川芎嗪對鉗夾子宮血管致胎鼠生長受限的影響

陳建清

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川芎嗪對鉗夾子宮血管致胎鼠生長受限的影響

陳建清

目的探討川芎嗪對鉗夾子宮血管致胎鼠生長受限的影響。方法取SD雌性大鼠60只，受孕后將其分為對照組、模型組、低劑量組以及高劑量組，每組各15只，在孕14d時采用鉗夾子宮血管的方法造模，對照組僅開腹而不鉗夾子宮，低劑量組給予川芎嗪40 mg/kg，高劑量組給予川芎嗪80 mg/kg，孕21d，取其胎鼠測量體質量、腦質量，并比較各組胎鼠腦組織GAP-43水平、海馬GAP-43 mRNA、NSE mRNA表達水平。結果造模后各組胎鼠體質量、腦質量較對照組明顯降低(P<0.05)，FGR發生率明顯增高(P<0.05)，而運用川芎嗪注射液能夠明顯改善胎鼠體質量、腦質量以及FGR發生率(P<0.05)，且高劑量組改善情況明顯優于低劑量組(P<0.05)。結論鉗夾子宮血管能夠導致FGR胎鼠發生率增加，而采用川芎嗪干預則能夠有效改善FGR胎鼠的生長發育狀況。

川芎嗪；鉗夾子宮；生長發育；GAP-43；NSE

胎兒宮內生長受限(fetal growth restriction, FGR)是臨床產科當中的一種重要的并發癥，此類胎兒不僅在宮內的生長發育受到限制，常常還伴有著胎兒神經系統方面的損害[1]。在臨床工作中，對于FGR胎兒主要采用支持療法以及藥物療法，但是其治療的臨床療效卻不甚理想。有相關藥物學實驗研究表明[2]，川芎嗪作為一種新型的鈣離子拮抗劑，具有加強擴張動脈血管、改善機體微循環的作用，同時也有研究顯示[3，4]，川芎嗪對于FGR胎鼠具有腦組織保護作用，其作用機制的研究主要集中在神經生長相關蛋白GAP-43方面。本研究探討分析川芎嗪對鉗夾子宮血管所致FGR幼鼠生長發育的影響及其對GAP-43、神經元烯醇化酶NSE的影響，現將結果報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物選擇SD雌性大鼠60只，60只大鼠均為健康成年大鼠，且均無交配史，大鼠體質量在200～250 g之間；再選擇成熟健康的雄性SD大鼠10只。以上大鼠均購于重慶國家生物產業基地實驗動物中心。大鼠均使用標準顆粒料進行喂養，不限制大鼠的飲食以及飲水，保持動物房相對濕度為22%，室溫22℃。

1.2試劑川芎嗪注射液購于西安漢豐藥業有限責任公司(H61023181)，GAP-43免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，mRNA PCR KIT購于寶生物功能(大連)有限公司，總RNA提取試劑盒以及mRNA提取試劑盒均購于上海朗頓生物科技有限公司。引物有上海生工工程有限公司合成，其引物序列見表1。

表1　各基因引物序列及擴增片段長度

1.3分組及造模

1.3.1妊娠及分組分別將6只雌鼠與1只雄鼠合籠，與次日清晨進行陰道涂片檢查，若發現陰栓或者精子則將其確定為妊娠，并作為妊娠第0天。按照雌鼠受孕的先后順序進行編號，然后將其隨機分為模型組、低劑量組、高劑量組以及對照組，每組15只雌鼠。

1.3.2手術方法大鼠妊娠后14d，按照3 ml/kg體質量使用20%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪開大鼠腹部后暴露大鼠雙側的子宮動脈，使用微小動脈血管夾鉗將大鼠雙側子宮卵巢動靜脈以及子宮動靜脈進行鉗夾，使得雙側弓狀血管的全部血液來源暫時阻斷，從而造成胎鼠缺血。鉗夾30 min之后取下血管鉗，恢復子宮的血供，待子宮卵巢顏色轉紅之后還納子宮，然后關閉腹腔。

1.3.3實驗分組及用藥高劑量組：于開腹前30 min給予大鼠80 mg/kg川芎嗪腹腔注射，手術完成關腹后30 min再次給予80 mg/kg川芎嗪腹腔注射，術后每隔24 h注射一次，直至大鼠妊娠至21d。低劑量組：川芎嗪注射方法同高劑量組，其注射劑量為40 mg/kg。模型組：按照上述注射時間，給予大鼠等體積的生理鹽水腹腔注射。對照組：大鼠開腹后不進行子宮鉗夾，其余步驟與模型組相同。

1.4實驗方法孕21d時，使用20%水合氯醛腹腔注射麻醉，剖腹取出其腹中胎鼠，每胎胎鼠均隨機取四只當天處死，當天處死胎鼠取出腦組織后用濾紙將羊水以及血液洗干凈，然后稱重，再采用斷頭法將其處死，對其肝腦組織稱重。

上述處死的胎鼠稱重后取其腦組織，一半采用免疫組織化學染色方法進行GAP-43蛋白表達的測定，將其腦組織置于10%甲醛溶液當中固定48h，然后做腦正中矢狀切，常規方法制備大鼠腦組織石蠟切片。常規脫蠟水化之后熱修復抗原，加入正常的血清使之封閉半小時，然后加入適量稀釋的GAP-43，在4℃條件下過夜。然后使用PBS清洗，再加入山羊抗小鼠IgG，在37℃條件下孵育30 min，再用PBS清洗3次，滴加SABC，在37℃條件下放置30 min，再用PBS清洗3次，使用DAB顯色，然后用蘇木素復染、脫水、透明、最后封片。

上述處死的另一半胎鼠，采用RT-PCR技術測定海馬中GAP-43、NSE基因的mRNA表達量，處死幼鼠后，迅速分離其大腦海馬組織，然后置于-80℃冰箱內待測。提取海馬組織中的總RNA，通過紫外檢測RNA濃度，然后根據不同RNA濃度確定PCR所需模板量，保持各樣品加入量一致。PCR反應條件為：96℃3min，85℃1min，55℃30s、71℃1min、72℃5min，共進行30個循環，然后取10μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。使用NSE以及GAP-43與β-actin的恢度比值表示NSE mRNA以及GAP-43 mRNA的表達水平。

2　結果

2.1胎鼠體質量、腦質量以及FGR發生率比較各組胎鼠體質量、腦質量以及FGR的發生率比較，模型組、低劑量組以及高劑量組胎鼠其體質量、腦質量較對照組顯著降低(P<0.05)，而FGR發生率較對照組顯著升高(P<0.05)；低劑量組以及高劑量組胎鼠其體質量、腦質量較模型組顯著升高(P<0.05)，而FGR發生率較模型組顯著降低(P<0.05)；高劑量組胎鼠體質量、腦質量較低劑量組顯著升高(P<0.05)，而FGR發生率較低劑量組顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2　各組胎鼠的體質量、腦質量以及FGR的發生率比較結果

注：與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較2)P<0.05；與低劑量組比較，3)P<0.05

2.2免疫組化檢測GAP-43表達各組大鼠免疫組化檢測GAP-43蛋白光度密度值比較，模型組、低劑量組以及高劑量組與對照組比較，GAP-43表達量明顯降低(P<0.05)；低劑量組與模型組比較，GAP-43表達量無統計學差異(P>0.05)；高劑量組與模型組、低劑量組比較，GAP-43表達量顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3　免疫組化檢測各組GAP-43蛋白光度密度值

注：與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與低劑量組比較，3)P<0.05

2.3各組胎鼠海馬GAP-43以及NSE mRNA相對表達量各組胎鼠海馬GAP-43以及NSE mRNA相對表達量，模型組、低劑量組以及高劑量組GAP-43 mRNA相對表達量較對照組顯著降低(P<0.05)；模型組以及低劑量組之間GAP-43 mRNA相對表達量無顯著性差異(P>0.05)；高劑量組GAP-43 mRNA相對表達量較低劑量組、模型組顯著增加(P<0.05)；模型組、低劑量組以及高劑量組NSE mRNA相對表達量較對照組顯著升高(P<0.05)；模型組以及低劑量組之間NSE mRNA相對表達量無顯著性差異(P>0.05)；高劑量組NSE mRNA相對表達量較低劑量組、模型組顯著降低(P<0.05)。見表4。

表4　各組胎鼠海馬GAP-43以及NSE mRNA相對表達量

注：與對照組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與低劑量組比較，3)P<0.05

3　討論

川芎嗪是從我國傳統活血化瘀、理氣中藥川芎當中提取出來的一種主要有效成分，其化學結構為四甲基吡嗪[5]，根據相關藥理學研究結果顯示[6]，川芎嗪能夠有效擴張動脈血管，改善機體的微循環，并且對于缺氧缺血性腦損傷具有著良好的神經保護作用。在本次研究中，造模后各組胎鼠體質量、腦質量較對照組明顯降低(P<0.05)，FGR發生率明顯增高(P<0.05)，而運用川芎嗪注射液能夠明顯改善胎鼠體質量、腦質量以及FGR發生率(P<0.05)，且高劑量組改善情況明顯優于低劑量組(P<0.05)。表明采用鉗夾子宮的方式確實能夠造成胎鼠出現體質量、腦質量下降，增加胎鼠FGR的發生率，使用川芎嗪干預之后，能夠有效降低由于鉗夾子宮造成了胎鼠生長發育受限，增加胎鼠的體質量、腦質量，并且降低胎鼠發生FGR的概率，以高劑量組川芎嗪干預效果更佳，這與國內洪瑩研究結果相似[7]。

神經生長相關蛋白GAP-43是一種主要存在于分化定性并開始軸突生長的神經元當中的鈣離子依賴酸性快速轉移膜蛋白，GAP-43在機體腦功能的活躍階段其大腦表達量最高，與大腦的生長發育、神經元的分化以及神經的某些基礎功能有著非常密切的關系。在本研究中，對胎鼠大腦切片進行免疫組織化學檢驗，其結果顯示，模型組、低劑量組以及高劑量組與對照組比較，GAP-43表達量明顯降低(P<0.05)；低劑量組與模型組比較，GAP-43表達量無統計學差異(P>0.05)；高劑量組與模型組、低劑量組比較，GAP-43表達量顯著升高(P<0.05)。表明了鉗夾子宮造模之后，胎鼠的腦組織GAP-43表達量出現明顯下降，同樣證實造模后FGR幼鼠其大腦發育受到損傷，而通過川芎嗪干預后，低劑量組其腦組織GAP-43表達無明顯變化，而高劑量組胎鼠其腦組織GAP-43的表達則出現明顯的升高，表明了川芎嗪對于FGR胎鼠的腦組織具有一定的損傷保護作用。

海馬是大腦當中非常活躍的一個區域，其大腦海馬當中富含有大量的GAP-43，并且在機體中樞神經學習記憶中起到非常重要的作用，但是有研究結果顯示，海馬中的GAP-43容易受腦組織損傷的影響[8]。在本次研究中，針對胎鼠海馬區GAP-43采用RT-PCR技術檢測其GAP-43 mRNA的表達情況，結果顯示，模型組、低劑量組以及高劑量組GAP-43 mRNA相對表達量較對照組顯著降低(P<0.05)；模型組以及低劑量組之間GAP-43 mRNA相對表達量無顯著性差異(P>0.05)；高劑量組GAP-43 mRNA相對表達量較低劑量組、模型組顯著增加(P<0.05)。表明了鉗夾子宮造模之后，胎鼠海馬區GAP-43 mRNA表達水平顯著降低，采取低劑量川芎嗪干預，其海馬區GAP-43 mRNA表達水平無顯著變化，而采取高劑量川芎嗪干預后[9]，其海馬區GAP-43 mRNA表達水平出現顯著升高。

神經元烯醇化酶NSE腦缺血的一種敏感標志物，國外學者Lamers等人研究發現，圍產期新生兒血清NSE水平顯著升高是新生兒窒息之后發生嚴重腦低氧-缺氧損傷的一個敏感性指標。因此NSE水平與機體神經元的發育、分化以及神經系統的損傷之間具有非常密切的關系。在本研究中，檢測胎鼠海馬區NSE mRNA表達水平的變化情況，其結果顯示，模型組、低劑量組以及高劑量組NSE mRNA相對表達量較對照組顯著升高(P<0.05)；模型組以及低劑量組之間NSE mRNA相對表達量無顯著性差異(P>0.05)；高劑量組NSE mRNA相對表達量較低劑量組、模型組顯著降低(P<0.05)。提示了FGR胎鼠造模之后，其海馬區NSE mRNA表達量增高，胎鼠出現一定程度的神經系統損傷，而通過高劑量川芎嗪干預之后，能夠顯著降低胎鼠海馬區NSE mRNA的表達水平。

由以上結果來看，川芎嗪能夠改善鉗夾子宮血管所致的FGR胎鼠生長發育受限，同時升高GAP-43水平、降低NSE水平，其可能的作用機制為[10]：①川芎嗪能夠有效改善機體的微循環功能，從而能夠擴張孕鼠的子宮動脈，進而有效增加孕鼠胎盤中的血流量，改善由于鉗夾子宮血管而造成的胎鼠缺血缺氧癥狀；②有研究顯示[11]，川芎嗪能夠有效增加機體紅細胞的變形作用，提高SOD活性，抑制機體內脂質過氧化物的產生，改善子宮內環境，從而能夠起到促進胎鼠生長的作用。

綜上所述，鉗夾子宮血管能夠導致FGR胎鼠發生率增加，而采用川芎嗪干預則能夠有效改善FGR胎鼠的生長發育狀況，提高胎鼠腦組織以及海馬區GAP-43表達水平，降低海馬區NSE表達水平，從而對FGR胎鼠起到神經保護作用，且療效與川穹嗪使用劑量相關。

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火麻仁飲片

炮制：火麻仁 除去雜質及果皮。

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歸經：歸脾、胃、大腸經。

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——《中華人民共和國藥典》一部2010版

Effect of TMP on Uterine Vessels Clamping Induced Growth Retardation of Fetal Rat

CHEN Jianqing

(Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fujian, Fuzhou 350004, China)

ObjectiveTo investigate the effect of TMP on uterine vessels clamping induced growth retardation of fetal rat. Methods60 SD female pregnant rats were divided into control group, model group, low dose group and high dose group, and each group had 15 rats. At 14d, the model was made by the method of uterine vascular clamping. The control group onlyP<0.05), FGR were significantly higher (P<0.05). The use of TMP injection can significantly improve fetal rats body weight, brain weight and FGR incidence (P<0.05), and the improvement if the high-dose group was better than that of the low-dose group (P<0.05). ConclusionUterine vessels clamping can lead to increased incidence of FGR, while the use of TMP intervention can improve the growth and development of FGR fetuses.

laparotomy. The low dose group was given TMP 40mg / kg. The high dose group was given TMP 80mg / kg. At 21d, fetuses were measured body weight and brain weight. The GAP-43 levels in brain tissue, hippocampus GAP-43 mRNA, NSE mRNA expression levels of fetal rats in each group were compared. ResultsAfter modeling, the fetal rats body weight and brain weight of the model group, the low dose group and the high dose group was significantly lower than those the control group (

TMP; Clamping uterus; Growth; GAP-43; NSE

福建醫科大學附屬第一醫院藥學部(福建 350004)

10.3969/j.issn.1003-8914.2016.07.020

1003-8914(2016)-07-0946-04

(本文校對：林功舟2015-07-15)