慢病毒介導的CRYAB基因沉默對骨肉瘤細胞增殖和遷移能力的影響

王　劍，趙　龍*

（1.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院東崗院區，甘肅 蘭州 730000）

慢病毒介導的CRYAB基因沉默對骨肉瘤細胞增殖和遷移能力的影響

王劍1，2，趙龍1，2*

（1.蘭州大學第一臨床醫學院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學第一醫院東崗院區，甘肅 蘭州 730000）

目的 應用慢病毒介導的RNA干擾技術，通過體外實驗探討CRYAB基因沉默對人骨肉瘤細胞MG-63增殖和遷移能力的影響。方法 構建靶向CRYAB基因特異性shRNA慢病毒載體并轉染人骨肉瘤細胞MG-63細胞株，利用Real-time PCR和Western Blotting技術分別從mRNA和蛋白質水平檢測其表達的變化。CCK-8法和細胞克隆實驗檢測沉默CRYAB基因后細胞的增殖能力，Transwell遷移實驗檢測細胞的遷移能力。結果 Real-time PCR和Western Blotting結果均表明，成功建立穩定轉染shRNA-CRYAB骨肉瘤細胞MG-63細胞株。CCK8實驗結果顯示shRNA-CRYAB病毒轉染組與陰性對照組相比細胞的增殖能力顯著降低（P〈0.05），尤其在第四、五、六和第七天表現更明顯；細胞克隆實驗結果顯示，shRNA-CRYAB病毒轉染組和陰性對照組的克隆形成率分別為5.2%和26.0%，具有顯著性差異（P〈0.05）。Transwell遷移實驗結果顯示，shRNA-CRYAB病毒轉染組的細胞遷移率明顯低于陰性對照組（P〈0.01）。結論 shRNA-CRYAB慢病毒干擾載體能有效抑制CRYAB基因在人骨肉瘤細胞MG-63中表達，進而抑制細胞增殖和遷移。

慢病毒；CRYAB基因；骨肉瘤；細胞增殖；細胞遷移

骨肉瘤是原發于骨組織的最常見惡性腫瘤，其來源于間葉組織，好發于兒童與青少年［1-2］，惡性程度高，侵襲性強，易發生肺轉移，是一種致死率與致殘率極高的腫瘤，其發生機制尚未完全闡明，且缺乏有效的防治措施。鑒于其多發于兒童及青少年，這一群體的預期存活期長，故需長期應用化療藥物治療。而化療藥物對機體有毒副作用及腫瘤細胞對化療藥物可產生抗藥性是嚴重制約長期化療的關鍵因素［3-4］。因此，研究維持骨肉瘤細胞惡性表型的分子機制，開發可增加骨肉瘤細胞對化療藥物敏感性的基因療法是提高療效的關鍵。

熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSPs）是一組高度保守的肽類蛋白質，在保護細胞免受外界有害刺激方面發揮著重要作用［5］。近年來，小熱休克蛋白在腫瘤發生、發展中的作用越來越受到重視，其在調節細胞周期、分化、凋亡以及致瘤性等方面扮演著重要角色，研究［6］發現，小熱休克蛋白在腫瘤細胞中通常高表達。aB-晶狀體蛋白（CRYAB）是一種小熱休克蛋白，在非小細胞肺癌［7］、頭頸部鱗狀細胞癌［8］和乳腺癌［9］中表達增高，也有研究報道，CRYAB在肝癌細胞中高表達，且對肝癌的侵襲轉移有顯著促進作用［10］，然而目前關于CRYAB對骨肉瘤細胞增殖及遷移能力的研究國內還未見報道，CRYAB作為小熱休克蛋白的另一個重要成員，預示其存在潛在的應用價值，本研究通過慢病毒介導的RNA干擾技術沉默CRYAB基因后觀察其對骨肉瘤細胞MG-63在體外對細胞增殖活性和遷移能力的影響，為骨肉瘤的基因靶向治療提供理論依據，現介紹如下。

1　材料和方法

1.1材料

人骨肉瘤細胞MG-63購自中國科學院上海細胞庫；

DMEM、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶和Opti-mem培養基購自Gibco公司；細胞裂解及蛋白抽提試劑購自Thermo公司；BCA蛋白含量檢測試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Real-time PCR試劑盒購自Takara公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司；Western Blotting配膠試劑盒、SDS-PAGE上樣緩沖液購自碧云天公司；ECL化學發光試劑盒購自Thermo公司；慢病毒載體購自上海吉凱基因化學有限公司；CRYAB抗體購自Abcam公司；CRYAB引物購自上海生工生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人骨肉瘤細胞MG-63用含有10%胎牛血清的DMEM培養液，在5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養，待細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶將貼壁細胞消化吹勻，然后將細胞懸液以1×106孔接種于6孔板，用相同條件進行培養。1.2.2構建慢病毒載體和細胞轉染 慢病毒由上海吉凱公司設計與合成。同時制備空載體作為對照，并將實驗分為陰性對照組和shRNA-CRYAB病毒轉染組。

1.2.3Real-time PCR檢測mRNA水平CRYAB的表達 采用SYBR Green染料法，以GAPDH為內參照。CRYAB mRNA上游引物序列：5’-CTTTGACCAGTTCTTCGGAG-3’，下游引物序列：5’-CCTCAATCACATCTCCCAAC-3’；內參GAPDH上游引物序列：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，下游引物序列：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’。PCR反應條件為：95℃30秒；95℃5秒；60℃34秒；95℃15秒，共40個循環。1.2.4Western Blotting檢測人骨肉瘤細胞 MG-63中CRYAB的表達 SDS-PAGE電泳方法檢測蛋白的表達。用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

1.2.5CCK-8法和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 取兩組對數生長期細胞配置成1×104/mL單細胞懸液接種于96孔板，每孔100 μL，測定1～7天細胞增殖活性。調整細胞密度為5×103/mL，接種至6孔板，10天后，棄去培養液，固定、染色拍照，倒置顯微鏡下計數，大于50個細胞集落為1個克隆，根據公式計算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數/5 000×100%。細胞密度調整為1×105/mL。取細胞懸液200 μL加入小室中，下室中加入600 μL 含20%胎牛血清RPMI1640培養液，48小時后拍照，在光學顯微鏡下觀察，并隨機選取5個視野進行計數并進行統計學分析。

1.3統計學處理

用SPSS19.0統計軟件進行數據分析。計量資料用（x±s）表示，樣本數據服從正態分布，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P〈0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1shRNA慢病毒轉染人骨肉瘤細胞MG-63的轉染效率測定

慢病毒轉染人骨肉瘤細胞MG-63 72小時后，在熒光顯微鏡下觀察可見細胞中CRYAB綠色熒光蛋白表達。熒光顯微鏡下隨機選取視野計算出人骨肉瘤細胞MG-63細胞的病毒轉染效率，然后對同一視野進行白光和熒光拍照（見圖1）。20 MOI值的細胞轉染率＞80%，細胞生長狀態良好，提示慢病毒轉染成功并穩定表達，可進行后續實驗。

圖1　MG-63細胞中sh-CRYAB病毒轉染組白光和綠色熒光蛋白的表達（10×）

2.2Real-time PCR檢測慢病毒轉染后細胞中的CRYAB

病毒轉染MG-63細胞后，于轉染后72小時分別提取兩組細胞的mRNA，通過PCR驗證其轉染效果。結果顯示，shRNACRYAB病毒轉染組mRNA水平比陰性對照組下降80%（P〈0.01），見圖2。

圖2　mRNA水平上MG-63細胞中CRYAB的表達

2.3Western Blotting檢測沉默后 MG-63細胞蛋白中CRYAB的表達

在病毒轉染MG-63細胞后72小時，提取細胞蛋白進行Western Blotting檢測CRYAB的表達。結果顯示，shRNACRYAB病毒轉染組CRYAB的蛋白表達相比于陰性對照組顯著降低、蛋白條帶明顯減弱（P〈0.01），見圖3。

圖3　Western Blotting檢測轉染后MG-63細胞蛋白中CRYAB的表達

2.4CCK-8法和細胞克隆實驗檢測細胞的增殖能力

shRNA-CRYAB病毒轉染組較陰性對照組細胞吸光度值明顯減小，結果表示MG-63細胞的增殖能力在沉默CRYAB基因后明顯降低（P〈0.05），在第三、四、五和第六天表現更明顯，表明shRNA-CRYAB病毒轉染組細胞較陰性對照組細胞生長速度減慢，并且在檢測的第六天這種生長抑制更為顯著（P〈0.01），進一步說明shRNA干擾慢病毒抑制CRYAB在人骨肉瘤細胞MG-63表達后，能夠持續有效抑制細胞增殖（見圖4）。

圖4　CCK-8法檢測CRYAB基因沉默后MG-63細胞增殖

在shRNA-CRYAB病毒轉染組和陰性對照組接種6孔板10天后，計數細胞數多于50個的克隆。結果表明，shRNACRYAB病毒轉染組比陰性對照組的克隆形成能力明顯降低，根據公式計算克隆形成率分別為5.2%和26.0%，兩者比較，差異具有統計學意義（P〈0.05），見圖5。

圖5　克隆形成實驗檢測CRYAB基因沉默后MG-63細胞增殖

2.5Transwell細胞遷移實驗和細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移能力

在細胞遷移實驗中，shRNA-CRYAB病毒轉染組平均穿膜細胞數量為（98.5±3.0）個；陰性對照組平均穿膜數量為（390.0± 3.9）個。Transwell遷移實驗中，shRNA-CRYAB病毒轉染組和陰性對照組相比其細胞穿膜數量減少（P〈0.01）。結果表明，轉染shRNA-CRYAB后，MG-63細胞的遷移能力明顯下降，見圖6。

圖6　Transwell檢測CRYAB基因沉默后MG-63細胞遷移能力（10×）

3　討論

熱休克蛋白是一類在生物進化中高度保守、廣泛存在于原核及真核生物中的蛋白質。近年熱休克蛋白在免疫中的作用已成為當前研究的熱點之一［11］。最近研究資料［12］顯示，CRYAB與多種腫瘤發生與發展相關，如神經膠質瘤、腎臟腫瘤、口腔鱗癌、食管癌、肝癌、乳腺基底細胞樣癌以及乳腺原位導管癌中表達高于其在正常對照組織中的表達，患者CRYAB高表達與預后呈負相關，且其可作為判斷多種腫瘤預后的獨立因素。在食管癌中的研究顯示，CRYAB可以阻斷細胞凋亡信號傳遞，即影響細胞凋亡過程，從而有利于腫瘤形成［13］。

3.1熱休克蛋白CRYAB在其他腫瘤中的表達

CRYAB作為熱休克蛋白的一種，與惡性腫瘤密切相關，研究發現其可參與控制腫瘤細胞的增殖與凋亡，在腫瘤發生中充當分子伴侶，使細胞維持增生狀態免于凋亡［14-16］。CRYAB是小熱休克蛋白家族中非常重要的一員。研究證實，CRYAB在多種人類腫瘤組織中表達水平明顯高于癌旁及正常組織，且其表達程度與腫瘤患者的預后密切相關。Aoyama等在神經膠質腫瘤與正常腦組織標本的對比研究中發現，CRYAB在腫瘤細胞中的表達明顯高于正常組織［17］。

RNA干擾技術（RNA interference，RNAi）能抑制腫瘤細胞中某些癌基因的表達，同時也能抑制腫瘤的增殖和轉移，從而達到預防和治療腫瘤的目的，具有高效性、特異性和低毒性的特點。因此運用RNAi技術，人工合成短發夾環RNA（shRNA），通過重組慢病毒載體介導的基因轉導將外源基因有效地整合到宿主染色體上，特異性、穩定地沉默CRYAB基因在骨肉瘤細胞MG-63中的表達。

3.2熱休克蛋白CRYAB對人骨肉瘤細胞MG-63增殖、遷移能力的影響

有研究發現［16］，在肝癌細胞系HCCLM3細胞CRYAB表達下調后，Transwell細胞侵襲實驗發現，細胞侵襲能力明顯下降；HCCLM3-vshCRYAB組和HCCLM3-Mock區別明顯。Hep3BCRYAB穿膜能力明顯高于Hep3B細胞，這與本組實驗結果一致，本研究發現，shRNA慢病毒載體轉染后，人骨肉瘤細胞MG-63中CRYAB mRNA和蛋白表達量明顯減少，驗證了慢病毒載體良好的干擾效果。通過后續實驗結果表明，在細胞增殖實驗中，shRNA-CRYAB病毒轉染組的細胞增殖能力較陰性對照組明顯下降；在細胞遷移實驗中，shRNA-CRYAB病毒轉染組的細胞遷移能力顯著下降。由此可見，CRYAB慢病毒干擾載體轉染后的人骨肉瘤MG-63細胞，其增殖、遷移能力明顯下降，表明CRYAB基因在骨肉瘤的發生發展和侵襲轉移中起著重要作用。這可為進一步探究CRYAB基因與腫瘤浸潤轉移的分子機制提供依據，可作為骨肉瘤治療的一個新的重要靶點，為骨肉瘤的治療提供新的思路和方向。

3.3前景與展望

當前，雖然CRYAB作為一種重要的促癌基因，但是關于CRYAB詳細的分子促癌作用機制及其相關信號通路的研究尚不深入，如CRYAB在骨肉瘤發生及發展中的具體功能？CRYAB可能通過與哪些信號通路的共同作用促進骨肉瘤的發生與發展？其詳盡的機制還需要進一步深入研究。

［1］Wafa H，Grimer R J.Surgical options and outcomes in bone sarcoma［J］. Expert Rev Anticancer Ther，2006，6（2）：239-248.

［2］Ottavian G，Jaffe N.The epidemiology of osteosarcoma［J］.Cancer Treatment and Research，2009（152）：3-13.

［3］Ham S J，Schraffordt Koops H，Van der Graaf W T，et al.Historical，currentand future aspects of osteosarcoma treatment［J］.Eur J Surg Oncol，1998，24（6）：584-600.

［4］Kager L，Zoubek A，Postchger U，et al.Primary meta-static osteosarcoma：presentation and outcome of patients treatedon neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols［J］.J Clin Oncol，2003，21（10）：2011-2018.

［5］Dudeja V，Vickers S M，Saluja A K.The role of heat shock proteins in gastrointestinal diseases［J］.Gut，2009，58（7）：1000-1009.

［6］Arrigo A P.SHsp as novel regulators of programmed cell death and tumorigenicity［J］.Pathol Biol（Paris），2000，48（3）：280-288.

［7］Qin H，Ni Y，Tong J，et al.Elevated expression of CRYAB predicts unfavorable prognosis in non-small cell lung cancer［J］.Med Oncol，2014，31 （8）：142.

［8］Van de Schootbrugge C，Schults E M，Bussink J，et al.Effect of hypoxia on the expression of αB-crystallin in head and neck squamous cell carcinoma［J］.BMC Cancer，2014（14）：252.

［9］Chen Z J，Ruan Q，Han S，et al.Discovery of structure-based small molecular inhibitor of alpha B-crystallin against basal-like/triple-negative breast cancer development in vitro and in vivo［J］.Breast Cancer Res Treat，2014，145（1）：45-59.

［10］Campos-Mora M，Morales R A，Gajardo T，et al.Neuropilin-1 in transplantation tolerance［J］.Front Immuno，2013（4）：405.

［11］王小平，胥冰，馬曉軍，等.熱休克蛋白與腫瘤免疫［J］.現代腫瘤醫學，2015，23（1）：131-134.

［12］Gruvberger-Saal S K，Parsons R.Is the small heat shock protein alphaB-crystallin an oncogene［J］.J Clin Invest，2006，116（1）：30-32.

［13］周娟.人食管癌細胞熱休克蛋白70肽復合物的提取及其抗瘤活性的研究［D］.鄭州：鄭州大學，2006.

［14］Filomeni G，Aquilano K，Rotilio G，et al.Antiapoptotic response to induced GSH depletion：involvement of heat shock proteins and NF-kappaB activation［J］.Antioxid Redox Signal，2005，7（34）：446-455.

［15］Lamoureux F，Thomas C，Yin M J，et al.Suppression of heat shock protein 27 using OGX-427 induces endoplasmic reticulum stress and potentiates heat shock protein 90 inhibitors to delay castrate-resistant prostate cancer［J］.Eur Urol，2014，66（1）：145-155.

［16］Huang X Y，Ke A W，Shi G M，et al.αB-crystallin complexes with 14-3-3ζ to induce epithelial-mesenchymal transition and resistance to sorafenib in hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013（12）：26255.

［17］Gurgis F M，Ziaziaris W，Munoz L.Mitogen-activated protein kinaseactivated protein kinase 2 in neuroinflammation，heat shock protein 27 phosphorylation，and cell cycle：role and targeting［J］.Mol Pharmacol，2014，85（2）：345-356.

（*通訊作者：趙龍）■

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1671-1246（2016）16-0143-04