顆粒型厭氧生物膜改善高氫分壓下丙酸降解抑制研究

徐 恒,汪翠萍,顏 錕,孟 堯,劉曉吉,王凱軍

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顆粒型厭氧生物膜改善高氫分壓下丙酸降解抑制研究

徐 恒,,顏 錕,孟 堯,劉曉吉,王凱軍*

(清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院環(huán)境模擬與污染控制國家重點聯(lián)合實驗室,北京 100084)

為了改善氫輔助型原位沼氣提純系統(tǒng)中高氫分壓對丙酸降解的抑制, 考察了不同顆粒型厭氧生物膜(有無載體、導(dǎo)電和非導(dǎo)電載體) 培養(yǎng)初期和末期的丙酸降解性能;并通過微生物形態(tài)和群落分析,探討了顆粒型生物膜丙酸降解機制.結(jié)果表明,導(dǎo)電碳氈厭氧生物膜和厭氧顆粒污泥能有效改善高氫分壓下丙酸降解抑制問題.其最大丙酸降解速率分別達到2.2,1.2mmol/(L×h).碳氈厭氧生物膜可能主要通過產(chǎn)酸細菌(、、屬)和產(chǎn)甲烷古菌(屬)的電子直接傳遞(DIET)途徑實現(xiàn)丙酸的降解;而厭氧顆粒污泥降解丙酸的途徑可能主要依靠產(chǎn)酸細菌(屬)與嗜氫型甲烷菌(、屬)的共生營養(yǎng)代謝過程.

顆粒型生物膜；導(dǎo)電載體；高氫分壓；丙酸降解；厭氧顆粒污泥

近年來,生物法沼氣提純技術(shù)引起廣泛關(guān)注,相比于傳統(tǒng)的物化法提純技術(shù)(高壓水洗、變壓吸附和膜分離等),生物法具有操作簡單,條件溫和以及無副產(chǎn)物產(chǎn)生等優(yōu)點[1-3].其中重要的一種工藝是借助外部氫源(H2),包括可再生電能電解水產(chǎn)生的氫氣和生物質(zhì)合成氣、焦爐氣等富含氫氣的低品位燃氣等,強化微生物嗜氫甲烷化過程(4H2+CO2=CH4+2H2O),以實現(xiàn)沼氣中CO2的去除和CH4的富集[4-7].根據(jù)外部氫源是否直接引入到厭氧消化反應(yīng)器中,該工藝可細分為原位沼氣提純和異位沼氣提純2種類型.原位沼氣提純較異位而言,具有占地小、投資運行成本低等優(yōu)點.然而,根據(jù)經(jīng)典的熱力學(xué)理論分析和種間氫傳遞機制可知[8-9],氫分壓對酸化產(chǎn)物(主要包括丙

酸和丁酸等)的進一步降解起著決定作用.例如,對丙酸而言,只有通過嗜氫微生物將氫分壓控制在0.1~10.1Pa以下,丙酸的厭氧降解才具有熱力學(xué)上的可行性.從這個角度而言,原位沼氣提純中直接供氫導(dǎo)致的高氫分壓,會對厭氧消化過程丙酸、丁酸等降解產(chǎn)生抑制,進而影響整個厭氧系統(tǒng)性能.因此,改善高氫分壓對丙酸等厭氧酸化產(chǎn)物降解的抑制是實現(xiàn)高效原位沼氣提純的技術(shù)難點之一.

與絮狀的厭氧污泥不同,顆粒型厭氧生物膜(包括微生物自固定化形成的厭氧顆粒污泥[10]和以無機顆粒為載體所形成的厭氧生物膜[12]兩種)的多孔結(jié)構(gòu)特征使得溶解氫在其內(nèi)部傳遞時存在一定的濃度梯度[13].也就是說,即使厭氧反應(yīng)器內(nèi)存在較高的氫分壓,顆粒型厭氧生物膜內(nèi)部的微生物所處的微環(huán)境中的氫濃度可能仍然滿足上述熱力學(xué)理論要求.此外,最新研究[14-15]表明,厭氧消化過程中除種間氫傳遞機制外,直接種間電子傳遞(DIET)機制同樣存在,而且可以通過添加導(dǎo)電物質(zhì)得以強化.DIET途徑降解丙酸、丁酸等酸化產(chǎn)物可有效地規(guī)避氫分壓帶來的熱力學(xué)限制.

因此,本研究擬考察并對比不同顆粒型厭氧生物膜(有無載體、導(dǎo)電和非導(dǎo)電載體)對丙酸的降解性能,探討其改善原位沼氣提純中高氫分壓引起的丙酸降解抑制問題的可行性和作用機制,為實現(xiàn)高效原位沼氣提純和可再生氫能、低品位燃氣的同步利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 顆粒載體及接種污泥

本研究采用的導(dǎo)電顆粒為微生物實驗中常用載體:碳氈顆粒和顆?；钚蕴?同時選用不導(dǎo)電顆粒—沸石作為對照.此外,厭氧顆粒污泥作為一種典型的通過微生物自固定化而形成的顆粒型生物膜,被廣泛用于廢水厭氧處理,因此,除以上述3種無機顆粒為載體的顆粒型厭氧生物膜外,本研究同時考察無載體的厭氧顆粒污泥在高氫分壓條件下對丙酸的降解特性.培養(yǎng)顆粒型厭氧生物膜所用的絮狀厭氧污泥取自本實驗室處理果蔬垃圾且運行穩(wěn)定的厭氧反應(yīng)裝置.厭氧顆粒污泥取自某淀粉廠處理淀粉廢水的EGSB反應(yīng)裝置,取回的厭氧顆粒污泥首先以葡萄糖為基質(zhì),在有機負荷為2g/(L×d)的條件下培養(yǎng)數(shù)月后,才用于本實驗研究.顆粒型厭氧生物膜的具體參數(shù)如表1所示.

1.2 實驗方法

實驗基本參數(shù)如表1所示,采用間歇實驗?zāi)Ｊ?每種顆粒型厭氧生物膜都設(shè)置2個平行.

1.2.1 接種及預(yù)培養(yǎng) 首先在厭氧工作站(DG250,英國DWS)內(nèi)將污泥和無機顆粒載體裝入150mL厭氧瓶中,并添加厭氧培養(yǎng)液[16]至有效容積50mL.考慮到碳氈、活性炭和沸石尺寸及容重不同,為了保證所用載體間的可比性,實驗投加不同量的載體以保持各種載體的總?cè)莘e大小一致(表1).接種完成后,向厭氧瓶中加入1g/L葡萄糖,預(yù)培養(yǎng)48h至反應(yīng)完全.

表1 顆粒型厭氧生物膜及實驗運行參數(shù)Table 1 Parameters of granule based biofilm and experiment operation

1.2.2 生物膜培養(yǎng)初期丙酸降解性能測試 預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后,每個厭氧瓶通入H2/CO2混合氣 (80%/ 20%)并吹脫15min,加壓至20kPa(表壓)左右停止供氣.然后通過1mL注射器注入0.5mL 1mol/L丙酸鈉儲存液(pH=6.5),使得厭氧瓶內(nèi)丙酸濃度為10mmol/L左右.最后將所有厭氧瓶放入35℃恒溫室內(nèi)振蕩培養(yǎng)(150r/min),并分別于0,2,4,8,20,24h時間點取樣測試H2分壓和丙酸濃度.

1.2.3 長期馴化培養(yǎng) 碳氈、活性炭和沸石3種載體生物膜的馴化期分為3個階段.P1 (0~30d)時,每天向厭氧瓶內(nèi)補充H2/CO2混合氣,并加壓至20kPa,然后將厭氧瓶放入35℃恒溫室內(nèi)振蕩培養(yǎng)(150r/min),直至丙酸降解完全,即置換50%的厭氧培養(yǎng)液,注入0.5mL 1mol/L丙酸鈉儲存液,進入下一周期;階段P2 (30~60d)時,每天向厭氧瓶內(nèi)通入H2/CO2混合氣并吹脫15min,加壓至20kPa,并補充10mmol/L丙酸,同時每4天置換100%的厭氧培養(yǎng)液;階段P3 (60~90d)時,置換液周期從4d縮短為2d,其他實驗操作與P2的一致.對于厭氧顆粒污泥而言,考慮到其本身已是完好的顆粒型厭氧生物膜,采用的馴化培養(yǎng)模式與上述P2階段一致.

1.2.4 生物膜培養(yǎng)末期丙酸降解性能測試 末期性能測試方法與初期時一致.

1.3 分析方法

H2含量(%):利用儀(Agilent, 7890A)測定.有4.6m×3.2mm不銹鋼Carboxen-1000(60/80目)填充柱.氬氣作為載氣,其流速為30mL/min,保持7min.其他運行參數(shù)包括:進樣口溫度(150℃)、TCD檢測器溫度(250 ℃)、柱溫(150℃),本文中H2含量(%)均在標況下?lián)Q算成H2分壓進行表示.

丙酸濃度(mmol/L):利用高效液相色譜儀(Shimadzu)測定.液相色譜儀配備有UV檢測器(210nm)和Aminex HP-87H 色譜柱 (Bio-Rad, Hercules, CA).流動相為0.005mol/L H2SO4,流速為0.5mL/min.

微生物形態(tài):顆粒型厭氧生物膜優(yōu)勢微生物形態(tài)通過環(huán)境掃描電鏡(SEM, Quantn 200, FEI Ltd.)進行觀察.掃描電鏡樣品制備方法包括以下步驟, (1)固定,2.5%戊二醛4℃固定過夜后,PBS漂洗3次;(2)脫水,30%~50%~70%~85%~95%乙醇梯度脫水,各1次(15min/次),100%乙醇脫水3次,15min/次;(3)二氧化碳臨界點干燥(BAL-TEC CPD030);(4)噴金--離子濺射儀(BAL-TEC SCD005).

微生物群落分析:采用OMEGA土壤提取試劑盒提取顆粒型厭氧生物膜基因組DNA,具體方法參照試劑盒說明書.細菌PCR擴增采用341f (5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3')和805r (5'- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3')引物.古菌采用巢式PCR擴增方法,第1輪引物為340f (5'- CCCTAYGGGGYGCASCAG-3')和1000r (5'- GGCCATGCACYWCYTCTC-3'),第2輪引物為349r (5'-GYGCASCAGKCGMGAAW-3')和806f (5'-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3').PCR結(jié)束后,PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳,對DNA進行回收.利用Qubit2.0DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量,以方便按照1:1的等量混合后測序.最后使用Illumina MiSeq 高通量測序平臺進行基因測序.

2 結(jié)果與討論

2.1 生物膜培養(yǎng)初期及末期高氫分壓下丙酸降解性能

為了探討不同類型顆粒型厭氧生物膜高氫分壓下丙酸降解可行性,本研究在生物膜培養(yǎng)實驗初期和末期通過間歇實驗分別對其各自嗜氫和丙酸降解性能進行測試和對比,結(jié)果如1和圖2所示.

如圖1A所示,4組厭氧瓶在0~8h時段內(nèi)的嗜氫性能最高.碳氈、活性炭和沸石3組的嗜氫性能比較接近,最高嗜氫速率分別為7.8,8.2, 7.7kPa/h,明顯高于顆粒污泥的最高嗜氫速率().這可能與作用污泥的形態(tài)有關(guān).根據(jù)亨利定律可知,液相中溶解氫濃度跟氫分壓成正比,0~8h時厭氧瓶內(nèi)氫分壓較高,因而溶解氫濃度也較高.厭氧瓶中碳氈、活性炭和沸石顆粒型生物還未形成,起主要作用的是初始接種的絮狀厭氧污泥.絮狀污泥對溶解氫的傳質(zhì)限制明顯低于顆粒污泥[10,13].因此,絮狀的厭氧微生物可以直接利用高濃度的溶解氫;而顆粒污泥內(nèi)部的厭氧微生物因受傳質(zhì)限制影響,只能利用低濃度的溶解氫,在培養(yǎng)初期,厭氧微生物嗜氫能力未得到強化的情況下,溶解氫的傳質(zhì)限制可能是導(dǎo)致顆粒污泥嗜氫速率偏低的重要原因.在8~24h內(nèi),4組厭氧瓶的嗜氫性能逐漸降低,這可能是因為厭氧瓶內(nèi)氫分壓和液相中溶解氫濃度逐步降低的緣故.

從圖1B可以看出,4組厭氧瓶丙酸降解情況與嗜氫性能變化趨勢相反.碳氈、活性炭和沸石3組厭氧瓶內(nèi)氫分壓降低較快,尤其在間歇實驗?zāi)┢?氫分壓接近0,但是丙酸的在降解率不到10%.起主要作用的絮狀污泥對溶解氫的傳質(zhì)限制非常低,導(dǎo)致厭氧微生物所處的微環(huán)境的氫濃度仍然偏高,無法滿足丙酸降解的熱力學(xué)要求,因而丙酸降解受到極大抑制.與此不同的是,顆粒污泥所在厭氧瓶內(nèi)的氫分壓一直較其他3組都高,且在間歇實驗結(jié)束時仍然剩余10kPa左右 (圖1A).但是,其丙酸濃度從實驗開始時便逐步降低,最大降解速率為0.4mmol/(L×h),總降解率達到85%左右.這可能主要由于受顆粒污泥傳質(zhì)限制以及顆粒污泥內(nèi)部各層微生物對溶解氫的逐級消耗影響,內(nèi)部丙酸降解微生物基本不受氫分壓所導(dǎo)致的熱力學(xué)降解抑制.為了驗證這一推論,需要在后續(xù)研究中構(gòu)建相應(yīng)的氫傳質(zhì)模型并計算得出顆粒污泥內(nèi)部氫分壓大小.從上面實驗結(jié)果可以看出,顆粒污泥因其本身顆粒層狀結(jié)構(gòu),相比于絮狀污泥更適合用于高氫分壓下丙酸等有機酸的降解.

經(jīng)過3個月左右的培養(yǎng)馴化,碳氈生物膜和顆粒污泥的嗜氫性能都得到明顯增強(圖2A),最高嗜氫速率分別達到15.0,11.7kPa/h,比培養(yǎng)初期的速率提高了近1倍.然而,活性炭和沸石生物膜的嗜氫性能明顯減弱,各自的最高嗜氫速率分別為4.3,4.9kPa/h.這表明活性炭和沸石2種顆粒載體生物膜中的嗜氫厭氧微生物較少,低于初始接種時絮狀污泥中的微生物量.碳氈載體生物膜的嗜氫性能最佳,說明碳氈顆粒的比表面積、內(nèi)部孔狀結(jié)構(gòu)等特性更能有效促進嗜氫厭氧微生物膜的形成.

由圖2B可知,碳氈生物膜的丙酸降解速率最快,其最大降解速率達到2.2mmol/(L×h);碳氈生物膜丙酸降解性能的跨越式提高,一方面可能與顆粒污泥類似,因為碳氈顆粒型結(jié)構(gòu)引起的溶解氫傳質(zhì)限制和生物膜整體嗜氫性能的增強,為丙酸降解微生物營造了極低氫濃度的微環(huán)境,有效改善了丙酸降解熱力學(xué)抑制;另一方面可能因為高氫分壓下丙酸降解的長期馴化,以及導(dǎo)電碳氈的引入強化了厭氧微生物DIET途徑,使得丙酸降解擺脫了氫分壓抑制.對于厭氧顆粒污泥,其最大降解速率為1.2mmol/(L×h),是培養(yǎng)初期時相應(yīng)數(shù)值的3倍左右.這可能主要跟其嗜氫性能的提高有關(guān).對于活性炭和沸石生物膜而言,雖然它們的嗜氫性能跟培養(yǎng)初期時相比明顯降低,它們的丙酸降解性能卻得到了明顯改善.這更能說明顆粒型結(jié)構(gòu)生物膜確實有效改善了高氫分壓下丙酸降解抑制.然而,可能是因為沸石生物膜和活性炭生物膜的生物量較少以及活性炭導(dǎo)電性弱于碳氈的緣故,它們的丙酸降解速率遠低于碳氈生物膜和顆粒污泥,這與嗜氫性能實驗結(jié)果一致.同時實驗過程中還發(fā)現(xiàn)活性炭出現(xiàn)磨損和破碎的現(xiàn)象,可能與采用的活性炭本身強度弱有關(guān).這也進一步解釋了活性炭生物膜嗜氫和丙酸降解性能較低的現(xiàn)象.

2.2 生物膜培養(yǎng)末期碳氈生物膜和顆粒污泥的微生物形態(tài)

從嗜氫和丙酸降解性能研究可知,碳氈生物膜和顆粒污泥是其中優(yōu)選的分別為有導(dǎo)電載體的和無載體的兩種顆粒型厭氧生物膜.如圖3A1、3A2所示,在生物膜培養(yǎng)末期,碳氈生物膜尺寸與原始空白碳氈差別不大.與空白碳氈對比可知,碳氈生物膜內(nèi)部富集了大量厭氧微生物網(wǎng)狀絮體. 這說明碳氈顆粒載體發(fā)達的孔隙結(jié)構(gòu)非常有利于微生物的截留和粘附;此外,從圖3A3中可以看出,碳氈表面也同樣富集了高密度的長桿狀和短桿狀微生物.厭氧微生物緊密粘附在碳氈表面更有利于它們通過導(dǎo)電碳氈實現(xiàn)電子直接傳遞.以上實驗結(jié)果在一定程度上佐證了碳氈生物膜改善丙酸降解抑制原因的推論.

如圖3B1所示,厭氧顆粒污泥經(jīng)過長期的馴化培養(yǎng),仍然保持完好的顆粒結(jié)構(gòu),其尺寸約為1.5~2mm.與碳氈生物膜相比,顆粒污泥表面(圖3B2)和內(nèi)部(圖3B3)的微生物形態(tài)更加豐富,除不同長度的桿狀微生物外,還有球狀微生物;而且顆粒污泥內(nèi)微生物的密集程度明顯高于碳氈生物膜.顆粒結(jié)構(gòu)中微生物密集程度越高,溶解氫的傳質(zhì)限制和消耗量越高,更有利于營造具有極低溶解氫濃度的微環(huán)境.從這個角度而言,顆粒污泥對丙酸的主要與其顆粒層狀且密實的微生物結(jié)構(gòu)有關(guān);而對于碳氈,顆粒型生物膜結(jié)構(gòu)和其較好的導(dǎo)電特性都可能有助于其丙酸降解性能的改善.

2.3 生物膜培養(yǎng)末期碳氈生物膜和顆粒污泥的微生物群落分析

如圖4A所示,碳氈生物膜中優(yōu)勢細菌屬主要包括(26.8%)、(22.6%)、(9.9%)等.根據(jù)相關(guān)文獻報道[17-19]可知,這3種優(yōu)勢細菌屬均不能通過與嗜氫菌共生營養(yǎng)來降低氫分壓,實現(xiàn)丙酸降解.顆粒污泥中的優(yōu)勢細菌主要包括屬(20.3%)和unclassified(29.2%)等.其中,屬被證實可以通過與嗜氫菌共生營養(yǎng)實現(xiàn)丙酸降解;則是一類半共生營養(yǎng)型細菌,跟碳氈生物膜內(nèi)優(yōu)勢細菌類似,目前證實不能通過與嗜氫菌共生營養(yǎng)降解利用丙酸[20].從圖4B可以看出,碳氈生物膜中優(yōu)勢古菌屬僅包括(47.9%)和(52.1%)2種;而顆粒污泥中古菌屬種類較多,優(yōu)勢菌群主要包括(29.1%)、(63.3%)和(5.8%)等.其中、和均是典型的嗜氫型甲烷菌[21-23].它們在顆粒污泥中的相對豐度明顯高于碳氈生物膜.而則是近期被證實可以參與DIET的一種重要的乙酸型甲烷菌[14].它在碳氈生物膜中的相對豐度明顯高于顆粒污泥.結(jié)合細菌屬水平分析結(jié)果可知,碳氈生物膜的作用機制可能主要通過產(chǎn)酸細菌和產(chǎn)甲烷古菌的電子直接傳遞(DIET)途徑實現(xiàn)丙酸的降解,有效避免了氫分壓的抑制.而對于顆粒污泥,產(chǎn)酸細菌與嗜氫型甲烷菌的共生營養(yǎng)可能是其降解丙酸的主要方式.同時由于顆粒污泥中同時含有半共生營養(yǎng)型細菌和具有DIET能力的甲烷菌(),而且也有文獻報道[24]稱,厭氧顆粒污泥本身具有一定導(dǎo)電性,這也為DIET途徑提供了必要條件,尤其在高氫分壓誘導(dǎo)下,DIET途徑可能得到進一步增強.因此不能排除其DIET降解丙酸的可能性,需要進一步實驗驗證.

3 結(jié)論

3.1 基于導(dǎo)電載體的顆粒型厭氧生物膜(碳氈生物膜)和無載體的顆粒型厭氧生物膜(厭氧顆粒污泥)能有效改善高氫分壓下丙酸降解抑制問題.其最高嗜氫速率分別達到15.0,11.7kPa/h,最大丙酸降解速率分別達到2.2,1.2mmol/(L×h).

3.2 碳氈內(nèi)部發(fā)達的孔隙結(jié)構(gòu)有利于厭氧生物膜的形成和生物量的截留,同時大量桿狀微生物緊密粘附在導(dǎo)電碳氈表面,有效促進了微生物間電子直接傳遞(DIET)過程;厭氧顆粒污泥中的微生物形態(tài)更加豐富,而且微生物密集程度較高,強化了顆粒污泥內(nèi)部的氫傳質(zhì)限制和溶解氫消耗,為產(chǎn)酸微生物降解丙酸營造了極低溶解氫的微環(huán)境.

3.3 結(jié)合微生物SEM和群落分析結(jié)果可知, 碳氈厭氧生物膜可能主要通過產(chǎn)酸細菌和產(chǎn)甲烷古菌的電子直接傳遞(DIET)途徑實現(xiàn)丙酸的降解;而產(chǎn)酸細菌與嗜氫型甲烷菌的共生營養(yǎng)可能是厭氧顆粒污泥降解丙酸的主要途徑.

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* 責(zé)任作者, 教授, wkj@tsinghua.edu.cn

Granule-based anaerobic biofilm enhances propionic acid degradation under high H2partial pressure

XU Heng, WANG Cui-Ping, YAN Kun, MENG Yao, LIU Xiao-Ji, WANG Kai-Jun*

(State Key Joint Laboratory of Environment Simulation and Pollution Control, School of Environment, Tsinghua University, Beijing 100084, China)., 2016,36(5)：1435~1441

Different types of granule-based anaerobic biofilm (with and without carriers; conductive and non-conductive carriers) were adopted to alleviate the inhibition of propionic acid degradation under high H2partial pressure. And their performance was monitored and compared, at the beginning and end of biofilm cultivation. Moreover, microbial SEM images and community composition were investigated to analyze mechanisms involved in propionic acid degradation. The results showed that both conductive carbon-felt based biofilm and anaerobic granules were effective at promoting propionic acid degradation under high H2partial pressure, with maximum rate of 2.2 and 1.2mmol/h respectively.seemed to be degraded mainly via direct interspecies electron transfer (DIET) between acidogenic bacteria (,,) and methanogens () for carbon-felt based biofilm. Nevertheless, degradation of propionic acid by anaerobic granules was possibly attributed to syntrophic operation of acidogenic bacteria () and methanogens (,).

granule-based biofilm；conductive carriers；high H2partial pressure；propionic acid degradation；anaerobic granules

X705

A

1000-6923(2016)05-1435-07

徐 恒(1988-),男,安徽安慶人,清華大學(xué)博士研究生,主要從事厭氧處理及沼氣提純技術(shù)研究.發(fā)表論文5篇.

2015-11-05

國家科技支撐計劃課題(2014BAC27B01);水體污染控制與治理科技重大專項(2012ZX07212-001)