乙型肝炎基因分型的研究進展*

張桂前，高建梅，孫　鹥 綜述，段　勇 審校

(1.云南省第一人民醫院檢驗科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科，昆明 650032)

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·綜述·

乙型肝炎基因分型的研究進展*

張桂前1，高建梅1，孫鹥1綜述，段勇2△審校

(1.云南省第一人民醫院檢驗科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院檢驗科，昆明 650032)

乙型肝炎；基因分型；乙型肝炎病毒

乙型肝炎(簡稱乙肝)病毒(HBV)感染是嚴重的公共衛生問題，全球約20億人感染過HBV，其中3.5億人成為了慢性HBV感染者[1]，約15%～40%的HBV感染者最終發展成為了肝硬化或肝癌[2]，全球每年約100萬人死于乙肝所致的肝衰竭、肝硬化和原發性肝癌。HBV的感染呈地方性流行，超過75%的HBV感染者分布于西太平洋地區和東南亞國家，乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶率在西歐、北美僅0.1%～0.9%，而在亞洲國家高達5%～10%。中國累計有7億人曾感染過HBV，有1.2億人成為了病毒攜帶者，每年約60萬人死于HBV感染引起的相關疾病。HBV感染的臨床轉歸不僅與患者年齡和免疫力有關，而且也與病毒株的基因型密切相關，所以研究HBV基因型有重要的臨床意義。通過HBV基因分型，可以了解基因型的地區分布特點以及在人群中的變異和進化趨勢。

1　概　述

HBV屬于嗜肝病毒的一種，核酸為部分共價閉合環狀雙鏈DNA，其雙鏈長度不同，與病毒mRNA互補全長的一條鏈為負鏈，而另一條為正鏈，長度不定，約為負鏈的50%～100%。病毒基因組長度在3 182～3 221個核苷酸， 含4個部分重疊的開放讀碼框(ORF)，即前S/S區、前C/C區、P區和X區。S-ORF分為前S1區、前S2區和S區，各有其起始密碼子ATG,編碼大、中、小3種包膜蛋白；C-ORF分為前C區和C基因區，各自有起始密碼ATG，編碼HBeAg及HBcAg，這一區段最保守，是免疫攻擊的靶表位所在；P-ORF 是最長的閱讀框，與C-ORF、S-ORF、X-ORF重疊，編碼病毒聚合酶；X-ORF編碼HBx蛋白，HBx是一種多功能的反式調節因子，可反式激活增強子和啟動子的轉錄功能。在病毒基因組上，不僅有編碼蛋白的結構基因，還有調節元件，包括4個啟動子、2個增強子、糖皮質激素應答元件、負調節元件、CCAAT元件等。由于HBV復制過程中需經過RNA中間體的逆轉錄，而該逆轉錄酶又缺乏校正功能，所以HBV具有高變異性，其突變率約為(1.4～3.2)×10-5位點/年。因此，在生活環境和免疫壓力下，HBV不斷變異從而形成了不同的準種、基因型和基因亞型。

2　乙型肝炎的基因分型和流行分布

由于全基因序列分析比較復雜，HBV舊的分型原則可根據部分基因特別是S基因序列進行分型，因為S基因的序列相對其他序列而言異質性最小，也更加保守，從而根據S區基因序列的異質性≥4%的標準代替全基因序列分型。但新近提出的分型原則認為必須要以全基因組序列作為分型依據，并糾正了一些錯誤分型。例如，Khedive等[3]對伊朗的HBV攜帶者681 bp的分離株進行分析，報告了5株亞型(D5和D8)，這與已知的地理分布不一致；以及Shi等[4]對B3亞型的錯誤分型等。目前HBV有8個證實基因型(A至H)和2個暫定基因型(I和J)[5]。其中，基因型A又進一步分為A1～A7亞型；B型分為B1～B9亞型；C型有C1～C16亞型；D型有D1～D8亞型；基因型F只有4種亞型F1～F4；其他基因型目前還未發現亞型存在。

基因型分布在不同的地區和不同的人種中。有關HBV基因型研究表明，B和C基因型主要分布在亞洲，而歐洲最常見的基因型是A和D型[6]。地中海、中東、中亞地區以D型為主，北美地區C型為主，其次是A和B型，H型少量分布在美國中部。印度的基因型以D型為主，D型是全球分布最廣的基因型，E型是西非的優勢亞型，F型是在南美洲和中美洲發現的。G型是目前HBV基因分型中最少見的一個型，它是2000年時由來自美國和法國的標本中分離的。G型導致感染是通常要有其他型的HBV存在，最常見的就是G型合并A2型，因為A2型能夠增強G型病毒的復制[7]。我國以B和C兩種基因型為主，也有少量的A和D基因型和B/C基因型混合感染，其中北方以C型為多，南方以B型占優勢，各省之間并不完全相同[8]。越來越多的研究表明在不同的國家、地區和人群中流行的HBV存在基因型上的差異。見表1。

表1　HBV基因型的地理分布表[9-14]

3　HBV基因分型的方法

至今HBV基因分型的檢測方法主要包括以下 10 種[15-17]：

3.1全基因測序法全基因測序法是PCR擴增HBV全基因DNA，擴增產物經膠回收后進行測序并做種系進化統計，分析不同病毒株之間的親緣關系，得出各病毒株的型別，該方法是分析和確定基因型的最準確方法，也是 HBV 基因分型的金標準。但耗時、費用高，不適用于大規模流行基因病學調查。

3.2聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP) 基因分型法PCR-RFLP基因分型法是先將待測的靶DNA片段進行擴增，再用限制性核酸內切酶對擴增產物進行酶切，不同基因型的序列產生的限制性片段數目和長度不同，最后經電泳分析靶DNA片段而分型。此法不需雜交和測序，是一種有效、簡便的分型方法，適用于流行病學調查研究。缺點是：酶切位點易受基因變異的影響，且混合感染或酶切不完全時，會出現復雜條帶，影響結果判斷。

3.3單克隆抗體酶聯免疫吸附試驗(ELISA)分型法單克隆抗體ELISA分型法是根據HBV前S2區的特異性表位設計特異的單克隆抗體，并用辣根過氧化物酶進行標志，一般采用雙抗體夾心法分析聯合檢測，可以得到各待測標本的表位組合，這些表位與基因型存在對應關系，根據單克隆抗體表位鑒定出不同的基因型。該方法操作簡便，可用于大樣本的檢測。但對一些混合型感染和HBsAg低水平表達的標本可能無法鑒別。

3.4型特異性引物-PCR分型法型特異性引物-PCR分型法是對HBV各型別全序列或某目標序列(S區)進行比對分析，找出每種基因型的獨特序列，設計相應的引物進行兩次或一次PCR擴增，經過擴增后得到不同長度的相應基因產物，通過瓊脂糖凝膠電泳分析確定不同的基因型。該方法簡化了操作步驟，特異性較高，是目前應用比較多的一種適合大樣本研究的方法，不足是存在非特異性擴增。

3.5PCR 微板核酸雜交-ELISA法PCR微板核酸雜交-ELISA法是將基因擴增、核酸分子雜交和酶聯免疫顯色3種技術融為一體，發揮了核酸分子雜交技術特異性高、PCR檢測技術靈敏度高和酶聯顯色檢測方便的優點。首先將待測核酸進行PCR擴增，將擴增產物加入預先包被HBV通用探針的微孔板，再加入HBV各基因型顯色探針，進行微板核酸雜交，然后通過酶聯免疫顯色判斷結果。該方法耗時短、特異性強、且準確可靠，可用于大規模的HBV分型檢測。

3.6線性探針分析(LiPA)基因分型法LiPA基因分型法遵循反向雜交的原理，根據待測序列設計各型特異性線性探針并固化在支持物上，對待測標本特定序列進行PCR擴增，然后將擴增產物與固相探針反向雜交，經顯色反應得出結果。該法最大優點是可鑒別用直接測序不能區分的混合型感染。

3.7實時定量 PCR-溶解曲線分析實時定量PCR-溶解曲線分析是將傳統PCR檢測模式中的PCR擴增和檢測相結合，并用溶解曲線分析確定基因型，不同的基因型其目標序列與探針結合時GC含量間的互補性差異導致不同的熔解溫度(TM)。該方法快速準確，靈敏度高，可鑒別混合型感染。

3.8限制性片段質譜多態性(RFMP)RFMP以限制性內切酶切割PCR產物，產生型特異性寡核苷酸片段，產生片段的分子量用質譜進行分析。該方法檢測限100 copy/mL,靈敏度較高，可以檢測突變型和野生型標本，但儀器體積龐大，價格昂貴。

3.9多重PCR多重PCR是在同一PCR反應體系里加入2對以上引物，同時擴增出多個核酸片段，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析確定其基因型。其經濟、快速，可用于大規模研究，可檢測混合基因型，但單核苷酸多態性(SNP)酶切位點可影響到方法的靈敏度。

3.10PCR-侵入法PCR-侵入法能檢測不同的基因型和亞型，先用多重PCR擴增S序列，然后經過2個侵入反應，第1個侵入反應是將擴增產物與型特異的寡核苷酸初級探針(P1或P2)結合，根據基因型對P1或P2的5′端進行切割，導致5′翼片的釋放，在第2個反應中，切割下來的5′翼片能和其通用的FRET盒結合，導致其切割并釋放特異性熒光，產生的熒光信號與HBV基因型相對應。該方法有極高的靈敏度，可檢測混合基因型，同樣SNP酶切位點可影響到方法的靈敏度。

4　乙肝基因型的致病性和治療反應

研究資料顯示，不同基因型/亞型其臨床表現不同。日本一項包括585例慢性乙肝患者的研究表明，基因型B較C型進展至肝硬化更緩慢，更早發生HBeAg血清轉換和有更少的炎癥活動[18]；基因型C和D引起的肝臟疾病比基因型A和B更嚴重，轉化成肝癌的可能性更大。與基因型B相比，基因型C患者HBeAg陽性和HBV DNA、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)水平、肝臟病理的炎癥和纖維化程度均較高；基因型C患者HBeAg更易在年齡偏大時發生血清轉換延遲，對干擾素的應答率也較低。顧錫炳等[19]的研究認為C基因型感染者非特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)比B基因型感染者高，非特異性細胞免疫清除HBV的作用相對較弱，在清除HBV的過程中可起肝細胞損傷。這可能是導致C基因型HBV DNA水平、HBeAg陽性率、肝功能損害高于B基因型感染者的原因。美國的研究報道了CHB患者中D基因型更容易導致肝炎的發作，而瑞士的研究顯示A基因型較D型更容易慢性化。35歲前B基因型HBV易形成肝細胞癌(HCC)，而50歲以后C型HBV感染者比B基因型更易形成HCC。在所有年齡段內，混合型的病毒載量和HBeAg陽性率最高，提示混合型的HBV感染者較單個基因型感染者更容易形成HCC[20]。一般患者都會合并感染多于2個不同基因型的HBV，例如在亞洲的B和C基因型的合并感染，G基因型引發的慢性感染需要A基因型或H基因型的存在等。

不同基因型的HBV感染者對抗病毒治療的反應也存在差異。一項臺灣的研究報道指出，干擾素治療后，B基因型的HBeAg血清轉換率為41%，而同組中C基因型的轉換率僅為15%[21]，且基因型A和B對干擾素為基礎的治療比基因型C和D有更好的反應。B基因型感染的預后一般較好，B基因型HBeAg陽性的CHB患者對IFN-α治療的應答率高于C基因型，A基因型患者高于D基因型。研究顯示B型CHB患者經拉米夫定治療后HBV DNA陰轉率、HBeAg血清轉換率及ALT復發率均顯著高于B+C及C基因型CHB患者，這可能與C基因型預后不良有關[22]。B1基因亞型的患者比B2基因亞型具有更高的HBeAg陽性率及拉米夫定耐藥的發生率。也有研究表明：C2基因亞型比B2基因亞型更易發生拉米夫定耐藥，在CHB患者中更明顯。目前有感染B2基因亞型的HCC患者術后易復發的報道[23]，提示基因型不僅與HCC的發生有密切關系，同時也影響著腫瘤的復發和轉移。當然，有些基因型的臨床結果和治療反應等仍存在爭議，如基因型D[24]等，為此還需要做進一步的研究。

5　小　結

全球化和移民人口的增大加快了病毒株之間的分布和重組，如基因型A/D、A/E、C/D、G/C、D/F、A/F等的重組，由于重組導致基因片段在不同的病毒株之間的移動是導致HBV多樣性的原因[25]，而移民是全球性HBV分布的混雜因素，大量的移民改變了HBV基因型的分布，導致了越來越多異國株的出現[26-27]。目前HBV基因分類方法尚不完善，本領域的專家開始關心那些新發現的亞型的分類是否準確。Pourkarim等[28]認為分型時應該系統地對病毒基因組進行分析，而不是僅僅對部分序列進行分析。Mahmoud等提出了新術語“recombino-亞型”和“immigro-亞型”；Pourkarim也同時認為，對于重組株沒必要給予特定的分型，只需歸于重組亞型就好。HBV基因型的分類存在很多復雜因素，對此還需要做更多的研究。

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2016-01-29修回日期：2016-05-06)

云南省應用基礎研究計劃-昆醫聯合專項資助項目(2014FB094)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.033

A

1673-4130(2016)15-2136-04