己烯雌酚降解菌固定化條件優化及其降解性能

凌婉婷,徐冉芳,劉 娟,孫敏霞,李舜堯,朱雪竹,高彥征

?

己烯雌酚降解菌固定化條件優化及其降解性能

凌婉婷,徐冉芳,劉 娟,孫敏霞,李舜堯,朱雪竹,高彥征*

(南京農業大學土壤有機污染控制與修復研究所,江蘇 南京 210095)

以海藻酸鈉為包埋劑,制備了己烯雌酚(DES)降解菌株S(sp.)的固定化菌劑,通過正交試驗確定了菌株S的最佳固定化條件:海藻酸鈉質量分數為4%,菌懸液與海藻酸鈉重量比為1:2,CaCl2質量分數為4%,交聯時間為6h.菌株S的固定化菌劑比游離菌株更有優勢;7d時,固定化菌株S對無機鹽培養基中DES的去除率為83.84%,較游離菌株高22.84%.優化了固定化菌株S對溶液中DES的處理條件:固定化菌株S接入量為300g/L,初始底物濃度為20~40mg/L.固定化菌株S對DES濃度為40.01,37.90 ,33.52μg/L 3個排污口污水中DES的去除率分別達90.0%,96.0%,96.7%.利用固定化菌株處理實際污水中DES等雌激素具有應用潛力.

雌激素；己烯雌酚；固定化；降解；污水

世界各國很多水體中均發現不同程度的雌激素污染,這對人群健康和生態安全產生不良影響[1-2].我國長江,黃河流域水體中也有雌激素檢出.據報道,當水體中雌激素濃度為1ng/L時就會對魚類的內分泌系統產生干擾,造成雄魚雌性化現象[3-5].如何去除水體中雌激素已成為當前環境領域研究的熱點之一.

雌激素性質穩定,單純自然衰減無法消除雌激素污染,其殘存效應風險很大.利用功能微生物來高效降解雌激素受到關注.研究者從污泥,土壤等介質中分離獲得了多株雌激素降解菌[6-8].楊俊等[6]從制藥污泥中分離了1株高效降解17β-雌二醇(E2)的菌株sp.,在最佳實驗條件下,7d內該菌株可將初始濃度為0.5~50mg/L的17β-E2完全降解.Yoshimoto等[7]從污水處理廠活性污泥中分離了1株和3株,其中對雌激素具有強降解能力,24h內可將濃度為100mg/L的雌酮(E1),E2,雌三醇(E3)完全降解.從環境中篩選出具有雌激素降解性能的菌株,有望實現雌激素的高效降解.然而目前對于己烯雌酚(DES)降解菌的發現仍很少.

由于實際污水成分復雜,實驗室篩選的功能菌株往往因不適應環境造成活性抑制,與土著微生物競爭處于劣勢,且存在難以回用等問題,其應用受到限制[9].固定化微生物技術因具有生物密度大,耐環境沖擊,可回收利用,反應過程易于控制,處理效率高等優點,彌補了游離菌株的不足,目前已被應用于一些有機污染物的處理[10-11].微生物固定化技術是在固定化酶技術的基礎上發展起來的一種技術.海藻酸鈉常被用作微生物固定化的包埋劑[12-13].須指出,迄今仍少有利用固定化菌劑來處理水中DES等雌激素的相關報道.

本研究在前期分離得到1株能夠以DES為唯一碳源和能源的菌株S(sp.),在此基礎上以海藻酸鈉為包埋劑,采用正交試驗法,以固定化菌株對DES的去除效率為主要指標,確定了菌株固定化條件;分析了固定化菌株S對無機鹽培養基和實際污水中DES的去除性能.研究結果可為發展雌激素降解菌的固定化技術,治理雌激素污染等提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用DES降解菌株S分離自南京某污水處理站的活性污泥,經鑒定為沙雷氏菌屬(sp.)細菌[10].包埋劑選用海藻酸鈉,為化學純;交聯劑選用CaCl2,為分析純.DES購自上海阿拉丁試劑有限公司,純度>98%.C18為分析純.

LB培養基,無機鹽培養基(MS),DES降解培養基參考文獻[8].固體培養基加入2%的瓊脂.

1.2 菌株S固定化菌劑的制備

以海藻酸鈉質量分數(A),菌懸液與海藻酸鈉的重量比(B),CaCl2濃度(C)及交聯時間(D)為試驗因素,采用正交試驗法[12],設計4因子3水平的正交表(表1),以DES去除率為衡量指標來評價各固定化處理優劣.圖1為固定化微生物小球制備流程.制備固定化菌劑的方法:菌株S分別接種于LB培養基,搖床30℃,150r/min振蕩24h后,調600=1.0;將含菌株S的菌懸液按一定體積比混勻后,與海藻酸鈉以一定的菌膠比充分混勻,勻速滴入4℃的CaCl2溶液后,于4℃交聯一定時間,得到直徑為3~5mm的固定化顆粒.用無菌生理鹽水沖洗后使用.

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3 菌株S固定化菌劑對溶液中DES的去除

在DES濃度分別為20,40,60,80,100mg/L的無機鹽降解培養基中,按100,200,300,400,500g/L的接入量分別加入上述制備的各固定化降解菌劑,30℃,150r/min搖床培養0~7d后測定溶液中DES濃度,計算DES去除率.以接入相等菌量的游離菌劑的處理作為陽性對照,不接種微生物的空白小球的處理作為陰性對照.每個處理重復3 次.溶液中DES濃度測定采用整瓶提取培養基的方法[8].

1.4 菌株S固定化菌劑對污水中DES的去除

實際污水樣品采自南京市區內某湖泊的三個污水排水口.將采集的水樣1L經固相萃取柱富集濃縮(富集倍數500),經HPLC檢測發現,3個生活污水排水口處的湖水中均檢測到DES,濃度分別為40.01,37.90,33.52μg/L.

按海藻酸鈉質量分數4%,菌懸液與海藻酸鈉之比1:2,CaCl2濃度4%,交聯時間6h的固定化條件制備固定化降解菌株S菌劑.按300g/L的菌劑接種量,在1L污水樣中投入固定化降解菌株S菌劑,30℃,150r/min搖床振蕩培養7d后,測定水樣中DES含量,計算去除率.每個處理重復3次.

處理后的水樣以約為5~8mL/L的流速通過已分別用5.00mL甲醇和5.00mL超純水活化的裝填有C18的固相萃取柱萃取,用5.00mL超純水淋洗柱體并繼續抽吸3.0min,淋洗后的萃取柱用15.00mL甲醇洗脫,洗脫液收集至玻璃試管中.試管置于40℃的恒溫水浴并用氮氣吹干,然后加入50%甲醇水溶液將附著物重新溶解至2.00mL,過0.22μm孔徑濾膜后HPLC分析[8,14].

2 結果分析與討論

2.1 菌株S最佳固定化條件

按照前述正交試驗,制備了9種菌株S的固定化菌劑,研究了其對無機鹽培養基中DES的去除性能,以去除率為指標評價了菌株S最佳固定條件.從圖2可見,4個因子均顯著影響溶液中DES的去除.利用正交試驗的直觀分析法,對其結果進行解析,得出4個因子對DES去除的影響大小順序是:海藻酸鈉濃度>菌懸液與海藻酸鈉重量比>CaCl2濃度>交聯時間.根據無機鹽培養基中DES的去除率,選用菌株S的最佳固定化條件為:海藻酸鈉濃度4%,菌懸液與海藻酸鈉之比為1:2,CaCl2濃度為4%,交聯時間為6h.該條件下制備的固定化菌劑形貌如圖3所示.固定化菌株S呈球形,直徑約為3~5mm.實驗中也發現,海藻酸鈉濃度為3~4%時,易成球;若海藻酸鈉濃度為5%時,則易發生拖尾現象,成球較困難;段海明等[15]用海藻酸鈉固定化細菌時發現類似現象.

2.2 菌株S固定化菌劑對溶液中DES的去除

2.2.1 固定化菌與游離菌去除DES的比較 以DES為唯一碳源,研究了菌株S的固定化菌劑和游離菌株對溶液中DES的去除作用,溶液中DES的起始濃度為50mg/L,游離菌株接入量與固定化菌劑中菌株接入量相同.由圖4可見,供試時間內(0~7d),固定化菌劑對無機鹽培養液中DES的去除率均顯著地高于游離態菌株S.1d時,游離態菌劑對溶液中DES沒有去除作用,這是因為開始階段(0~1d)DES對游離態菌株的生長和活性產生一定抑制.1d時,固定化菌劑則去除了溶液中9.18%的DES,且與無菌株空白小球的去除率無顯著差異,這表明,0~1d時固定化菌劑對溶液中DES去除主要依賴于海藻酸鈣凝膠小球對溶液中DES的吸附作用.隨著處理時間延長(1~7d),固定化菌劑和游離菌株處理的溶液中DES殘留濃度均降低,去除率則不斷升高;經7d處理后,固定化菌劑和游離態菌劑對溶液中DES的去除率分別達83.84%和68.25%,且遠遠大于無菌株空白小球的去除率.1~7d,無菌株空白小球對溶液中DES的去除率基本恒定,表明海藻酸鈣凝膠小球對DES的吸附在1d時已達到飽和.

從去除機制來看,菌株S固定化菌劑對無機鹽培養液中DES的去除主要包含兩種作用,一是固定化小球(海藻酸鈣)自身吸附DES,這可以從無菌空白小球對DES的去除得到證明,二是固定化小球中菌株S降解DES[9,16].0~1d時,固定化菌劑和無菌空白小球的處理能力一致,表明此時固定化菌劑對溶液中DES的去除主要歸因海藻酸鈣的吸附作用;1~7d,固定化菌劑去除溶液中DES性能不斷提高,且與無菌空白小球的去除率間差距增大,而無菌空白小球的去除率則在1~7d保持不變,說明隨著時間延長(1~7d),固定化菌劑對溶液中DES的去除從海藻酸鈣吸附為主演變為固定化菌株S的降解為主;7d時,無菌空白小球處理的去除率僅為15.58%,而固定化菌劑處理的去除率則為83.84%,吸附機制所占貢獻為15.58%,而菌株S降解則貢獻了68.26%.

菌株S固定化菌劑比游離菌株有更好的處理效果,這一方面是因為形成固定化菌劑的海藻酸鈣凝膠小球內部呈多孔道結構,對DES具有吸附作用,另一方面,固定化載體對菌株起到了保護作用,同時增加了菌體與DES的接觸機會.DES在由固定化載體表面擴散至載體內部過程中,生長在載體孔道表層的菌落形成了一層保護屏障,增強了菌株抵抗能力,從而使得菌株能更好地生長和增殖[9,13],而游離菌株S在溶液中易受到DES毒害,生長受到抑制[17-18],故其降解DES的效率較低.

2.2.2 固定化菌劑接入量的影響 研究了固定化菌劑接入量對無機鹽培養液中DES去除的影響,結果見圖5.隨著固定化降解菌接入量由0增大至300g/L,溶液中DES去除率顯著增大;菌劑接入量為300g/L時,固定化降解菌對溶液中DES的降解率達85.2%.但當菌劑接入量繼續增大(由300g/L增大至500g/L),溶液中DES去除率無顯著提高.因此,固定化降解菌籍最適接入量為300g/L,該接入量既能保證溶液中DES較好的去除效果,也減少了固定化降解菌的使用量,從而可降低實際應用的原料成本.試驗過程中,當固定化降解菌接入量較大時,降解體系較混濁,這可能是因為固定化降解菌以DES為碳源和能源物質,接入量較大時,細胞因缺乏足夠營養而活性較低,出現了菌體自溶死亡現象,死亡的細胞物質滲出造成培養基濁度增加[15].

2.2.3 DES初始濃度的影響 圖6為DES初始底物濃度對固定化降解菌去除溶液中DES性能的影響.當DES濃度較低時(20mg/L和40mg/L),固定化降解菌對無機鹽培養液中DES的去除率較高,分別為86.8%和86.2%.隨著底物濃度升高(20到100mg/L),固定化降解菌對DES的去除率下降.表明高濃度DES對菌株生長產生抑制作用,進而使得DES去除率減小.在實際使用中,應適時檢測環境中DES的實際污染濃度,據此來進一步科學地確定固定化降解菌劑的使用量,進而節約成本并提高處理效能.

2.3 菌株S固定化菌劑對實際污水中DES的去除

固定化菌株S對實際污水中DES去除見圖7,3個污水排水口處湖水中DES濃度分別為40.01,37.90,33.52μg/L.經固定化菌劑處理后,排水口1,排水口2,排水口3水樣中DES去除率分別為90.0%,96.0%,96.7%.固定化降解菌株對實際污水中DES有較好的去除效果(去除率90.0%以上),可能是因為實際污水中DES濃度較低,且固定化載體對菌株具有一定的保護效果,菌株受到外界環境的毒害作用很小,故而表現出較好的降解效果.

本研究中固定化菌劑包菌量偏低,海藻酸鈣吸附能力也不強,導致了處理無機鹽培養液和污水中DES時菌劑投加量偏多,該問題仍需要進一步針對性地完善.研究結果表明,構建雌激素固定化菌劑,可高效地去除水中DES.固定化后菌株具有相對封閉和穩定的空間,能保證細菌正常代謝,屏蔽外界土著微生物惡性競爭,防止噬菌體吞噬等[8].固定化菌劑在治理污水中DES等雌激素方面有一定可行性和優越性,可為無害化處理污水中雌激素提供新思路和基礎依據.

3 結論

3.1 以海藻酸鈉為包埋劑,制備了菌株S的固定化菌劑,通過正交試驗確定了菌株S最佳固定化條件:海藻酸鈉質量分數為4%,菌懸液與海藻酸鈉重量比為1:2,CaCl2濃度為4%,交聯時間為6h.

3.2 菌株S的固定化菌劑比游離菌株更有優勢.7d時,固定化菌株S對無機鹽培養基中DES的去除率為83.84%,較游離菌株高22.84%.優化了菌株S的固定化菌劑對溶液中DES的處理條件:固定化菌劑接入量300g/L,初始底物濃度20~ 40mg/L.

3.3 菌株S的固定化菌劑對DES濃度為40.01, 37.90 ,33.52μg/L 3個排污口污水中DES去除率分別達90.0%,96.0%,96.7%;利用固定化菌株處理污水中雌激素具有應用潛力.

[1] 付銀杰,凌婉婷,董長勛,等.應用UE-SPE-HPLC/FLD法檢測養殖業畜禽糞便中雌激素 [J]. 應用生態學報, 2013,24(11): 3280-3288.

[2] Lange I G, Daxenberger A, Schiffer B, et al. Sex hormones originating from different livestock production systems: fate and potential disrupting activity in the environment [J]. Analytica Chimica Acta, 2002,473(1/2):27-37.

[3] Purdom C E, Hardiman P A, Bye V V J, et al. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works [J]. Chemistry and Ecology, 1994,8(4):275-285.

[4] Kuch H M, Ballschmiter K. Determination of endocrine- disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range [J]. Environmental Science and Technology, 2001,35(15): 3201-3206.

[5] Johnson A C, Williams R J. A model to estimate influent and effluent concentrations of estradiol, estrone, and ethinylestradiol at sewage treatment works [J]. Environmental Science & Technology, 2004,38(13):3649-3658.

[6] 楊 俊,姜理英,陳建孟.1株17β-雌二醇高效降解菌的分離鑒定及降解特性 [J]. 環境科學, 2010,31(5):1313-1319.

[7] Yoshimoto T., Nagai F., Fujimoto J., et al. Degradation of estrogens by Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolates from activated sludge in wastewater treatment plants [J]. Applied Environmental Microbiology, 2004,70(9):5283-5289.

[8] 李 欣,凌婉婷,劉靜嫻,等.固定化菌劑對污水和牛糞中雌二醇和己烯雌酚的去除作用 [J]. 環境科學, 2015,36(7):2581-2590.

[9] 李 婷,任 源,韋朝海.固定化的PVA-SA-PHB-AC復合載體制備及間甲酚的降解 [J]. 環境科學, 2013,34(7):2899-2905.

[10] 徐冉芳,孫敏霞,劉 娟,等.己烯雌酚降解菌株沙雷氏菌的分離鑒定及其降解特性 [J]. 環境科學, 2014,35(8):3169-3174.

[11] Covarrubias S, de-Bashan L, Moreno M, et al. Alginate beads provide a beneficial physical barrier against native microorganisms in wastewater treated with immobilized bacteria and microalgae [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012,93(6):2669-2680.

[12] 吳曉磊,劉建廣,黃 霞,等.海藻酸鈉和聚乙烯醇作為固定化微生物包埋劑的研究 [J]. 環境科學, 1993,14(2):28-31,77.

[13] Covarrubias S A, de-Bashan L E, Moreno M, et al. Alginate beads provide a beneficial physical barrier against native microorganisms in wastewater treated with immobilized bacteria and microalgae [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012,93(6):2669-2680.

[14] 付銀杰,高彥征,董長勛,等.SPE-HPLC/FLD法同時測定水中4種雌激素 [J]. 農業環境科學學報, 2012,31(11):2296-2303.

[15] 段海明.海藻酸鈉固定化細菌對毒死蜱的降解特性 [J]. 中國生態農業學報, 2012,20(12):1636-1642.

[16] Hou D, Shen X, Luo Q, et al. Enhancement of the diesel oil degradation ability of a marine bacterial strain by immobilization on a novel compound carrier material [J]. Marine Pollution Bulletin, 2013,67(1/2):146-151.

[17] 鄭邦乾,方治華.固定微生物用聚合物多孔載體的研究 [J]. 高分子材料科學與工程, 1995,11(3):112-117.

[18] 顧麗鵬,何 歡,胥志祥,等.可溶性有機質生物改性介導17β-雌二醇生物降解作用 [J]. 中國環境科學, 2016,36(2):468-475.

* 責任作者, 教授, gaoyanzheng@njau.edu.cn

Immobilization and degradation performance of diethylstilbestrol-degrading bacteria S (sp.)

LING Wan-ting, XU Ran-fang, LIU Juan, SUN Min-xia, LI Shun-yao, ZHU Xue-zhu, GAO Yan-zheng*

(Institute of Organic Contaminant Control and Soil Remediation, College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)., 2016,36(5)：1514~1519

Diethylstilbestrol (DES)-degrading bacteria S (sp.) was immobilized using sodium alginate as the embedding agent. The optimum immobilization conditions, determined through orthogonal test, were as follows: 4% sodium alginate, bacteria: sodium alginate 1:2, 4% CaCl2and 6h crosslinking time. The DES degradation performance of immobilized strain S was apparently superior to that of free strain. The degradation ratio of DES by immobilized strain S was 83.84%, which was 22.84% higher than that by free strain S under laboratory culture conditions. The optimum inoculation of immobilized strain S was 300g/L, and the optimum initial DES concentration was 20~40mg/L. Three water samples were collected from sewage outfalls with DES concentrations of 40.01, 37.90 and 33.52μg/L, respectively. Immobilized strain S was added to these water samples, and 90.0%, 96.0% and 96.7% of DES were removed by immobilized strain S after 7d. Results of this investigation provide a new available technique for estrogen removal from polluted water systems.

estrogen；diethylstilbestrol；immobilization；degradation；sewage

X703.5

A

1000-6923(2016)05-1514-06

凌婉婷(1976-),女,貴州遵義人,教授,博士,主要研究方向為農業環境污染控制.發表論文80余篇.

2015-11-16

國家自然科學基金(51278252,21477056);江蘇省環保科研課題(2015023);江蘇省重點研發計劃(社會發展)項目(BE2015682)