正常生理和1型糖尿病病理下的慢性生長激素刺激對肝臟胰島素信號的影響分析

王青貴陽護理職業學院，貴州貴陽550008

正常生理和1型糖尿病病理下的慢性生長激素刺激對肝臟胰島素信號的影響分析

王青
貴陽護理職業學院，貴州貴陽550008

目的探討慢性生長激素在1型糖尿病病理與正常生理下對肝臟胰島素信號的影響。方法對健康小鼠注射慢性生長激素，對1型糖尿病小鼠以鏈脲佐菌素誘導，并進行Akt和PTEN的檢測。結果對健康小鼠注射慢性生長激素后肝內胰島素信號通路分子Akt磷酸化能夠被抑制，同時會顯著增加該信號通途的負調控分子PTEN表達（P＜0.05）；與此同時慢性生長激素刺激T1DM C57BL/6小鼠肝內Akt磷酸化也能被抑制（P＜0.05），但是在PTEN表達水平上的改變不顯著（P＞0.05）；除此之外對胰島素信號的p85調節亞基進行檢測，在慢性生長激素刺激下兩種小鼠的表達水平無變化（P＞0.05）。結論將慢性生長激素長期使用可以對肝臟胰島素信號進行抑制，機制主要與PTEN表達升高有關，然而機制在病理狀態下不同。

正常生理；1型糖尿病；慢性生長激素；肝臟胰島素信號

生長激素是一種肽類激素，由腺垂體嗜酸性細胞分泌，主要受晝夜節律、性別、年齡、生長激素釋放激素的調節和影響，它的功能主要為代謝調節和促進生長發育，作用的臟器主要包括了腎臟、肺、肝臟、肌肉和心臟等，而對肝臟的影響作用尤為顯著。目前慢性生長激素的應用具有廣泛性，但是在長期使用的情況下就會將各種副作用引發，如胰島素抵抗或者是腫瘤等，目前對于相關機制還在進一步研究中，現報道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇30只Balb/c小鼠和50只C57BL/6小鼠，所有小鼠均為雄性，且周齡在6～8周，均符合SPF級飼養標準。

1.2方法

1.2.1給藥與分組以30只Balb/c小鼠為調查對象，將其隨機分為兩組，每組15只，一組注射無菌生理鹽水（對照組1組），另一組注射慢性生長激素（觀察組），且兩組注射的體積相等，均是經腹腔注入，注入時間為下午3：00～5：00，持續性注射3周。

1.2.2構建T1DM小鼠模型隨機將50只C57BL/6小鼠分為STZ組和對照2組，各組分別為30只和20只，對照2組注射120 g/kg的檸檬酸鈉，而STZ組則注入STZ，同樣是經腹腔，且注射3 d，之后進行小鼠體質量和空腹血糖的測定，當空腹血糖在11.1 mmol/L及以上的情況下則視為T1DM造模成功。之后再對造模成功的T1DM小鼠進行分組，即糖尿病GH組和模型組，每組15只，前者每天下午3：00～5：00注射1μg/g rhGH，而后者則將無菌生理鹽水注射，且體積相等，持續性注射3周。

1.2.3采集與處理標本在采用慢性生長激素刺激3周后，于前1 d晚上11點對小鼠禁食，但可以飲水，并于當天凌晨5：30將其處死，首先對小鼠空腹體質量進行測定，并于處死前10 min將2 IU/kg生理鹽水或等量重組人胰島素經腹腔注射，同時將戊巴比妥鈉于處死前注射，在完全麻醉的情況下對小鼠進行取肝和處死。

1.2.4Wes t er n b l ot t ing蛋白印跡分析對各組小鼠的肝臟組織進行提取，約為綠豆大小，之后進行研磨，將蛋白提取做Western blotting檢測p85、PTEN表達水平與Akt磷酸化水平。將肝組織蛋白提取，以8%聚丙烯酞胺SDS-PAGE恒壓電泳，100 mA恒定電流進行150 m in轉膜；之后在進行半小時的5%脫脂奶室溫封閉，在雜交袋中置入PVDF膜，并在4℃的環境中孵育4～6 h或者是溫室條件下孵育一抗1～2 h，將二抗以1∶3 000～1∶5 000的比例進行稀釋，室溫下孵育二抗與PVDF膜30 min；清洗15 min PBS-T，持續3～6次，直至顯影、發光。掃描膠片，對各組目標條帶的灰度值以目的條帶的分子量為依據進行Image J軟件分析，內參為GAPDH或β-actin，參照為總Akt，對目的蛋白的相對表達量以相應蛋白條帶與Akt、GAPDH、β-actin的比值進行計算。

1.3統計方法

對調查的數據資料借助統計學軟件SPSS 16.0進行處理分析，以標準差（）表示數據，以t檢驗兩組間比較，當P＜0.05的情況下則說明差異具有統計學意義。

2　結果

2.1T1DM小鼠與健康小鼠在注射慢性生長激素后體質量的變化

在對觀察組和對照1組小鼠采用慢性生長激素刺激3周后，兩組小鼠的體質量均增加明顯，但是相比較之下，觀察組小鼠的體質量增長更優于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與此同時糖尿病GH組和模型組小鼠采用慢性生長激素刺激3周后，兩組小鼠的體質量均下降明顯，然而相比之下，在體質量減輕幅度上模型組大于糖尿病GH組，差異有統計學意義（P＜0.05），具體如下表所示。

表1　觀察組和對照1組體質量增加比較（）

表1　觀察組和對照1組體質量增加比較（）

P分組體質量增加幅度對照1組觀察組t檢驗t 3.854±0.662 6.822±1.302 -4.236 0.001

表2　糖尿病GH組和模型組體質量降低比較（）

表2　糖尿病GH組和模型組體質量降低比較（）

分組體質量增加幅度糖尿病GH組模型組t檢驗t P 1.632±1.101 3.821±1.832 3.265 0.005

2.2調節亞基p85表達水平變化

對照1組與觀察組在經慢性生長激素刺激之后，觀察組的p85表達水平改變不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）；同時模型組與觀察組相比，在慢性生長激素刺激之后T1DM小鼠的p85表達水平改變同樣不明顯，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3胰島素信號p-Akt

對標志蛋白Akt的活性水平進行檢測得出健康小鼠比對照1組在采用慢性生長激素刺激之后Akt磷酸化水平下降顯著，差異具有統計學意義（P＜0.05）；并且模型組于觀察組小鼠在采用慢性生長激素刺激之后Akt磷酸化水平同樣下降顯著，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.4負調控分子PTEN的作用

觀察組與對照1組在采用慢性生長激素刺激之后，前者的PTEN表達水平增加明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）；但是采用慢性生長激素刺激T1DM小鼠之后，與模型組相比在PTEN表達水平上的改變不顯著（P＞0.05）。

3　結論

經以上的調查顯示，將慢性生長激素長期使用1型糖尿病小鼠和健康小鼠均會產生胰島素抵抗。在細胞水平上，無論內源胰島素刺激是否存在，胰島素模擬內源性胰島素分泌30 m in，胰島素信號均能夠被生長激素抑制，由此可見，內源性胰島素與生長激素誘導胰島素抵抗無關，并且在機制上有所差異。在機體的衰老、代謝和發育中生長激素具有重要的作用，相關報道指出，高血糖和胰島素抵抗會出現于荷載分泌GH腫瘤和GH轉基因的大鼠中，同時高胰島素血癥會發生于肢端肥大癥的病人。與此同時也有相關研究發現，正常兒童與接受長期慢性生長激素的患兒相比，發生2型糖尿病的幾率要明顯低處許多，約為1/6。在以上的調查研究中，我們對健康小鼠進行長達三周的慢性生長激素刺激，其結果顯示小鼠的體質量得到了顯著提升，與此同時，小鼠在長期慢性生長激素刺激作用下有高胰島素血癥發生，并且分析結果顯示，抑制了小鼠肝內AKt的磷酸化，由此可見，小鼠肝內胰島素抵抗會因長期使用慢性生長激素產生。生長激素和胰島素在機體均具有代謝和生長的雙重調節作用，細胞表面的胰島素受體與胰島素結合，激活受體磷酸化，經Grb2/SOS激活MAPK/ERK通路或者是經胰島素激活PI3K/Akt通路兩條信號路徑將調節細胞凋亡、增值和代謝的作用發揮。同時也有相關調查指出，PI3K/Akt通路能夠被胰島素和生長激素共享，這可能是PI3K/Akt是胰島素作用發揮和生長激素促進生長的交匯點。小鼠在STZ誘導下生成T1DM后會降低體質量，原因可能為STZ誘導損傷的情況下小鼠不適應造成，即便如此，采用慢性生長激素刺激后依舊能夠正向調節體質量，同時這也是對照組與T1DM小鼠在慢性生長激素刺激后后者體質量波動幅度小的原因。研究指出，Insulin/PI3K/Akt的激活被PTEN抑制后，胰島素β細胞的體積可以增加，可見該活性信號通路的調節可能有PTEN參與，但是尚不明確具體機制。以慢性生長激素刺激T1DM小鼠和，PTEN的調節機制尚未明顯表現，由此可見，PI3K/Akt信號通路的調節具有多態性。在糖尿病生成動物模型中STZ被廣泛地應用，以誘導胰島素β細胞死亡減少小鼠體內胰島素分泌，使得糖尿病、高血糖發生。以慢性生長激素刺激健康小鼠之后，p85沒有變化，但是PTEN的表達顯著升高，由此可見，只要一個表現出抑制，就能夠抑制整個信號通路。

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R587.1

A

1672-4062（2016）07（a）-0123-02

10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.13.123

王青（1982.5-），女，貴州畢節人，本科，講師，研究方向:醫學基礎。

2016-04-11）