí)間段(6、8、10 h)細(xì)胞增殖活性；熒光顯微鏡觀察吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)檢測細(xì)胞凋亡及線粒體膜電位變化。結(jié)果Lipo2000轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒在8 h時(shí)對(duì)C6細(xì)胞具有明顯的抑制作用；鏡下觀察pSiRNA-STAT3組可見典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征性改變；線粒體膜電位顯著降低。Mock組與Scramble組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；pSiRNA-STAT3組與Scramble組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論Lipo2000 轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒可能通過降低線粒體膜電位，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤生長的作用。

pSiRNA-STAT3質(zhì)粒；神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；線粒體膜電位

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制尚未十分清楚，研究顯示，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)〔1～3〕。傳統(tǒng)的治療原則是術(shù)后先放療后化療或單獨(dú)放療/化療，但都難以提高其臨床療效〔4〕。研究已證明，利用小干擾 RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)或小分子抑制劑調(diào)低 STAT3蛋白的表達(dá)具有抗腫瘤作用〔5～7〕。因此，STAT3可作為惡性腫瘤的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究Lipofectamine 2000 c Lipo2000,轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞作用的影響。

1　材料與方法

1.1材料腦神經(jīng)膠質(zhì)C6細(xì)胞株：購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；主要試劑：①Opti-MEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司產(chǎn)品，編號(hào)：1267487)；②Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(美國，編號(hào)：1345247，)；③線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，編號(hào)：C2006)。主要藥品：①溴乙啶(EB，美國Sigma公司，批號(hào)：E8751)；②吖啶橙(AO，中國北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：1AB10220)；③二甲基亞砜 、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均為美國Sigma公司產(chǎn)品。主要儀器：① 熒光顯微鏡 NiKon ECLIPSE 80i(日本尼康公司)；②二氧化碳培養(yǎng)箱(日本 三樣電機(jī)株式會(huì)社制造，型號(hào)：NCO-15AC)；③AN YANG超凈臺(tái)(中國 蘇州安洋科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：BSC-BOOⅡB2)；④ 酶標(biāo)儀(中國 上海BIO-RAD公司，型號(hào)：MODEL550)。

1.2方法

1.2.1Lipo2000 轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒濃度的配置設(shè)4個(gè)EP管，分別標(biāo)記A、B、C、D，每管加入550 μl Opti培養(yǎng)基。A和B分別加入8.8 μl的pSiRNA-STAT3和Scramle質(zhì)粒。C和D每管分別加入22 μl Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑，將上述C管與A管混合，D管和B管混合，混均后室溫放置20 min，取對(duì)數(shù)生長期的C6細(xì)胞隨機(jī)分為Mack組、Scramble組和pSiRNA-STAT3組分別向pSiRNA-STAT3和Scramble組加入上述配制的混合物，輕輕搖均，按不同實(shí)驗(yàn)方法用藥。

1.2.2MTT比色法檢測細(xì)胞活力①取對(duì)數(shù)生長期C6細(xì)胞用0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液1×104/ml，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液接種到96孔板，置于37℃，5%CO2下孵育；②隨機(jī)分為Mock、Scramble和pSiRNA-STAT3組，各設(shè)8個(gè)復(fù)孔，按分組給藥(參照方法1.2.1)；③檢測6、8、10 h細(xì)胞生長情況；④在實(shí)驗(yàn)各時(shí)間點(diǎn)每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，孵育4 h，棄上清；加入DMSO 150 μl，置于震蕩儀震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解；⑤使用酶聯(lián)免疫儀檢測OD值，吸收波長設(shè)為490 nm。

1.2.3AO/EB雙染①細(xì)胞爬片：取對(duì)數(shù)生長期C6細(xì)胞用0.25%胰酶消化。調(diào)整細(xì)胞懸液3×105ml接種六孔板，37℃，5%CO2下孵育；②每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，按分組給藥(參照方法1.2.1)，每孔終體積2 ml。37℃，5%CO2下孵育8 h；③取出爬滿細(xì)胞的蓋玻片置于載玻片上，在蓋玻片上滴加AO和EB染液各5 μl，立即在熒光顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，取其均數(shù)計(jì)算細(xì)胞程序性凋亡率。

1.2.4線粒體膜電位檢測(JC-1)① 取對(duì)數(shù)生長期C6細(xì)胞用0.25%胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)為3.0×105/ml，接種在6孔板，實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性空白對(duì)照組、Mock組、Scramble組及pSiRNA-STAT3組。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)液；②加入無雙抗10%DMEM培養(yǎng)液，按分組給藥(方法參照1.2.1)，終體積為2 ml，置入37℃，5%CO2下孵育；③轉(zhuǎn)染8 h，陽性空白對(duì)照組每孔加入CCCP(CCCP按照1∶1 000的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中)；Scramble與pSiRNA-STAT3組每孔加入0.5 ml JC-1染色工作液。37℃孵育20 min，棄掉上清液，用冰浴JC-1(1×)緩沖液沖洗細(xì)胞2次，每孔加入1 ml培養(yǎng)液；④熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長530 nm。隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，取其均數(shù)計(jì)算細(xì)胞程序性凋亡率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1MTT法檢測細(xì)胞活性在6 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組之間抑制作用無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在8 h時(shí)，pSiRNA-STAT3組對(duì)C6細(xì)胞具有明顯的抑制作用，與Scramble比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在10 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示細(xì)胞生長10 h pSiRNA-STAT3對(duì)C6細(xì)胞生長無抑制作用。見表1及圖1。

2.2轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)C6細(xì)胞雙染(AO/EB)熒光染色觀察細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞8 h后用AO/EB染色在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，Mock組可見大量被染成綠色的正常細(xì)胞，細(xì)胞呈梭形，胞核完整，界限清楚。pSiRNA-STAT3組綠色細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，紅色凋亡細(xì)胞數(shù)目顯著增多，pSiRNA-STAT3組細(xì)胞凋亡率(0.34±0.04)與Mock組(0.12±0.03)及Scramble組(0.17±0.02)比較顯著性均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Mock組與Scramble組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

表1　pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的影響(OD值，

與Scramble組比較:1)P<0.05

2.3轉(zhuǎn)染 pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)C6細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響 熒光顯微鏡下可見：陽性空白對(duì)照組在CCCP處理20 min后呈綠色熒光，Mock組細(xì)胞狀態(tài)良好，呈紅色熒光，胞質(zhì)著色深，可見少量凋亡細(xì)胞；Scramble組細(xì)胞狀態(tài)良好，可見許多分布均勻的紅色熒光，少許綠色熒光；pSiRNA-STAT3組可見許多綠色熒光，少許紅色熒光。 結(jié)果表明，pSiRNA-STAT3組(0.33±0.10)與Mock組(0.06±0.03)及Scramble組(0.13±0.03)比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Scramble組與Mock組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖1　pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖活性的影響(OD)值(×20)

圖2　轉(zhuǎn)染PsiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)C6細(xì)胞凋亡的影響(AO/EB)(×20)

圖3　轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒對(duì)C6細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響(×20)

3　討　論

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，目前顱內(nèi)腫瘤發(fā)生的病因尚未完全清楚，近些年來一些轉(zhuǎn)錄因子逐漸被發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谡{(diào)節(jié)腫瘤的相關(guān)基因方面起著重要作用。研究顯示，STAT3與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，STAT3 在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在異常活化〔8〕。而且多數(shù)惡性腫瘤，如前列腺癌、宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及骨髓瘤中均發(fā)現(xiàn)了STAT3 的異常活化，上述結(jié)果證實(shí)了腫瘤的發(fā)生與 STAT3 蛋白的異常活化可能存在一定的相關(guān)性。因此，致癌基因STAT3與腫瘤的研究成為熱點(diǎn)，其抑制劑被認(rèn)為是一種潛在的抗腫瘤藥物〔9〕。已有研究證實(shí)，通過RNA干擾技術(shù)抑制STAT3后能夠減弱細(xì)胞的增殖〔10〕。這些發(fā)現(xiàn)使STAT3 成為腫瘤治療中的重要靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)提示，pSiRNA-STAT3對(duì)C6細(xì)胞具有明顯的抑制作用，而且證實(shí)了Lipo2000轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒后在8 h時(shí)能夠明顯抑制C6腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，正常情況下，JC-1是維持線粒體進(jìn)行正常氧化磷酸化并產(chǎn)生三磷酸腺苷的必要條件可是保持線粒體正常功能。線粒體跨膜電位的消失是一個(gè)不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞凋亡過程的標(biāo)志。因此，可以認(rèn)定線粒體跨膜電位的消失能夠較早的，并不可逆轉(zhuǎn)地決定了細(xì)胞凋亡的命運(yùn)〔11〕。本研究顯示轉(zhuǎn)染pSiRNA-STAT3質(zhì)粒可能直接作用于C6細(xì)胞線粒體，使線粒體膜通透性增加，跨膜電位下降，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制可能與線粒體膜電位下降有關(guān)。

1Sancho-Martinez I，Martin-Villalba A.Tyrosine phosphorylation and CD95：a FAScinating switch〔J〕.Cell Cycle，2009；8(6)：838-42.

2Eisele G，Roth P，Hasenbach K，etal.APO010，a synthetic hexameric CD95 ligand，induces human glioma cell death in vitro and in vivo〔J〕.Neurol Oncol，2011；13(2)：155-64.

3Konkankit VV，Kim W，Koya RC，etal.Decitabine immunosensitizes human gliomas to NY-ESO-1 specific T lymphocyte targeting through the Fas/Fas ligand pathway〔J〕.J Transl Med，2011；9：192.

4Zhao JX，Liu XQ，Dong BJ.Primary study of bevacizumab combined with temozolomide for recurrent glioma〔J〕.Chin Clin Oncol，2011；16(10)：920-2.

5Fuh B，Sobo M，Cen L，etal.LLL3 inhibits STAT3 activity，suppresses glioblastoma cell growth and prolongs survival in a mouse glioblastoma model〔J〕.Br J Cancer，2009；100(1)：106-12.

6Li GH，Wei H，Lv SQ，etal.Knockdown of STAT3 expression by RNAi suppresses growth and induces apoptosis and differentiation in glioblastoma stem cells〔J〕.Int J Oncol，2010；37(1)：103-10.

7Gao L，Li F，Dong B，etal.Inhibition of STAT3 and ErbB2 suppresses tumor growth，enhances radiosensitivity，and induces mitochondria-dependent apoptosis in glioma cells〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2010；77(4)：1223-31.

8Chan K S，Cabajal S，Kiguchi K，etal.Epidermal growth factor receptor mediated activation of STAT3 during mutistage skin carcinogenesis〔J〕.Caner Res，2004；64(7)：2382-9.

9Shi ZB，Zhao D，Huang YY,etal.Discovery，synthesis，and evaluation of small-molecule signal transducer and activator of transcription 3 inhibitors 〔J〕.J Chem Pharm Bull(Tokyo)，2012；60(12)：1574-80.

10Madoux F，Koenig M，Nelson Eetal.Modulators of STAT transcription factors for the targeted therapy of cancer(STAT3 activators)〔J〕.J Bethesda(MD)：Nat Center Biotechnol Inform，2010；16：2.

11陳慧莉，李建華，王樹慶.線粒體跨膜電位和細(xì)胞凋亡相關(guān)性的研究〔J〕.醫(yī)學(xué)綜述，2007；13(14)：1041-3.

〔2016-02-19修回〕

(編輯郭菁)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.023

劉爽(1991-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤研究。

周翔宇(1992-)，男，在讀碩士，主要從事普外疾病研究。

R74

A

1005-9202(2016)14-3404-03；

1吉林大學(xué)藥學(xué)院2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院