miRNA-206 靶向細胞周期蛋白D2調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖

黃佳佳　張官嫦　譚　娜　楊曉榮　張?zhí)K園　姚　晉　鄭　洪

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州　遵義　563003)

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miRNA-206 靶向細胞周期蛋白D2調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖

黃佳佳張官嫦1譚娜楊曉榮張?zhí)K園姚晉鄭洪

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州遵義563003)

目的探討miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達及其對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響。方法采用熒光定量PCR方法檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞系中miRNA-206 的表達情況；通過四甲基偶氮唑藍比色(MTT)增殖實驗檢測miRNA-206對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G增殖的影響；生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA-206可能的靶基因，并采用熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C預(yù)測的細胞周期蛋白D2(CCND2)是miRNA-206的靶基因；蛋白質(zhì)印跡方法檢測miRNA-206對CCND2表達的影響。結(jié)果miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達顯著降低(P<0.01)，且神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性度越高，miRNA-206的表達越低(P<0.01)；同時，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中miRNA-206的表達亦顯著降低(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimics上調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G中miRNA-206表達后可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G的增殖能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-206可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G的增殖能力(P<0.01)。通過TargetScan軟件進行生物信息學(xué)預(yù)測顯示CCND2為miRNA-206的功能性靶基因，且得到熒光素報告實驗結(jié)果證實。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-206可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G中CCND2的表達。結(jié)論miRNA-206可通過調(diào)節(jié)CCND2的表達，進而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G的增殖能力，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miRNA-206的低表達與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

miRNA-206；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細胞周期蛋白D2

miRNA-206在多種腫瘤組織中存在異常表達，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1,2〕。然而，關(guān)于miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達及其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前還很少有文獻報道。本研究旨在探討miRNA-206對細胞周期蛋白D2(CCND2)蛋白表達水平的影響及其調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展的作用及相關(guān)機制。

1　材料與方法

1.1臨床資料收集2012年1月至2014年1月于我院進行神經(jīng)膠質(zhì)瘤切除術(shù)的腫瘤及癌旁標(biāo)本50例，均經(jīng)病理證實為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。年齡33～70〔平均(48.78±14.48)〕歲。根據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準進行病理分級。獲取標(biāo)本后迅速保存于液氮中。所有患者術(shù)前均未接受化療和放療。

1.2神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系A(chǔ)172、U87MG、T98G、293ET和PC-3購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心，均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的CO2孵箱中進行培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)生長期開始實驗。

1.3主要試劑胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、TRIzol、miRNA-206 mimics、陰性對照(NC)、anti-miRNA-NC和anti-miRNA-206購自Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒購自Roche公司；熒光素酶檢測試劑盒購自碧云天公司；CCND2抗體購自Abcam公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自Santa Cruz公司。

1.4Trizol法的熒光定量PCR提取神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 50 s，共30個循環(huán)。引物序列：miR-206上游引物：5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'，下游引物：5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'；內(nèi)參對照U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。通過CT值法對得到的數(shù)據(jù)進行定量分析。

1.5細胞轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞傳代至對數(shù)生長期并長至70%融合時開始進行轉(zhuǎn)染實驗。嚴格按照Lipofectamine2000試劑盒的說明書進行轉(zhuǎn)染實驗的相關(guān)操作，并在轉(zhuǎn)染48 h后用于功能實驗。

1.6四甲基偶氮唑藍比色(MTT)增殖實驗實驗用細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下作用4 h后吸出上清，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速震蕩混勻10 min后，波長490 nm處測定OD值。

1.7生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA-206靶基因通過靶基因預(yù)測軟件TargetScans篩選出CCND2作為miRNA-206的靶基因。

1.8熒光素酶報告基因驗證靶基因Targetscan靶基因預(yù)測軟件檢測結(jié)果提示CCND2 mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的1177-1183位點是miRNA-206的可能結(jié)合位點(BS)，體外合成含該位點的DNA片段及含該位點突變體的 DNA片段，克隆至雙熒光素酶啟動子載體pMIR，并共同轉(zhuǎn)染至肺癌細胞中，培養(yǎng)48 h后，采用熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.9Western印跡具體操作方法可參見文獻報道〔3〕。至少重復(fù)3次所有實驗。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞系中的表達情況miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達較正常對照組織顯著降低(P<0.01)，且神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性度越高，miRNA-206的表達越低(P<0.01)；miRNA-206在5種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系中的表達亦顯著降低(P<0.01)。

2.2miRNA-206對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87MG增殖的影響轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimics可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87MG的增殖能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-206可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87MG的增殖能力(P<0.01)。見圖1。

2.3TargetScan預(yù)測miRNA-206靶基因通過CCND2可能為miRNA-206的功能性靶基因。miRNA-206預(yù)測結(jié)合CCND2 3'-UTR的靶位點如圖2所示。為確定miRNA-206是否和CCND2存在直接的相互作用，構(gòu)建含野生型和突變型CCND2的3'-UTR序列的pMIR載體。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型pMIR-CCND2 3'-UTR載體和miRNA-206的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染突變型pMIR-CCND2 3'-UTR載體和miRNA-206的熒光素酶活性未出現(xiàn)顯著降低。

2.4miRNA-206對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G中CCND2表達的影響轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimics可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87MG中CCND2的表達，而轉(zhuǎn)染miRNA-206抑制劑可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U87MG中CCND2的表達。見圖3。

圖1　miRNA-206對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G增殖影響檢測

圖2　TargetScans靶基因預(yù)測軟件預(yù)測miRNA-206靶基因

圖3　miRNA-206對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞T98G中CCND2表達影響檢測

3　討　論

miRNA作為一類非編碼小的RNAs，其長度約為19～25個核苷酸。近年來的相關(guān)文獻研究的結(jié)果均證實miRNA對人類癌癥的進展具有十分重要的作用〔3,4〕。Yunqiao等〔5〕證實miRNA-206在肝癌組織和細胞系中的表達均顯著降低，過表達miRNA-206可抑制胃癌細胞系的增殖，并促進胃癌細胞系的凋亡；Chen等〔6〕研究結(jié)果同樣證實miRNA-206具有抑制子宮內(nèi)膜樣腺癌細胞的增殖和侵襲能力。然而關(guān)于miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤進展中的作用及相關(guān)機制尚未研究清楚。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

miRNAs發(fā)揮作用主要通過下游的靶基因。G1細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)復(fù)合物與哺乳動物細胞的細胞周期調(diào)控密切相關(guān)〔7〕，其過度表達會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，在多種癌癥中均存在CCND2水平的升高〔8,9〕，導(dǎo)致腫瘤細胞無限制的增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果提示可能是CCND2的表達被miRNA-206所調(diào)節(jié)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。總之miRNA-206通過調(diào)控CCND2進而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力。此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中，miRNA-206可作為一種潛在的治療靶點。

1Zhou J,Tian Y,Li J,etal.miR-206 is down-regulated in breast cancer and inhibits cell proliferation through the up-regulation of cyclinD2〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;433(2):207-12.

2Zhang L,Liu X,Jin H,etal.miR-206 inhibits gastric cancer proliferation in part by repressing cyclinD2〔J〕.Cancer Lett,2013;332(1):94-101.

3Zhang Y,Zheng D,Xiong Y,etal.miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally〔J〕.FEBS Lett,2014;588(10):1913-20.

4Hong L,Han Y,Yang J,etal.MicroRNAs in gastrointestinal cancer:prognostic significance and potential role in chemoresistance〔J〕.Expert Opin Biol Ther,2014;14(8):1103-11.

5Yunqiao L,Vanke H,Jun X,etal.MicroRNA-206,down-regulated in hepatocellular carcinoma,suppresses cell proliferation and promotes apoptosis〔J〕.Hepato-gastroenterol,2014;61(133):1302-7.

6Chen X,Yan Q,Li S,etal.Expression of the tumor suppressor miR-206 is associated with cellular proliferative inhibition and impairs invasion in ERα-positive endometrioid adenocarcinoma〔J〕.Cancer Lett,2012;314(1):41-53.

7Kshaunis M,Subhabrata P,Rita K.Induction of apoptosis in G1/S blocked hela cells by r-roscovitine:a preliminary study〔J〕.Proceed Zoolog Soc,2014;67(2):114-25.

8Mermelshtein A,Gerson A,Walfisch S,etal.Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas〔J〕.Br J Cancer,2005;93(3):338-45.

9Dong Q,Meng P,Wang T,etal.MicroRNA let-7a inhibits proliferation of human prostate cancer cells in vitro and in vivo by targeting E2F2 and CCND2〔J〕.PLoS One,2010;5(4):e10147.

〔2015-12-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.025

黃佳佳(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事分子病理研究。

R730.264

A

1005-9202(2016)14-3409-02；

1茅臺集團職工醫(yī)院