mTOR信號通路調控1,25二羥維生素D3抑制喉癌細胞Hep-2細胞增殖的研究*

桂明才，李　兵，戚思國，周長華

(1.四川省達州市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科 635000；2.重慶醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，重慶400016)

?

·論著·

mTOR信號通路調控1,25二羥維生素D3抑制喉癌細胞Hep-2細胞增殖的研究*

桂明才1，李兵2△，戚思國1，周長華1

(1.四川省達州市中心醫院耳鼻咽喉頭頸外科 635000；2.重慶醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，重慶400016)

目的研究1,25二羥維生素D3抑制喉癌細胞Hep-2細胞增殖作用以及對雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路的影響。方法用不同劑量1,25二羥維生素D3(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)分別處理Hep-2細胞24、48、72 h，四甲基偶氮唑藍法(MTT)檢測Hep-2細胞的增殖情況，并計算抑制率；采用流式細胞儀分析1,25二羥維生素D3對Hep-2細胞周期分布的影響，Western blot檢測1,25二羥維生素D3對mTOR信號通路的影響。結果不同濃度1,25二羥維生素D3均可抑制Hep-2細胞增殖，改變細胞周期分布,使G0/G1期Hep-2細胞比例增高。1,25二羥維生素D3干預后Hep-2細胞TSC1、TSC2蛋白表達較對照組增高(P<0.01)，Rheb蛋白表達明顯降低；mTOR蛋白及其磷酸化水平表達與對照組比較均降低(P<0.01)，mTOR蛋白磷酸化表達降低尤為明顯(P<0.01)；4EBP-1蛋白表達較對照組增高(P<0.01)。結論1,25二羥維生素D3改變喉癌細胞Hep-2細胞周期分布，影響mTOR信號通路蛋白表達，從而抑制細胞增殖。

1,25二羥維生素D3；Hep-2細胞；增殖抑制；雷帕霉素靶蛋白

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種重要的調節基因，通過調節細胞周期、蛋白質合成、細胞能量代謝等途徑發揮生理功能，在細胞增殖、生長、分化過程中起核心調控作用。mTOR還參與感受營養信號、調節細胞生長與增殖[1]。維生素D傳統上被認為是一種脂溶性維生素。1,25二羥維生素D3[1,25(OH)2D3]是維生素D的活性形式。1,25(OH)2D3除了經典的調節腎、腸道的鈣、磷代謝外，還具有調節細胞生長和分化的作用[2]，其中對腫瘤細胞的影響近年來倍受關注。本研究旨在觀察1,25(OH)2D3抑制喉癌細胞Hep-2細胞增殖及其對mTOR信號通路的影響，初步探討1,25(OH)2D3對Hep-2細胞增殖的影響及相關機制。

1　材料和方法

1.1材料人喉上皮樣癌Hep-2 細胞株購自南京凱基生物有限公司；TSC1、TSC2、Rheb、mTOR、p-mTOR和β-actin 單克隆抗體購自Santa Cruz公司；辣根過氧化酶標記物山羊抗小鼠IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術有限公司；1,25(OH)2D3及雷帕霉素購自美國Sigma公司，溶于RPMI1640 培養基制成10 mmol/L的母液，過濾除菌后-20 ℃備用。

1.2方法

1.2.1細胞培養及實驗分組人喉癌Hep-2 細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1 640 培養液中，置入37 ℃、體積分數為5%的二氧化碳及飽和濕度培養箱中進行培養，取對數生長期細胞用于實驗。按實驗需要進行分組：對照組，干預組1[1,25(OH)2D3濃度為10-8mol/L]，干預組2[1,25(OH)2D3濃度為10-7mol/L]，干預組3[1,25(OH)2D3濃度為10-6mol/L]，雷帕霉素組(雷帕霉素濃度20 nmol/L)。

1.2.2細胞增殖抑制實驗(MTT法)細胞分別培養24、48、72 h后各取出1塊培養板，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，孵育4 h，棄上清液加入DMSO終止反應，振蕩10 min，于波長570 nm處測吸光度(OD)值。細胞抑制率(%)=(OD陰性對照-OD實驗)/OD陰性對照×100%。

1.2.3細胞周期檢測將培養48 h的細胞用PBS沖洗后快速注入裝有預冷750 mL/L乙醇1 mL的EP管中，混勻，4 ℃過夜。將等體積的細胞懸液和碘化丙啶(PI)染液混合，4 ℃放置30 min，以激發波長488 nm測定，死亡細胞呈紅色熒光，以健康人淋巴細胞調節參數，數據用Modifit1.0軟件分析。計算細胞增殖指數(PI)=(S+G2/M)/(S+G2/M+G0/G1)×100%。

1.2.4Western blotting檢測各實驗組培養48 h后提取細胞總蛋白。凝膠電泳，轉膜。封閉后加稀釋一抗抗體(靶蛋白抗體)4 ℃過夜。加入稀釋的二抗室溫孵育2 h，顯色，曝光、顯影和定影。吸光度掃描分析后計算各組細胞靶蛋白相對表達量。

2　結　果

2.11,25(OH)2D3對Hep-2細胞增殖的抑制作用1,25(OH)2D3在10-6～10-8mol/L濃度對Hep-2細胞增殖均有抑制作用，但程度不同，各劑量組對癌細胞的抑制率見圖1。3個劑量組對喉癌細胞的抑制率隨作用時間的延長以及藥物濃度的上升而增加，且呈時間-劑量效應關系。各實驗組與對照組之間差異有統計學意義(P<0.01)。

注：A為對照組；B為1,25(OH)2D3濃度10-8mmol/L；C為1,25(OH)2D3濃度10-7mmol/L；D為1,25(OH)2D3濃度10-6mmol/L。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖11,25(OH)2D3對Hep-2細胞增殖能力的影響

2.21,25(OH)2D3對喉癌細胞周期影響1,25(OH)2D3對細胞株Hep-2干預后，細胞周期分布及細胞增殖指數見表1和圖2。不同濃度1,25(OH)2D3作用48 h后，G0/G1期細胞較對照組明顯增多(P<0.05)，細胞增殖指數明顯減少(P<0.05)。

表1　1,25(OH)2D3作用48 h后Hep-2細胞周期分布

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：A為對照組；B為1,25(OH)2D3濃度10-8mmol/L；C為1,25(OH)2D3濃度10-7mmol/L；D為1,25(OH)2D3濃度10-6mmol/L。

圖21,25(OH)2D3對Hep-2細胞周期的影響

注：A為對照組；B為1,25(OH)2D3濃度10-8mmol/L；C為1,25(OH)2D3濃度10-7mmol/L；D為1,25(OH)2D3濃度10-6mmol/L；E為雷帕霉素干預組。

圖31,25(OH)2D3對Hep-2細胞mTOR信號通路蛋白表達的影響

2.3Western blotting檢測蛋白表達結果如圖3所示，Hep-2細胞1,25(OH)2D3干預組與對照組比較TSC1、TSC2蛋白表達均增高，TSC2蛋白表達增高尤為明顯(P<0.01)，隨1,25(OH)2D3濃度增加，蛋白表達增高尤為明顯，而雷帕霉素組表達改變不明顯(P>0.05)；Rheb蛋白在1,25(OH)2D3干預后表達降低，不同濃度表達差異有統計學意義(P<0.01)，雷帕霉素組表達也降低(P<0.05)；mTOR蛋白及其磷酸化水平在1,25(OH)2D3干預后表達降低，mTOR蛋白磷酸化表達降低尤為明顯(P<0.01)，雷帕霉素組mTOR蛋白改變不明顯(P<0.05)，而mTOR蛋白磷酸化表達降低明顯(P<0.01)；4EBP-1在1,25(OH)2D3干預后表達增高，不同濃度表達差異有統計學意義(P<0.01)，雷帕霉素組表達也增高(P<0.05)。

3　討　論

喉鱗狀細胞癌(LSCC)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，占人類所有惡性腫瘤的2%[3-4]。雖然近幾十年來傳統的喉癌治療方式已有很大提高，但喉癌患者總體生存率一直沒有提高，因此尋求高效、低毒的抗腫瘤藥物成為研究的熱點。近年來研究發現，1,25(OH)2D3對乳腺癌、卵巢癌、白血病、淋巴瘤等腫瘤細胞均有抑制作用[5]。本實驗發現1,25(OH)2D3可以抑制喉癌細胞株Hep-2細胞生長，該作用呈時間和劑量依賴關系，在作用48 h后抑制作用最為顯著。細胞周期是細胞生命活動的基本過程，細胞增殖最終發生在細胞周期水平。以調節細胞周期為策略是抗腫瘤治療的新途徑，細胞周期阻滯包括G0/G1期阻滯和G2/M期阻滯。本研究結果顯示，隨著1,25(OH)2D3濃度的增加，Hep-2細胞G0/G1期所占比例逐漸上升，而G2/M期細胞和S期細胞所占比例逐漸下降。表明1,25(OH)2D3能使Hep-2細胞周期阻滯于G0/G1期。

mTOR 是腫瘤發生過程中的一個關鍵因子，主要是通過PI-3K/AKT/mTOR及AKT/TSC1-TSC2/mTOR 信號通路對細胞的生長和增殖產生調控作用，信號通路的過度激活和調控異常與腫瘤的發生密切相關[6]。1994年由PaulWorley發現Rheb，最初研究表明Rheb在誘導癲癇后的神經元表達增高，推測Rheb對外界應激反應中具有突觸可塑性[7]。更有研究證明Rheb是TSC基因下游作用因子，具有內源性GTP酶活性，作為TSC2的靶分子，與有GTP酶激活蛋白(GAP)的TSC2直接作用[8]，而且在TSC患者中mTOR通路異常激活，而TSC蛋白和Rheb蛋白分別為mTOR通路的負性和正性調控因子[9]。

維生素D參與鈣、磷代謝和維持骨穩態的調節。而較多研究發現其新的功能，研究表明，維生素D具有廣泛的生物學活性，不僅在機體骨骼發育中發揮重要作用，而且具有調節細胞生長、分化、增殖和凋亡的重要作用[10-11]。在抗凋亡機制的研究中發現，1,25(OH)2D3能夠在轉錄水平誘導DDIT4表達，后者可通過調控mTOR信號通路中TSC1/2復合物及Rheb的活性來抑制mTOR激活，而激活后的mTOR通過調控4EBP-1表達，從而抑制腫瘤細胞增殖。

本實驗發現1,25(OH)2D3干預Hep-2細胞TSC1、TSC2蛋白表達與對照組比較均增高。而干預組Rheb蛋白表達降低、mTOR蛋白及其磷酸化水平降低、4EBP-1蛋白表達增高。同時設立mTOR抑制劑雷帕霉素作為對照，檢測mTOR下游蛋白表達情況，發現mTOR蛋白及其磷酸化水平、4EBP-1蛋白表達水平與1,25(OH)2D3干預組類似。由此可見，1,25(OH)2D3抑制Hep-2細胞中Rheb表達、mTOR蛋白及其磷酸化水平，增加4EBP-1蛋白水平表達，抑制mTOR信號通路，影響TSC1/2/Rheb/mTOR/4EBP-1信號通路蛋白表達，從而抑制Hep-2細胞增殖。

本實驗不足之處在于盡管參照了較多研究的文獻進行1,25(OH)2D3濃度選擇，但是就本部分實驗的完整性而言需要進一步選擇不同1,25(OH)2D3的作用濃度進行研究；檢測了mTOR總的蛋白，而沒有進行細胞核蛋白和膜蛋白的分別檢測，這也是本課題組后期擬進一步檢測的內容；本實驗僅反映體外實驗，尚無體內實驗研究，需要進一步進行動物實驗研究。本課題組將在后期實驗中完善這一部分。

[1]Dann SG,Selvaraj A,Thomas G.MTOR complex1-S6K1 signaling:at the crossroads of obesity,diabetes and cancer[J].Trends Mol Med,2007,13(6):252-259.

[2]Gocek E,Studzinski GP.Vitamin D and differentiation in cancer[J].Crit Rev Clin Lab Sci,2009,46(4):190-209.

[3]Jiang T,Zhu Y,Luo C,et al.Matrine inhibits the activity of translation factor eIF4E through dephosphorylation of 4E-BP1 in gastric MKN45 cells[J].Planta Med,2007,73(11):1176-1181.

[4]Calder KB,Khalil FK,Schlauder S,et al.Immunohistochemical expression of survivin in cutaneous sebaceous lesions[J].Am J Dermatopathol,2008,30(6):545-548.

[5]Ling X,Cheng Q,Black JD,et al.Forced expression of survivin-2B abrogates mitotic cells and induces mitochondria-dependent apoptosis by blockade of tubulin polymerization and modulation of Bcl-2,Bax,and survivin[J].J Biol Chem,2007,282(37):27204-27214.

[6]Yamagata K,Sanders LK,Kaufmann WE,et al.Rheb,a growth factor- and synaptic activity-regulated gene,encodes a novel ras-related protein[J].J Biol Chem,1994,269(23):16333-16339.

[7]Zhang Y,Gao X,Saucedo LJ,et al.Rheb is a direct target of the tuberous sclerosis tumour suppressor proteins[J].Nat Cell Biol,2003,5(6):578-581.

[8]Tee AR,Manning BD,Roux PP,et al.Tuberous sclerosis complex gene products,Tuberin and Hamartin,control mTOR signaling by acting as a GTPase-activating protein complex toward Rheb[J].Curr Biol,2003,13(15):1259-1268.

[9]Rogers CS,Yedjou CG,Sutton DJ,et al.Vitamin D3potentiates the antitumorigenic effects of Arsenic trioxide in human leukemia (HL-60) cells[J].Exp Hematol Oncol,2014,3(1):9-12.

[10]彭昌能，谷苗，李國慶．1,25(OH)2D3用于抗腫瘤的研究進展[J]．中國現代醫藥雜志，2010，12(10)：127-130．

[11]Lisse TS,Hewison M.Vitamin D:a new player in the world of mTOR signaling[J].Cell Cycle,2011,10(12):1888-1889.

mTOR signaling pathway for regulating inhibition of 1,25 dihydroxyvitamin D3on Hep-2 cells proliferation in laryngeal carcinoma*

GUI Mingcai1,LI Bing2△,QI Siguo1,ZHOU Changhua1

(1DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,DazhouMunicipalCentralHospital,Dazhou,Sichuan635000,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China)

ObjectiveTo explore the inhibition role of 1,25 dihydroxyvitamin D3on laryngeal cancer Hep-2 cell proliferation and its influence on mTOR signal pathway.MethodsHep-2 cells were treated with different concentrations of 1,25 dihydroxyvitamin D3(10-8,10-7,10-6mol/L) for 24,48,72 h respectively.The proliferation situation of Hep-2 cells was detected by the MTT method and the inhibition rate was calculated.The effect of 1,25 dihydroxyvitamin D3on Hep-2 cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry.The influence of 1,25 dihydroxyvitamin D3on mTOR signaling pathway was detected by Western blot.ResultsDifferent concentrations of 1,25 dihydroxyvitamin D3could inhibit the proliferation of Hep-2 cells,changed the cell cycle distribution and increased the proportion of Hep-2 cells in G0/G1phase.The expressions of TSC1 and TSC2 protein after 1,25 dihydroxyvitamin D3intervention were increased compared with the control group(P<0.01),while the Rheb protein expression was significantly decreased(P<0.01):mTOR protein and phosphorylation level were significantly decreased compared with the control group (P<0.01),the decrease of mTOR protein phosphorylation was especially obvious(P<0.01);4EBP-1 protein expression was increased compared with the control group(P<0.01).Conclusion1,25-dihydroxyvitamin D3alters the Hep-2 cell cycle distribution,affects the protein expression of mTOR signaling pathway,thus inhibits the cell proliferation.

1,25 dihydroxyvitamin D3;Hep-2 cell;proliferation;mTOR

2016-02-02修回日期：2016-05-16)

重慶市自然科學基金資助項目(cstc2013jcyjA10059)。

桂明才，男，主治醫師，主要從事耳鼻喉頭頸外科方面的研究?！?/p>

，E-mail:634339717@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.006

A

1673-4130(2016)15-2065-03