五羥色胺對糖尿病大鼠臟器保護作用研究

王冬梅　董　軻　徐文瑾　 張金魁　黃國英　安月玲　劉　峰

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五羥色胺對糖尿病大鼠臟器保護作用研究

王冬梅董軻徐文瑾 張金魁黃國英安月玲劉峰

青海清華博眾生物技術有限公司(西寧 810016)

摘要：目的研究沙棘提取物中五羥色胺對糖尿病大鼠的臟器保護作用。方法高糖高脂飲食聯合STZ造模糖尿病大鼠模型，隨機分為單用安慰劑組、單用五羥色胺組、沙棘提取物提取五羥色胺組,觀察糖尿病大鼠一般狀況、血糖血脂變化情況。結果模型組在分別給予沙棘提取物提取五羥色胺、單用五羥色胺后，與安慰劑組相比，2組指標變化情況趨勢一致，如下。血糖下降(P<0.01)，血脂下降(P<0.01)，下丘腦五羥色胺含量上升(P<0.01)，外周血五羥色胺含量下降(P<0.01)，其中沙棘提取物提取五羥色胺組和單用五羥色胺組差別不明顯，無統計學意義。結論沙棘提取物中五羥色胺具有通過降低糖尿病大鼠血糖血脂水平從而保護糖尿病大鼠臟器的作用。

關鍵詞：沙棘；沙棘提取物，五羥色胺，糖尿病

大量文獻研究顯示：沙棘提取物在降糖、降血脂、提高免疫力方面療效顯著[1～9]。五羥色胺提取困難，植物來源極為罕見，沙棘提取物中發現的五羥色胺為我們提供了新的研究思路[10]，本課題主要通過外源補充植物源性五羥色胺觀察五羥色胺對糖尿病大鼠血糖血脂的影響，探討植物源性五羥色胺對糖尿病大鼠的臟器保護作用。

1　材料和方法

1.1實驗動物SD大鼠，40只，200～250 g，雄性，購買自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2012～0001。飼養環境通風良好，飼養溫度18～22℃，濕度45～65%。

1.2實驗藥品1.2.1沙棘提取物由青海清華博眾生物技術有限公司提供。采用青海沙棘果、果渣提取成濃度50%水提取物，乙醚、乙酸乙酯和三氯甲烷萃取沙棘水提液，HPLC定量沙棘提取物中五羥色胺含量為2.923μg/ml，沙棘提取物中五羥色胺得率為51%。95%乙醇和2%的鹽酸純化、干燥，收獲純沙棘五羥色胺備用，0.9%生理鹽水溶液臨用前配制，配制終濃度1μg/μl。

1.2.2STZStreptozotocin，鏈脲佐菌素注射液，美國SIGMA公司。按大鼠公斤體質量及所需試劑劑量，用微量秤稱取所需試劑，用雙蒸水配制0.1mol/L、PH=4.5的檸檬酸鈉溶液,檸檬酸鈉溶液配置1%的鏈脲佐菌素溶液，避光、4 ℃保存。按大鼠體質量分別用1ml注射器抽取STZ溶液備用。

1.3試劑大鼠5-羥色胺(5-HT)ELISA檢測試劑盒大連范邦生物科技有限公司。

1.4實驗儀器酶標儀BIO-TEK ELX-800, MagNA Lyser組織勻漿儀。

1.5實驗方法1.5.1糖尿病大鼠模型制備將40只雄性SD大鼠(180±20)隨機選取10只作為對照組(A組)，余下30只大鼠高糖高脂飼料飼喂4周后，腹腔注射STZ造模。造模方法如下。 STZ臨用前溶解在pH=4.0的0.17mmol/L檸檬酸緩沖液內，25mg/Kg，1次/d，連續2d, 注射藥物兩天后測定大鼠空腹血糖(測試前禁食12h)，血糖值監測高于16.7mmol/L顯示造模成功。1.5.2分組將造模成功大鼠隨機分為3組。分別為：安慰劑組(B組)、五羥色胺組(C組)、沙棘提取物提取五羥色胺組(D組)。

1.5.3給藥A組給予腹腔注射0.9%生理鹽水溶液0.3ml/Kg。造模成功后，B組給予腹腔注射0.9%生理鹽水溶液0.3ml/Kg，C組腹腔注射DOI 0.3mg/Kg，D組給予0.9%生理鹽水溶液0.3ml/Kg，各組均自由飲食。

1.5.4標本采集最后一次給藥一周后將大鼠用 10%水合氯醛麻醉(麻醉劑量0.35 mL/100 g),剖腹,腹主動脈采血,約 7～9ml，存放于2個非抗凝管中，其中一管送生化檢驗；另一管 4℃ 3000rpm 離心10分鐘后留取血清存放于-80℃低溫冰箱備用。取大鼠下丘腦。

1.6指標觀察

1.6.1一般情況觀察實驗期間觀察各組大鼠行為學、精神狀態、體重、攝食情況等變化。

1.6.2血糖檢測觀察大鼠用藥前后血糖的變化情況。

1.6.3血清及下丘腦五羥色胺水平檢測[11]大鼠腹主動脈取血少量檢測血糖血脂值，余下標本4℃、3500 r/min離心 10 min, 取上清液, -20 ℃凍存，血清五羥色胺含量按照試劑盒說明書檢測。下丘腦稱重,加 9 倍量冷生理鹽水(生理鹽水的體積為下丘腦質量的 9 倍), 10 000 r/min 研磨制成 10%組織勻漿, 4℃、2000 r/min 離心 10 min,取上清液,-20 ℃保存。按照試劑盒說明書檢測下丘腦五羥色胺含量。

2　結果

2.1一般狀態造模前各組大鼠精神狀態良好、毛色光澤、活潑好動。模型組大鼠在注射STZ后體重呈緩慢增長、逐步較前下降、消瘦走勢,神態倦怠、皮毛散亂無光澤、喜扎堆或蟄伏、觀察發現有多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀。造模成功大鼠28只，實驗組分3組給藥，其中C組和D組大鼠在給藥后精神狀態逐漸好轉,消瘦走勢減緩，體質量有上升趨勢，逐漸由喜扎堆蟄伏狀態開始變得活波，觀察發現多飲多食多尿等癥狀有所好轉，但大鼠整體狀態仍略遜于對照組，安慰劑組大鼠精神狀態最差。

2.2體質量變化對照組大鼠生長良好,體質量持續增加,無其他癥狀。對照組和造模組大鼠分別喂養4周后，造模組大鼠體質量明顯增加，出現明顯的腹型肥胖。STZ注射后，模型組大鼠造模成功28只，隨機分3組分別為安慰劑組(B組)、五羥色胺組(C組)、沙棘提取物提取五羥色胺組(D組)，各實驗組用藥后，大鼠體質量出現不同的變化趨勢。其中對照組(A組)大鼠體質量正常增加，B組大鼠體質量出現初期快速下降，后期下降減緩趨勢；C組、D組用藥后大鼠質量重出現先下降，后逐漸回升趨勢，但體質量仍低于正常組。各組大鼠體質量變化情況如下。見表1。

表1　對照組大鼠與各實驗組大鼠體質量變化

注：2)表示與對照組相比，P<0.01, 差異有統計學意義

2.3各組大鼠血清和下丘腦五羥色胺含量變化情況造模成功后B組大鼠與A組相比，血清中五羥色胺含量升高，下丘腦中五羥色胺含量下降。C組和D組在給藥后，均可見大鼠血清中五羥色胺含量略有下降，與B組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，但不能達到對照組血清中五羥色胺含量水平(P<0.01，差異有統計學意義)；造模后B組大鼠下丘腦五羥色胺含量明顯下降，與A組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，C組和D組經治療后，大鼠下丘腦五羥色胺含量與安慰劑組相比明顯升高(P<0.01，差異有統計學意義)，但含量仍低于A組(P<0.01，差異有統計學意義)，其中D組五羥色胺含量略高于C組，但差異無統計學意義。見表2。

2.4大鼠血清中總膽固醇和甘油三酯含量變化糖尿病大鼠在造模成功后，B組血清中總膽固醇和甘油三酯含量持續升高，與A組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。C組和D組在給藥后，總膽固醇和甘油三酯含量下降，與安慰劑組相比，差異有統計學意義(P<0.01)。其中D組下降程度略大于C組，但差異無統計學意義。見表3。

表2　大鼠各組血清和下丘腦五羥色胺含量

注：2)表示與安慰劑組相比，P<0.01，差異有統計學意義

表3　第13周大鼠對照組及實驗組總膽固醇和甘油三酯含量

注：2)表示與對照組相比，P<0.01, 差異有統計學意義

3　討論

目前國內外對沙棘的研究很多，探討沙棘中新發現成份和功效可以為開發沙棘新產品提供重要的研究及轉化方向。沙棘提取物在降糖、降脂、提高免疫力方面療效顯著。經過國內外專家的不懈努力，沙棘對糖尿病患者的臟器保護作用已經得到了學術上的認可。大量文獻研究顯示：沙棘提取物(沙棘黃酮、維生素、礦物質、微量元素、SOD等)能降低血糖、控制糖尿病的病情進展，提高患者生存質量。五羥色胺作為一種神經遞質，對人體神經、情志、內分泌系統有影響，研究發現糖尿病大鼠體內五羥色胺含量明顯不同于正常大鼠，探討五羥色胺對糖尿病大鼠的臟器影響具有重要意義。

英國劍橋大學Addenbrooke’s醫院周里鋼等[12]研究發現，五羥色胺受體激動劑可以改善2型糖尿病的黑色素皮質素受體通路，通過建立下丘腦-脊髓-外周肌肉-白色脂肪之間有效的中樞神經-外周組織通路,最終改善外周肌肉和脂肪組織的葡萄糖的代謝過程，有效地改善肥胖小鼠葡萄糖耐量和胰島素抵抗，為我們探索通過中樞神經系統作用于外周組織防治2型糖尿病提供了理論基礎。

本研究結合周里鋼等實驗研究基礎，采用體內補充外源性五羥色胺的方法，驗證五羥色胺對糖尿病大鼠血糖血脂的影響，從而判斷五羥色胺是否對糖尿病大鼠具有臟器保護作用。本研究在糖尿病大鼠造模成功后，可見伴隨著糖尿病大鼠血糖、血脂的升高，外周血血清五羥色胺含量逐漸升高，而下丘腦五羥色胺含量反而下降(安慰劑組與對照組相比，差異明顯，P<0.01，具有統計學意義)；當模型組分別給予DOI和沙棘提取物提取五羥色胺后，可見隨著血糖血脂指標的下降，外周血血清中五羥色胺含量反而下降，而下丘腦五羥色胺含量逐漸上升(C組、D組與B組相比，差異明顯，均P<0.01，具有統計學意義)，給藥后兩組血糖、血脂數據變化趨勢向正常大鼠轉變，但均不能達到正常水平(C組、D組與B組相比，差異明顯，均P<0.01，具有統計學意義)。

已有研究表明五羥色胺含量變化可以影響血腦屏障通透性的改變。本研究的結果提示，補充外源五羥色胺可以有效改善糖尿病大鼠血糖血脂指標，其機制可能與補充外源五羥色胺后改變了血腦屏障的通透性，間接提高了下丘腦五羥色胺含量有關。同時，研究發現給藥后，沙棘提取物組對血糖血脂的改善效果明顯優于五羥色胺組(C組與D組相比，差異無統計學意義)，具體機制尚待進一步的研究。總之，本研究顯示沙棘提取物通過外源補充的方式可以有效對糖尿病大鼠起到降糖、降血脂的作用，其中植物源性五羥色胺的作用居功至偉。

最初外源補充的五羥色胺是從動物血液及腸黏膜中提取的，容易產生交叉感染、過敏性反應的現象，并且存在血制品污染和動物中的病毒、細菌感染的危險。為了避免以上問題，從植物中提取天然、綠色的5-羥色胺尤為重要，受限于五羥色胺植物來源極為罕見，沙棘提取物中新發現的五羥色胺為我們提供了一個重要的研究思路。本研究進一步驗證了沙棘提取物中植物源性五羥色胺對糖尿病大鼠的降血糖、血脂的效果，為開發沙棘提取物新產品提供了良好的應用前景。

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文章編號：1003-8914(2016)-05-0655-04

收稿日期：(本文校對：劉言言2015-07-09)

Research on 5-HT in Seabuckthorn Extract Protection Diabetic Rats from Organ Injury

WANG DongmeiDONG KeXU WenjinZHANG JinkuiHUANG GuoyingAN YuelingLIU Feng

(Qinghai Tsinghua Biotry Bio-Tech Company Limited, Qinghai, Xi'ning 810016, China)

Abstract：ObjectiveTo observe 5-HT (5-hydroxytryptamine) in seabuckthorn extract protect diabetic rats from organ injury. MethodsFed high sugar and high fat diet joint low-doses streptozotocin (STZ ) build typeⅡdiabetic rat model. The diabetic rats were randomly divided into the placebo group (group B), use of 5-HT group (group C) and use of seabuckthorn extract group (group D). After diabetic rats were dealt with different treatment methods, the changing of the general condition, blood sugar and blood fat levels in those diabetic rats were observed. ResultsThe model group was given after feeding seabuckthorn extract or using 5-HT respectively, comparing with the placebo group, groups C and D variation tendency were consistent, as follows: the blood sugar (P < 0.01) and blood lipid decreased (P < 0.01), the hypothalamus 5-HT increased (P < 0.01), the peripheral blood serum 5-HT levels decreased (P < 0.01), of which the seabuckthorn extract group and 5-HT group difference were not obvious, there was no statistical significance. ConclusionSeabuckthorn extracts of 5-HT can protect diabetic rats from organ injury through decreasing diabetic rat's blood lipid and sugar levels.

Key words：Seabuckthorn; Seabuckthorn extract; 5-HT; Diabetes