豬藍耳病毒感染的實驗室診斷

張平，馬惠琴，龍冬梅，賀志昊，王蕓華，楊廷軍（貴州省畢節市動物疫病預防控制中心，貴州畢節551700）

豬藍耳病毒感染的實驗室診斷

張平，馬惠琴，龍冬梅，賀志昊，王蕓華，楊廷軍
（貴州省畢節市動物疫病預防控制中心，貴州畢節551700）

2015年8月,畢節市某豬場發生一起以發病豬體溫升高、母豬流產、仔豬高死亡率為特點的傳染病。當地獸醫根據臨床癥狀指導用了大量的藥物治療，但效果不佳。通過流行病學調查、臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍耳病,為確診病原,對病死豬的組織進行了實驗室檢測。通過R T-PCR試驗檢測，確診為高致病性豬藍耳病毒陽性。

豬藍耳病病毒；實驗室檢測；實時熒光R T-PCR

高致病性豬藍耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）變異毒株引起的一種急性、高傳染性、高致病性的疫病，目前已成為危害全球養豬業的主要疫病之一。豬藍耳病病毒于2005年發生變異后引起高致病性豬藍耳病，發病率、致死率均顯著增高。世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告疫病，我國列為二類動物疫病。由于最先在歐洲的臨床病例出現特有的豬的耳朵藍灰色病變，我國學者、飼養人員和臨床獸醫將其簡稱為豬藍耳病或藍耳病[1-5]。該病有美洲株和歐洲株兩大類型，美洲株最早在美國發現，20世紀90年代后傳入我國。2015年8月,畢節市某豬場發生一起以發病豬體溫升高、母豬流產、仔豬高死亡率為特點的傳染病。當地獸醫根據臨床癥狀指導用了大量的藥物治療，但效果不佳。通過臨床癥狀、剖檢病變,初步診斷為疑似高致病性豬藍耳病,綜合流行病學信息、臨床表現及剖檢病變懷疑為豬藍耳病病毒或豬瘟病毒感染，也可能為二者混合感染，為對該病例作出確切性診斷，特進行實驗室檢測。對畢節某規模豬場出現的妊娠母豬流產、產死胎及部分仔豬發病的情況,為確診病原，本文利用實驗室實時熒光RT-PCR診斷技術，最終確診為豬偽狂犬病毒感染引起。

一、材料與方法

（一）材料

1.病料。采集病死豬只組織（脾臟、淋巴結）放在雙抗PBS溶液中，低溫冷藏保存運至畢節市動物疫病預防控制中心獸醫實驗室。

2.主要試劑。世紀元亨豬繁殖與呼吸綜合征病毒(NSP2 1594-1680變異株)檢測試劑盒，豬藍耳病病毒熒光定量PCR試劑盒。

（二）方法

1.樣品的處理。取病死豬只組織（脾臟、淋巴結），用手術剪剪碎混勻后取0.5g于組織勻漿機中研磨，加入2mL去離子水，研磨均勻后離心取500μL上清液于滅菌離心管中。

2.RNA提取。按照豬藍耳病病毒提取試劑盒說明書進行。

3.實時熒光RP-PCR檢測。反應采用25μL體系，反應體系為：無菌無核酸水2.7μL，RT-PCR反應液10μL，酶混合液0.4μL，熒光探針1.9μL，RNA模板10μL。反應條件為：45℃15min，95℃1min；95℃5s，60℃35s，在每個循環第二步收集FAM熒光信號，共40循環（報告基因“FAM”，淬滅基團“NONE”）

二、試驗結果

（一）臨床癥狀及藥物治療情況

采樣時共有13頭左右發病，死亡3頭。主要臨床癥狀為:食欲不振、流產、嘔吐、病程短的6～12h死亡，病程長的死亡前四肢劃動，有神經癥狀。發病母豬有流產死胎現象腹部發紅。剖檢主要表現為:肺臟肉變，肝臟充血，腎臟表皮有點狀出血，腸系膜淋巴結嚴重腫大。交替使用青鏈霉素、頭孢類、磺胺類等藥物肌肉注射治療，使用多量維生素和干擾素混水飲用，但治療效果不佳。

（二）實驗室檢測結果

經畢節市動物疫病預防控制中心采集該場病死豬樣品進行分子生物學檢測，結果顯示，病死豬只組織均檢出疑似高致

圖1　PRV實時熒光RT-PCR檢測結果A1：陽性對照；E1：陰性對照；B1/C1/D1：待檢樣品

三、討論

豬群一旦發生高致病性豬藍耳病后極易混合感染或繼發豬瘟、圓環病毒、細菌性疾病等，特別是豬瘟，可以說是豬病的萬惡之源，所以必須搞好豬瘟的預防和凈化工作[6-9]。其他疾病能使用疫苗免疫預防的，按免疫程序按時開展，如果沒有疫苗免疫預防的，可提前采用一些藥物進行預防[10]。高致病性豬藍耳病臨床上多表現為母豬的流產和仔豬的腹瀉、神經癥狀，僅從臨床表現和剖檢很難將其與有相似癥狀的豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等區分開來，需要進行實驗室檢測才能確診。本文采用分子生物學技術對流產胎兒組織進行實時熒光RT-PCR方法的檢測，確診了該次疫病由豬偽狂犬病毒引起。為今后實驗室確診豬偽狂犬病提供基礎科學依據。

［1］肖琨，徐興斌，李家秀，等.高致病性豬藍耳病的實驗室診斷［J］.貴州畜牧獸醫，2010，34（4）：6-7.

［2］何愛飛，徐春志，方英，等.一起豬瘟與高致病性豬藍耳病混合感染的實驗室診斷［J］.貴州畜牧獸醫，2009，33（4）：7-8.

［3］郭萬正，陳紹柏.豬藍耳病與豬瘟混合感染的診治報告［J］.黑龍江畜牧獸醫，2001，（9）：25-25.

［4］何海林.豬藍耳病與豬瘟混合感染診斷的報告［J］.TechnicalAdvisorforAnimalHusbandry，2008（8）：77-77.

［5］張立成，王謝忠，馬麗婭.一起豬瘟和高致病性豬藍耳病混合感染病例的診斷報告［C］.中國畜牧獸醫學會2010學術年會暨中國獸醫臨床大會，2010：62-62.

［6］朱意.高致病性豬藍耳病與豬瘟混感的防制［J］.今日畜牧獸醫，2015，（4）：22-23.

［7］滕秀霞，劉國華，馬秀霞，等.一起豬高致病性豬藍耳病和豬瘟混合感染疫情發生的處理和思考［J］.中國動物檢疫，2011，28（6）：66-68.

［8］王玉梅，張百煉.疑似高致病性豬藍耳病診治［J］.中獸醫醫藥雜志，2011，（2）：66-67.

［9］吳光明，吳衛東.一起高致病性豬藍耳病和豬副嗜血桿菌病混合感染的診斷［J］.養殖技術顧問，2014，（10）：214-215.

［10］羅洪安.高致病性豬藍耳病的診斷與防控［J］.廣東農業科學，2009，31（5）：98-99.

（編輯：張瓊瓊）

S858.28

B

1673-9019(2016)13-0034-02

2016-06-06

張平（1988-），女，安徽阜陽人，主要從事獸醫實驗室檢測工作。病性豬藍耳病病毒核酸陽性，沒有檢出豬瘟、圓環病。（見圖1）。由圖可知病死豬組織樣品DNA均呈出現特異性擴增曲線。