基質輔助激光解析電離飛行時間質譜快速鑒定沙門菌臨床分離株

梁達煒，梁權輝，方艷平，姜長宏，龍　軍，曾念宜，林麗娟，江凌曉

?

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜快速鑒定沙門菌臨床分離株

梁達煒，梁權輝，方艷平，姜長宏，龍軍，曾念宜，林麗娟，江凌曉

目的評估基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)在沙門菌鑒定中的臨床應用，并研究其影響因素。方法用傳統血清學方法鑒定沙門菌的血清型，用MALDI-TOF MS對哥倫比亞血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板分別培養24 h、72 h、120 h和168 h的179株沙門菌進行鑒定。結果179株沙門菌可分為38種血清型，腸炎沙門菌(21.2%)、斯坦利沙門菌(17.3%)和Ⅰ4,5,12:i:-沙門菌(16.2%)居前3位。所有菌株在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板分別培養24 h和72 h均能被MALDI-TOF MS準確鑒定為沙門菌。MALDI-TOF MS的耗材成本約為微生物自動生化鑒定系統(Vitek 2)的1/3，檢測時間約為Vitek 2的1/7。結論在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板培養3 d以內的沙門菌，MALDI-TOF MS均可以準確鑒定。與Vitek 2相比，MALDI-TOF MS檢測的速度更快，消耗的成本更低，并且可以直接鑒定生長在選擇性培養基的沙門菌。

沙門菌；基質輔助激光解析電離飛行時間質譜；鑒定

Supported by grant of the National Projects of Major Infectious Disease Control and Prevention (No. 2012ZX10004-213)

從1966年到2007年，世界上每年有超過9 380萬人患上沙門氏菌病，導致155 000個死亡病例[1]。基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time f Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) 是近年發展起來的一種新型軟電離質譜技術，并逐漸應用于細菌和真菌的快速鑒定[2-4]。MALDI-TOF MS的基本原理是微生物標本與基質形成的共結晶體被激光照射后，通過基質吸收激光能量傳遞給樣本，同時將質子轉移給生物分子，從而使其發生電離，不同的微生物標本產生不同的微生物蛋白質量指紋圖譜而被鑒別。目前常用的微生物自動生化鑒定系統，例如Vitek 2(梅里埃，法國)，是通過辨別細菌引起的不同生化反應進行菌屬鑒定，但其細菌培養的時間和生化反應的時間使檢測時間至少需要4 h。不同的培養基、培養時間、樣品的處理方式會影響MADLI-TOF MS鑒定細菌的結果[5-6]。本研究利用MADLI-TOF MS檢測179株沙門菌的臨床分離株，評估其在沙門菌鑒定中的臨床應用，并對其影響因素進行研究。

1　材料與方法

1.1菌株來源本研究中，共有179個沙門菌菌株，由南方醫科大學珠江醫院微生物實驗室保存。所有細菌菌株均經過Vitke 2 (梅里埃, 法國)鑒定為沙門菌菌屬。

1.2儀器微生物自動生化鑒定系統Vitek 2和MALDI-TOF MS 質譜儀為法國梅里埃公司產品。

1.3試劑GN卡(革蘭陰性菌鑒定卡)、CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質液、Vitek MS-DS 靶板、MH平板、哥倫比亞血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板均為法國梅里埃公司產品。沙門菌診斷血清為丹麥國家血清研究院(Statens Serum Institut, Denmark)產品。

1.4血清型鑒定沙門菌菌株血清型鑒定參考國家標準GB4789.4-2010進行，根據Kauffman-White 表，確定具體的血清型。

1.5MALDI-TOF MS鑒定所有的菌株接種于哥倫比亞血平板37 ℃孵育(24±1) h。用無菌接種環挑取單個菌落均勻涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL CHCA覆蓋，在室溫下自然干燥后進行檢測。每個菌株從靶板點樣到質譜檢測重復2次試驗。

1.6不同培養條件下MALDI-TOF MS對沙門菌的鑒定179株沙門菌菌株分別接種于血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板，在37 ℃分別培養24 h、72 h、120 h、168 h后挑取單個菌落均勻涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL CHCA覆蓋，在室溫下自然干燥后進行檢測。每個菌株從靶板點樣到質譜檢測重復2次試驗。

2　結　果

2.1血清型分布179株沙門菌被鑒定為38種血清型，其中腸炎沙門菌38株，占21.2%；斯坦利沙門菌31株，占17.3%；，Ⅰ4,5,12:i:-沙門菌29株，占16.2%；鼠傷寒沙門菌18株，占10.1%；德爾卑沙門菌6株，占3.4%；湯卜遜沙門菌5株，占2.8%；韋太夫雷登沙門菌5株，占2.8%；其他血清型沙門菌47株，占26.3%。

2.2MALDI-TOF MS和Vitek 2鑒定沙門菌的比較MALDI-TOF MS對腸炎沙門菌、I 4,5,12:i:-沙門菌、鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌等38種血清型179株沙門菌均能準確鑒定，與Vitek 2 鑒定的結果完全一致，如表1所示。Vitek 2鑒定沙門菌的耗材成本遠高于MALDI-TOF MS，幾乎是MALDI-TOF MS的3倍，如表2所示。另外，MALDI-TOF MS每鑒定16株沙門菌所需要的時間僅僅約為Vitek 2所需時間的1/7。

在臨床微生物檢測的工作中，懷疑沙門菌感染的臨床患者的標本需要先用選擇性平板如SS平板、HE平板進行培養，然后對可疑的菌株需轉接到血平板再培養18～24 h后，挑取單個菌落，用Vitek 2進行檢測。另外，單個菌株從上機檢測至結果輸出，Vitek 2至少需要4 h。因此，Vitek 2鑒定沙門菌從標本接種至鑒定結果輸出至少需要2 d，而MALDI-TOF MS可以直接從SS平板、HE平板挑取菌落進行鑒定，只需1 d左右就能獲得鑒定結果，并且單個菌株上機檢測的過程僅需要5 min。

2.3不同條件下MALDI-TOF MS鑒定沙門菌的結果接種于4種不同類型的平板：血平板、HE平板、SS平板、麥康凱平板的179株沙門菌分別培養24 h和72 h均能被MALDI-TOF MS準確鑒定為沙門菌，如表3所示。培養時間為120 h時，血平板、HE平板、SS平板、麥康凱平板培養的沙門菌菌株分別有7株、8株、36株、32株無法與質譜儀的數據庫匹配得出檢測結果，故其被MALDI-TOF MS成功檢測的鑒定率分別為96.1%、95.5%、79.9%和82.1%。然而，當培養時間為168 h時，血平板、HE平板、SS平板、麥康凱平板培養的沙門菌菌株分別有88株、89株、96株、61株無法與質譜儀的數據庫匹配得出鑒定結果，故其被MALDI-TOF MS成功檢測的鑒定率分別為50.8%、50.3%、46.4%和65.9%。

表1MALDI-TOF MS 和Vitek 2對不同血清型沙門菌在屬的水平上的鑒定結果比較

Tab.1Comparison of MALDI-TOF MS and Vitek 2 for Salmonella identification at genus level

血清型Serotype菌株數No.ofisolatesMALDI-TOFMSno.ofisolates(%)Vitek2no.ofisolates(%)準確鑒定Correctidentification鑒定錯誤Wrongidentification未鑒定出No.ofnotdetected準確鑒定Correctidentification鑒定錯誤Wrongidentification未鑒定出No.ofnotdetected腸 炎沙門菌3838(100.0)0038(100.0)00斯坦利沙門菌3131(100.0)0031(100.0)00I4,5,12:i:-沙門菌2929(100.0)0029(100.0)00鼠傷寒沙門菌1818(100.0)0018(100.0)00德爾卑沙門菌66(100.0)006(100.0)00其他33種血清型5757(100.0)0057(100.0)00合計179179(100.0)00179(100.0)00

表2MALDI-TOF MS 和Vitek 2鑒定沙門菌的耗材成本和時間

Tab.2Consuming cost and detection time of MALDI-TOF MS and Vitek 2 for Salmonella identification

MALDI-TOFMSVitek2Consumingcost(yuan)/oneisolate2056Detectiontime(min)/16isolates45320

a從菌株標本準備到結果結果輸出所需時間。

Note: Detection time from isolate preparation to result output.

表3MALDI-TOF MS在不同培養基不同培養時間條件下對179株沙門菌準確鑒定的菌株數量和鑒定率

Tab.3Number of Salmonella isolates and identification rate for accurate identification of 179 Salmonella strains by MALDI-TOF MS under different culture mediums and inoculation time

培養時間Inoculationtime(h)培養基Culturemedium血平板BloodagarHE平板HEagarSS平板SSagar麥康凱平板MacConkeyagar24179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)72179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)120172(96.1%)171(95.5%)143(79.9%)147(82.1%)16891(50.8%)90(50.3%)83(46.4%)118(65.9%)

3　討　論

從上世紀80年代以來，基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)被發現可以對大質量生物分子進行分析，包括核糖體蛋白，MALDI-TOF MS就逐漸被廣泛應用于細菌的檢測[7]。隨后，國內外多個研究報道，不同的培養基和不同的培養時間對MALDI-TOF MS鑒定微生物的結果產生影響[5, 8-10]。但是，對于從臨床患者分離的沙門菌菌株，目前還沒有研究報道不同種類的培養基和不同培養時間對MADLI-TOF MS的鑒定結果的影響。

本研究中，對于在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板分別培養24 h和72 h的179株沙門菌臨床分離株，MALDI-TOF MS均能準確鑒定到沙門菌菌屬。但是當培養時間延長至120 h時，部分菌株無法被MALDI-TOF MS準確鑒定；當培養時間延長至168 h時，在各種類型平板培養的菌株至少有35%的菌株無法被MALDI-TOF MS準確鑒定。這表明培養時間在72 h內，在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板培養的沙門菌可以被MALDI-TOF MS準確鑒定到沙門菌菌屬，這足以滿足臨床對沙門菌檢測的需求。

MALDI-TOF MS在鑒定沙門菌菌屬時，與Vitek 2的檢測結果完全一致，所有菌株均能準確鑒定到沙門菌菌屬。但MALDI-TOF MS的耗材成本約為Vitek 2的1/3，檢測時間約為Vitek 2的1/7。MALDI-TOF MS可以準確鑒定各種血清型的沙門菌。對于培養時間在3 d以內培養于血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板的沙門菌，MALDI-TOF MS均可以準確鑒定，比通過鑒別沙門菌的相關生化反應的傳統鑒定方法所需的時間減少24 h以上。因為在SS平板和HE平板等選擇性平板上，由于大多數沙門菌會產生H2S，H2S與培養基中的Fe離子在菌落中心形成黑色物質FeS, 從而影響生化反應的鑒定結果，因此需要將可疑菌株轉接到血平板培養后再進行鑒定。在沙門菌屬的水平上的鑒定，與Vitek 2相比，MALDI-TOF MS可以更快獲得鑒定結果，消耗的成本費用更低，并且對于常用的選擇性培養基，如HE平板、SS平板和麥康凱平板，其檢測結果不會受到影響。

[1] Majowicz SE, Musto J, Scallan E, et al. The global burden of nontyphoidalSalmonellagastroenteritis[J]. Clin Infect Dis, 2010, 50(6): 882-889. DOI: 10.1086/650733

[2] Seng P, Drancourt M, Gouriet F, et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Clin Infect Dis, 2009, 49(4): 543-551. DOI: 10.1086/600885

[3] Bader O, Weig M, Taverne-Ghadwal L, et al. Improved clinical laboratory identification of human pathogenic yeasts by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Clin Microbiol Infect, 2011, 17(9): 1359-1365. DOI: 10.1111/j.1469-0691.2010.03398.x

[4] Chao QT, Lee TF, Teng SH, et al. Comparison of the accuracy of two conventional phenotypic methods and two MALDI-TOF MS systems with that of DNA sequencing analysis for correctly identifying clinically encountered yeasts[J]. PLoS One, 2014, 9(10): e109376. DOI: 10.1371/journal.pone.0109376

[5] Valentine N, Wunschel S, Wunschel D, et al. Effect of culture conditions on microorganism identification by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(1): 58-64. DOI: 10.1128/AEM.71.1.58-64.2005

[6] Martiny D, Visscher A, Catry B, et al. Optimization ofCampylobactergrowth conditions for further identification by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)[J]. J Microbiol Methods, 2013, 94(3): 221-223. DOI: 10.1016/j.mimet.2013.06.018

[7] Wieser A, Schneider L, Jung J, et al. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review)[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(3): 965-974. DOI: 10.1007/s00253-011-3783-4

[8] Dieckmann R, Helmuth R, Erhard M, et al. Rapid classification and identification ofSalmonellaeat the species and subspecies levels by whole-cell Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J]. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(24): 7767-7778. DOI: 10.1128/AEM.01402-08

[9] Balazova T, Makovcova J, Sedo O, et al. The influence of culture conditions on the identification ofMycobacteriumspecies by MALDI-TOF MS profiling[J]. FEMS Microbiol Lett, 2014, 353(1): 77-84. DOI: 10.1111/1574-6968.12408

[10] Chen XJ, Yun HH, Kuang H, et al. Studies on the protein fingerprint ofSalmonellaby MALDI-TOF-MS[J]. Food Sci Biotech, 2012(11): 1189-1197. (in Chinese)

陳秀金，尹紅紅，匡華，等. 沙門氏菌MALDI-TOF-MS蛋白質指紋圖譜分析方法的研究[J]. 食品與生物技術學報, 2012(11): 1189-1197.

Rapid identification onSalmonellaisolated from clinical specimens by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry

LIANG Da-wei, LIANG Quan-hui, FANG Yan-ping, JIANG Chang-hong,LONG Jun, ZENG Nian-yi,LIN Li-juan, JIANG Ling-xiao

(ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510000,China)

In this study, we aimed to evaluate the clinical application values of matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) forSalmonellaidentification and investigate its influencing factors. AllSalmonellaisolates were serotyped by traditional serological method.Salmonellaisolates were cultured for 24, 72, 120 and 168 h in Columbia blood agar, Hektoen Enteric (HE) agar, Salmonella Shigella (SS) agar and MacConkey (MAC) agar respectively. And then the strains were identified by MALDI-TOF MS. Thirty-eight serotypes were identified among 179Salmonellastrains and the top three serotypes wereSalmonellaenteritidis (21.2%),Salmonellastanley (17.3%) andSalmonellaⅠ4,5,12:i:-(16.2%). All isolates cultured in blood agar, HE agar, SS agar and MAC agar for 24 h and 72 h could be correctly identified by MALDI-TOF MS. The consuming cost of MALDI-TOF MS was about one third of microbial automatic biochemical identification system (Vitek 2) and its detection time was one seventh of Vitek 2.Salmonellacultured in Columbia blood agar, Hektoen Enteric agar,SalmonellaShigellaagar and MacConkey agar within three days could be correctly identified by MALDI-TOF MS. Compared with Vitek 2, MALDI-TOF MS provided a faster and lower-cost method that could also directly identifySalmonellaisolates cultured in selective medium.

Salmonella; matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry; identification

Jiang Ling-xiao, Email: jiang-lingxiao@163.com

江凌曉，Email：jiang-lingxiao@163.com

南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，廣州510000

R446.5

A

1002-2694(2016)07-0600-04

2015-12-07；

2016-04-25

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.002

國家科技重大專項課題資助項目(No.2012ZX10004-213)