Irgm1在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦脊髓中的表達

王春雨　王 葳　于淑杰　楊欣燕　陳桂英　綦 瑩（哈爾濱市兒童醫(yī)院 神經(jīng)內科，黑龍江 哈爾濱 150010）

?

Irgm1在實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦脊髓中的表達

王春雨王 葳于淑杰楊欣燕陳桂英綦 瑩
（哈爾濱市兒童醫(yī)院 神經(jīng)內科，黑龍江 哈爾濱 150010）

目的 探討IFN-γ誘導性免疫相關GTP酶Irgml在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）發(fā)病中的免疫調節(jié)作用。方法 ①建立EAE動物模型：a.經(jīng)典EAE小鼠模型；b.基因敲除小鼠（Irgm1-/-）EAE模型。②EAE模型癥狀學評價。③在基因和蛋白水平檢測Irgm1在經(jīng)典型EAE小鼠腦和脊髓中的表達。結果 ①成功誘導了小鼠EAE模型。②基因和蛋白水平檢測經(jīng)典型EAE小鼠Irgml的表達與對照組小鼠比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。③經(jīng)典型EAE小鼠Irgm1的表達在免疫后不同時間呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。結論 ①EAE模型建立方法穩(wěn)定、可靠。②Irgm1在EAE發(fā)生、發(fā)展和恢復中起著復雜的免疫調節(jié)作用，可能是EAE發(fā)病的致病因素之一。

Irgm1；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；小鼠；腦；脊髓；表達

急性播散性腦脊髓炎（ADEM）為中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性炎癥性脫髓鞘性疾病，是一種細胞免疫介導的自身免疫性疾病［1］，好發(fā)于兒童及青少年［2］，且近年來有上升趨勢。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）是ADEM的經(jīng)典動物模型［3］。在EAE動物模型中，Th1型細胞因子被認為對疾病的發(fā)生起促進作用，而Th2型細胞因子與疾病的恢復相關［4］。免疫相關GTP酶家族成員Irgm1是分子量為47kD的Th1型細胞因子IFN-γ誘導的GTP酶，廣泛表達于巨噬細胞等有核細胞上［5］。Irgm1與人類ADEM及小鼠EAE的發(fā)病密切相關，本研究探討Irgml在EAE發(fā)病中的免疫調節(jié)作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物：C57BL/6純系小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；Irgm1基因敲除鼠，由美國杜克大學Taylor教授惠贈。

1.2實驗試劑與器材：髓鞘少突膠質細胞糖蛋白33-55（MOG33-55）；兔抗Irgm1多克隆抗體；弗氏完全佐劑（CFA）；百日咳毒素（PTX）；電泳槽；80i尼康熒光顯微鏡；PCR儀；Real time PCR儀。

1.3試驗方法

1.3.1EAE模型的誘導取C57BL/6和Irgm1-/-小鼠，將MOG33-55 （2 mg/mL）與等體積的弗氏完全佐劑（CFA）1∶1混勻制成乳劑，分別在小鼠雙側腋窩皮下注射MOG/CFA乳劑200 μg/只，于免疫后第0、48 h尾靜脈注射百日咳毒素（PTX）200 ng/只。

1.3.2EAE小鼠臨床評價：小鼠免疫7 d后進行臨床評分。評分標準：1分：尾部無力或蹣跚步態(tài)伴尾部有力；2分：蹣跚步態(tài)伴尾部無力（共濟失調）；3分：單后肢完全麻痹或雙后肢部分麻痹，肢體尚能爬行；4分：雙后肢完全麻痹；5分：瀕死或死亡［6-7］。

1.3.3基因和蛋白水平檢測Irgm1在EAE小鼠腦脊髓中的表達：分別取未免疫的對照組小鼠和經(jīng)典型EAE小鼠的腦和脊髓組織，提取RNA，經(jīng)RT-PCR獲得cDNA，應用Real-Time PCR檢測Irgm1在基因水平的表達。分別取對照組的小鼠和經(jīng)典型EAE小鼠的脊髓，提取蛋白，應用Western blot檢測Irgm1在蛋白水平的表達。

1.4統(tǒng)計學分析：對實驗結果的統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，配對資料間的比較采用配對樣本t檢驗，統(tǒng)計結果用均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結 果

2.1EAE小鼠模型的誘導

2.1.1EAE發(fā)病臨床表現(xiàn)：經(jīng)典型EAE小鼠在免疫后10 d開始出現(xiàn)癥狀，表現(xiàn)為活動減少、食欲不振，尾部張力降低。隨后出現(xiàn)由輕到重的臨床癥狀，表現(xiàn)為：尾部無力或蹣跚步態(tài)伴尾部無力；蹣跚步態(tài)伴尾部無力（共濟失調）；共濟失調伴部分單肢麻痹；單肢完全麻痹或雙肢部分麻痹且部分麻痹，肢體尚能爬行；單肢完全麻痹伴另一肢部分麻痹或雙肢部分麻痹且不能爬行；雙肢完全癱瘓等。14 d左右癥狀達高峰，癥狀持續(xù)5～6 d，病情逐漸緩解。Irgm1-/-小鼠表現(xiàn)無癥狀或癥狀輕微。

2.1.2EAE小鼠臨床評分：小鼠免疫以后，第7天開始進行臨床評分，經(jīng)典型EAE小鼠在免疫后第10天左右開始發(fā)病，多數(shù)小鼠發(fā)病高峰集中在免疫后14～16 d，評分最高分達4分，與對照組比較有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Irgm1-/-小鼠發(fā)病輕微，評分最高分1.5分，與經(jīng)典型EAE小鼠相比有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　免疫后EAE小鼠的臨床評分（±s）

表1　免疫后EAE小鼠的臨床評分（±s）

免疫后的時間（d）　經(jīng)典型EAE小鼠（分）　Irgm1-/-小鼠（分）7 0 0 9 0 0 10　0.52±0.15　0 11　1.05±0.28　0.49±0.14 12　1.51±0.31　0.75±0.25 13　2.13±0.53　1.02±0.33 14　2.58±0.64　1.25±0.39 15　2.76±0.78　1.31±0.41 16　3.12±0.81　1.42±0.45

2.2檢測Irgm1在EAE小鼠腦脊髓中的表達

2.2.1基因水平檢測Irgm1在EAE小鼠腦和脊髓中的表達：應用Real-Time PCR在mRNA水平定量分析，臨床評分為2分和4分經(jīng)典型EAE小鼠的腦和脊髓中Irgm1表達分別為對照組的2.21±0.19、4.55±1.51倍和2.53±0.21、5.13±0.56倍（表2），與對照組比較有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

表2　EAE小鼠腦和脊髓中Irgm1的表達（倍數(shù)，±s）

表2　EAE小鼠腦和脊髓中Irgm1的表達（倍數(shù)，±s）

類別　腦組織中Irgm1表達　脊髓腦組織中Irgm1表達對照組小鼠　1.00　1.00評分2分的EAE小鼠　2.21±0.19　4.55±0.51評分4分的EAE小鼠　2.53±0.21　5.13±0.56

2.2.2蛋白水平檢測Irgm1在EAE小鼠脊髓中的表達：應用Western blot在蛋白水平定性檢測經(jīng)典型EAE小鼠脊髓中Irgm1表達高于對照組小鼠，見圖1。

2.3基因水平檢測EAE小鼠Irgm1在不同時間點的變化趨勢：應用Realtime PCR檢測經(jīng)典型EAE小鼠腦和脊髓Irgm1表達在免疫后呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。見圖2、3。

圖1　經(jīng)典型EAE小鼠與對照組小鼠脊髓表達Irgm1的比較

圖2　經(jīng)典型EAE小鼠免疫后不同時期腦組織表達Irgm1 mRNA與對照組的倍數(shù)關系

圖3　經(jīng)典型EAE小鼠免疫后不同時期脊髓組織表達Irgm1 mRNA與對照組的倍數(shù)關系

3　討 論

為探討Irgm1在ADEM發(fā)病機制中的免疫調節(jié)作用，本研究通過ADEM相應的動物模型EAE小鼠模型［3］，觀察了經(jīng)典型EAE小鼠和Irgm1-/-EAE小鼠的臨床表現(xiàn)和Irgm1在經(jīng)典型EAE小鼠腦和脊髓中的表達以及Irgm1在經(jīng)典型EAE小鼠不同病變時期的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典型EAE小鼠模型免疫后14～16 d左右發(fā)病達到高峰，而Irgm1-/-小鼠無臨床癥狀或僅出現(xiàn)輕微的臨床癥狀，這與文獻報道的用MBP等其他抗原免疫的結果基本一致［8］。Irgm1是一個由IFN-γ誘導的GTP酶，在IFN-γ介導的宿主抗感染免疫中起重要作用。Feng［9］等報道，在免疫應答過程中IFN-γ可誘導Irgm1發(fā)揮抗感染及免疫調節(jié)作用。本研究應用Real-time PCR和Western blot技術，分別從基因和蛋白水平比較了經(jīng)典型EAE小鼠與對照組小鼠腦和脊髓中Irgm1的表達。結果表明，經(jīng)典型EAE小鼠腦與脊髓中均有Irgm1的高表達，以脊髓中表達更為顯著。且隨著疾病的恢復，Irgm1的表達逐漸減低，免疫后35 d左右恢復至接近免疫前水平。說明Irgm1在EAE發(fā)生、發(fā)展和恢復中起著重要的免疫調節(jié)作用。Irgm1是由IFN-γ誘導產(chǎn)生的，而Th1細胞分泌大量IFN-γ，說明Th1細胞在EAE的發(fā)病中起著重要作用。但是，Irgm1是否為人類ADEM的重要的致炎因子，是否可以用Irgm1抗體對ADEM進行免疫治療，還有待于進一步研究。

［1］ 左啟華.小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：635.

［2］ Garg RK.Acute disseminated encephalomyelitis［J］.Postgrad Med J，2003，79：11-17.

［3］ 郭淑艷，王華.實驗性自身免疫性腦脊髓炎相關的神經(jīng)干細胞研究進展［J］.國際兒科學雜志，2008，35（2）：165-167.

［4］ McGeachy MJ，Anderton SM.Cytokines in the induction and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Cytokine，2005，32（2）：81-84.

［5］ Taylor GA.IRG proteins： key mediators of interferon-regulated host resistance to intracellular pathogens［J］.Cellular Microbiol，2007，9（5）：1099-10107.

［6］ Miller SD，Turley DM.Antigen-specific tolerance strategies for the prevention and treatment of autoimmune disease［J］.Nat Rev Immunol，2007，7（9）：665-677.

［7］ Liston A，Kohler RE.Inhibition of CCR6 function reduces the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis via effects on the priming phase of the immune response［J］.Immunol，2009，182（5）：3121-3130.

［8］ Stefferl A，Brehm U，Linington C.The myelin oligodendrocyte glycoprotein （MOG）： a model for antibody-mediated demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis［J］.J Neural Transmission，2000，（58）：123-133.

［9］ Feng CG，Zheng L，Jankovic D，et al.The immunity-related GTPase Irgm1 promotes the expansion of activated CD4+T cell populations by preventing interferon-gamma-induced cell death［J］.Nat Immunol，2008，9（11）：1279-1287.

R744.3

B

1671-8194（2016）19-0035-02

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題（課題編號：2013289）