江西省C群腦膜炎奈瑟菌藥物敏感性及PFGE分子特征分析

熊長輝，楊　夢，劉曉青，徐曉倩，王　鵬，袁　輝

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江西省C群腦膜炎奈瑟菌藥物敏感性及PFGE分子特征分析

熊長輝，楊夢，劉曉青，徐曉倩，王鵬，袁輝

目的分析江西省2006-2010年分離的C群腦膜炎奈瑟菌的藥物敏感性及分子特征。方法采用E-test試紙條檢測方法對38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株進行體外抗菌藥物敏感性檢測，利用脈沖場凝膠電泳技術(Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE)進行分子特征分析。結果所有菌株對氯霉素、美洛培南、阿奇霉素、米洛環素、頭孢噻肟、頭孢曲松和利福平均敏感；15(39.5%)株菌株對青霉素不敏感，18(47.4%)株對氨芐西林不敏感，25(65.8%)株對環丙沙星耐藥，23(60.5%)株對左氧氟沙星耐藥，11(28.9%)株對復方新諾明不敏感。PFGE分型顯示以AH1和AH2型為主，并且同一地區的帶型以同一種帶型為主。結論江西省2006-2010年分離C群腦膜炎奈瑟菌株對喹諾酮類藥物具有較高的耐藥性，還有大部分菌對磺胺類和青霉素類藥物也不敏感。PFGE分型特征雖然呈多態性，但是以AH1和AH2型為優勢克隆型。

腦膜炎奈瑟菌；分子分型；藥敏試驗；脈沖場凝膠電泳

腦膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis，Nm) 是引起細菌性腦膜炎的主要病原菌，及時診斷和抗菌藥物的干預對臨床治療起到至關重要的作用。由于Nm菌株的分子型別和耐藥性在不斷發生變化，因此，對Nm菌株進行分子特征分析以及抗生素耐藥性檢測和監測，及時了解Nm菌株和耐藥性的變遷情況，為臨床治療用藥和預防性服藥提供實驗室依據尤為重要。本研究對江西省2006-2010年分離的38株C群腦膜炎奈瑟菌進行了抗生素體外敏感性實驗和PFGE分子分型，以觀察C群Nm耐藥性和分子特征的變化趨勢。

1　材料與方法

1.1菌株來源

1.1.1實驗菌株江西省2006-2010年從病人、密切接觸者和健康人群分離C群腦膜炎奈瑟菌菌株38株。

1.1.2參考菌株藥敏質控菌株為S.pneumoniaeATCC 49619 菌株和PFGE的DNA分子量標準參考菌株H9812均由中國疾病預防控制中心提供。

1.2主要試劑及耗材E-test 試紙條(bioMerieux SA)、培養基為加5%羊血的Mueller-Hinton(M-H) 瓊脂、NheI和XbaI內切酶(TaKaRa)，一次性Falcon 2054試管(BD公司)，一次性50 mL screw-cap tube(BD公司)， SeaKem Gold Agarose(瑞士Lonza公司)。

1.3主要儀器微量高速離心機(eppendorf)、自動凝膠成像儀(Bio-Rad)、脈沖場凝膠電泳系統 CHEF MAPPER(Bio-Rad)，細菌濁度儀(bioMerieux)，超凈工作臺(中國蘇凈安泰SW-CJ-2FD)、 二氧化碳培養箱(UNAIRE)、高速冷凍離心機(SIGMA 3-18K)、生物安全柜(Thermo)。

1.4方法

1.4.1藥敏試驗用無菌棉拭子刮取分純后的待測菌于無菌的M-H稀釋肉湯(用前加熱到35 ℃) 制成0.5麥氏單位的菌懸液，然后均勻涂布于含5%羊血的M-H瓊脂平板上，粘貼E-test藥敏試紙條，置于二氧化碳培養箱中，37 ℃培養18～22 h。用質控菌株S.pneumoniaeATCC 49619做同步試驗，根據最新版美國臨床和實驗室標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的抗微生物藥物敏感性試驗執行標準進行結果判定。

1.4.2PFGE

1.4.2.1PFGE實驗參考中國疾病預防控制中心PulseNet China 網絡實驗室推薦的腦膜炎奈瑟菌PFGE標準操作方法對分離的38株腦膜炎奈瑟菌進行PFGE分型。實驗菌株選用NheI限制性內切酶酶切,200 μL 體系,酶切3 h。Marker沙門菌H9812標準菌株選擇XbaⅠ限制性內切酶酶切,其余參數與受試菌株相同。電泳條件： initial pulse：1 s； final pulse： 25 s；電壓：6 V/cm；電泳時間：16 h；溫度：14 ℃。電泳結束后，將膠塊放入1 μg/mL的EB液中染色30 min，清水脫色1 h后，凝膠成像系統Gel Doc XR下觀察結果。

1.4.2.2聚類分析PFGE圖像導入Bio Numerics(version 6.0,Applied Maths,Inc)軟件包進行處理，選擇Dice相關系數和UPGMA方法，條帶位置差異容許度tolerance設置為1.5%。

2　結　果

2.1藥敏試驗15(39.5%)株菌對青霉素不敏感，18(47.4%)株菌對氨芐西林不敏感，25(65.8%)株菌對環丙沙星耐藥，23(60.5%)株菌對左氧氟沙星耐藥，11(28.9%)株菌對復方新諾明不敏感，所有菌株對美羅培南、氯霉素、阿奇霉素、利福平、米諾環素、頭孢噻肟、頭孢曲松7種藥物均敏感，敏感率為100.00%。

2.2PFGE

2.2.1PFGE分型38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株用NheI 限制性內切酶酶切后進行脈沖場凝膠電泳，可得到大小從20～1 200 kb的電泳片段，不同的菌株條帶數從4～12條不等。部分C群腦膜炎奈瑟菌菌株PFGE酶切指紋圖譜(見圖1)。

M: Salmonella reference strain H9812, lane2-14 serogroup C Neisseria meningitidis strains.圖1　C群腦膜炎奈瑟菌PFGE酶切電泳圖譜(Nhe I限制性內切酶)Fig.1　PFGE profile of serotype serogroup C Neisseria meningitidis strains digested with Nhe I

2.2.2聚類分析對38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株的PFGE結果用Bio Numerics軟件進行聚類分析，按照100%的相似度，38株C群腦膜炎奈瑟菌菌株可分為5個不同的PFGE型別，不同菌株的相似系數在52.1%～100%之間，命名參照中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所呼吸道傳染病室的命名方式命名，38株菌株PFGE型別分別為AH1型13株，AH2型22株， AH44型、AH45型、AH46型個1株，如圖2。

圖2　江西省C群Nm菌株PFGE聚類分析Fig.2　Cluster analysis of serogeuop C strains by PFGE in Jiangxi Province

3　討　論

抗生素在控制各種細菌性感染、防治傳染病、降低病死率方面發揮了十分重要的作用，成為目前臨床使用最多的藥物。但是，隨著抗生素的廣泛應用，Nm 菌株的耐藥現象逐漸凸顯出來，由于Nm菌群結構的改變[1-2]，其耐藥的模式也越來越復雜。因此，對Nm菌株進行抗生素耐藥性檢測和監測以及菌群分型，為流腦的臨床治療用藥和預防性服藥提供實驗室的重要依據是非常有必要的。由于腦膜炎奈瑟氏菌的PFGE分析已經被接受為 PulseNet 一種必不可少的部分[3]。所以本研究根據PulseNet China標準試驗方案和臨床實驗室標準化研究所(CLSI) 推薦標準[4]，采用E-test 濃度梯度擴散法，對我省近幾年的流腦患者及健康攜帶者分離的38株Nm 菌株，進行了抗生素體外敏感性實驗和PFGE分子分型，以觀察我省近年C群Nm菌株耐藥譜的變化趨勢以及耐藥菌株PFGE分子分型的特點。

我國其他地區的Nm 菌株的藥敏監測結果顯示[5]，對青霉素類不敏感的菌株也在逐漸增多，雖然對青霉素的敏感性已經降低，但未出現耐藥菌株，而本次研究我省38株Nm 菌株有8株對青霉素耐藥，耐藥率達21.1%，PFGE分子分型主要是AH2型, 對氨芐西林不敏感的有18株，占47.4%，PFGE分子分型同樣是AH2型菌株。我國Nm 菌株的環丙沙星耐藥率明顯高于其他國家，分子分型和相關基因測序結果顯示，高的耐藥率與我國流行的克隆群緊密相關[6-10]。本次研究有25株Nm 菌株對環丙沙星耐藥，耐藥率達65.8%，PFGE分子分型為AH2型15株，AH1型8株，AH45、AH46各1株。同時23株Nm 菌株對左氧氟沙星耐藥，耐藥率為60.5%，PFGE分子分型為AH2型17株，AH1型5株，AH45 1株。雖然喹諾酮類藥物并不是臨床首選的治療流腦用藥，但這可能與臨床上廣泛用喹諾酮類藥物治療其他感染有關。本研究發現28.9%的菌株對復方新諾明不敏感，主要菌型為AH2型。38株Nm 菌株對美羅培南、氯霉素、阿奇霉素、利福平、米諾環素、頭孢噻肟、頭孢曲松7種藥物的敏感率均為100.00%，這與我國其他地區分離菌株一致[11-12]。根據PFGE分型圖譜和藥敏結果分析顯示江西省2006-2010年分離到的C群Nm菌株對抗生素耐藥和不敏感主要以AH2型為主。對菌株耐藥和不敏感的抗生素主要是青霉素類、喹諾酮類和磺胺類藥物，所以在流腦治療和預防中對青霉素、喹諾酮類和磺胺類藥物應謹慎使用。

從本研究中的PFGE酶切圖譜和聚類分析可以發現江西省C群Nm菌株主要為AH1和AH2型，這和我國C群流腦流行的主要型別一致。根據流行病學資料顯示江西省2006-2010年在同一地區分離的C群Nm菌株PFGE酶切圖譜帶型較為一致，同一地區同一帶型在不同年份能夠連續出現，不同地區分離菌株間相似性系數從52.1%～100%不等，并且病人分離菌株與其密切接觸者分離菌株帶型相似度達100%。根據本研究顯示我省近年分離到的C群Nm菌株分子分型特點雖然呈現多態性，但是以AH1和AH2型為優勢克隆型，同一地區優勢克隆型較為一致，不同地區優勢克隆型不同，但隨著不同地區的交往和人口流動可能會引起不同地區不同菌型的交叉傳播，應引起重視。

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Drug susceptibility testing and PFGE typing ofNeisseriameningitidesserogroup C strains isolated in Jiangxi Province, China

XIONG Chang-hui, YANG Meng, LIU Xiao-qin, XU Xiao-qian, WANG Peng, YUAN Hui

(JiangxiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanchang330029,China)

The study was conducted to evaluate the altering patterns of antibacterial drug sensitivity and PFGE typing ofNeisseriameningitidisserogroup C strains isolated in Jiangxi Province. Isolates were subjected to a drug susceptibility test using the E-test method and Pulsed-Field Gel Electrophoresis was used to characteristics of molecules. All of the 38 strains were sensitive to chloramphenicol, meropenem, azithromycin, minocycline, cefotaxime, ceftriaxone and rifampicin; 15(39.5%) strains were not sensitive to penicillin, 18(47.4%) strains were not sensitive to ampicillin and 11 (28.9%) were not sensitive to trimethoprim sulfamethoxazole; 25(65.8%) strains were resistant to ciprofloxacin and 23(60.5%) strains were resistant to levofloxacin; PFGE belt type prompt AH1 and AH2 type in the majority. TheNeisseriameningitidisserogroup C strains were highly resistant to quinolones, while showed lower resistance to sulfonamides and penicillin isolated in Jiangxi Province. AH1 and AH2 is the main type with the gene polymorphism analysis.

Neisseriameningitidis; molecular typing; drug susceptibility test; PFGE

Supported by the Science and Technology Program of Health and Family Planning Commission of Jiangxi Province (No. 20156029)

Yuan Hui, Email: jxcdcyuanhui@126.com

袁輝， Email：jxcdcyuanhui@126.com

江西省疾病預防控制中心傳染病所，南昌330029

R378.1

C

1002-2694(2016)07-0679-04

2016-02-23;

2016-06-21

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.018

江西省衛生計生委科技計劃(No.20156029)