云南楚雄2014年蚊媒及其病毒感染調查

王　劍，郭曉芳，鮑建忠，董學書，孫曉東，林祖銳，姜進勇，周紅寧

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云南楚雄2014年蚊媒及其病毒感染調查

王劍1，郭曉芳1，鮑建忠2，董學書1，孫曉東1，林祖銳1，姜進勇1，周紅寧1

目的了解云南楚雄元謀、武定和雙柏3縣蚊蟲及其主要蟲媒病毒種類，為制定出有效的蟲媒傳染病防控對策提供依據。方法2014年6-7月采用誘蚊燈在調查點通宵捕捉蚊蟲，對現場采集蚊蟲進行形態分類鑒定；采用C6/36細胞培養法和RT-PCR擴增目的基因片段對蚊蟲體內病毒進行分離、鑒定。結果共捕獲4屬15種12 384只蚊蟲，三帶喙庫蚊、中華按蚊、致倦庫蚊和微小按蚊分別占捕獲蚊蟲總數的59.95%、19.31%、10.90%和 4.13%;C6/36細胞培養處理116組蚊蟲，其中29組發生細胞病變，經基因鑒定為版納病毒(BAV)、Totivirus 病毒(TOV)、乙型腦炎病毒(JEV)和Nam Dinh病毒(NDiV)4種，其中，三帶喙庫蚊的JEV、BAV、TOV和NDiV基因擴增批陽性率分別為1.87%、11.32%、3.77%和9.43%;希氏庫蚊的NDiV基因擴增批陽性率為25.00%;致倦庫蚊和中華按蚊的BAV、NDiV批陽性率分別為20.00%、33.34% 和5.00%、7.50%。結論楚雄地區蚊蟲種類多，且以三帶喙庫蚊和中華按蚊為優勢蚊種，從兩種蚊蟲標本中能分離到JEV、TOV、BAV和NDiV病毒，表明調查地區發生乙腦及其它蟲媒病毒性疾病流行的危險較大。

云南楚雄；蚊蟲；蟲媒病毒；病毒分離；基因鑒定

楚雄州地處云南中部，北與四川接壤，氣候屬亞熱帶季風氣候。蟲媒病毒(Arborvirus)是指在節肢動物如蚊蟲、白嶺、蠓蟲等體內繁殖,并通過上述吸血動物叮咬將病毒傳播給人或畜引起后者感染的病毒[1-2]。該病毒全球目前共發現14科535種,其中，與人獸傳染病密切相關的蟲媒病毒主要有7科11屬135種。蟲媒病毒的傳播媒介為吸血節肢動物(主要為蚊和蜱)，屬于人類健康危害最大的醫學昆蟲。為了解楚雄州蟲媒分布和蚊蟲自然感染蟲媒病毒的情況，我們進行了蟲媒種群、病毒分離和鑒定的調查。

1　材料與方法

1.1現場調查點的選擇調查點選擇在楚雄州元謀縣、武定縣和雙柏縣。根據不同緯度、經度和海拔,在每縣選取2個調查點，調查點要求周圍有森林、溪流稻田等利于蚊蟲滋生的環境，居民區飼養牛、豬等牲畜。

1.2蚊蟲采集方法及標本處理在每個現場調查點分別選擇人房和豬、牛等牲畜房掛燈誘捕，采用夜間誘蚊燈法通宵捕蚊：于20∶00時至次日8∶00通宵誘蚊燈(功夫小帥牌UV 光催化捕蚊器，220 VP50 Hz,24 W,武漢吉星環保科技有限責任公司出品)捕蚊，連續2 d。次日收回的集蚊裝置放置于-20 ℃冰箱，待蚊蟲凍死后，采用解剖鏡通過形態學方法鑒定蚊蟲種類，并進行記錄。鑒定后的蚊蟲按照種類放置于1.8 mL凍存管內(每管不超過50只)，做好標記后放入液氮中保存，待實驗室病毒分離鑒定。

1.3蚊蟲病毒自然帶毒檢測對上述采集并儲存在液氮中的蚊蟲標本，進行病毒分離與鑒定。

1.3.1主要試劑TRPMI1640培養基,購自Gibco；小牛血清,購自杭州四季青生物制品公司； QIAamp Viral RNA mini kit,購自QIAGEN；M-mlv-RT逆轉錄酶、Go Taq Green Master Mix,購自Promega；RNA酶抑制劑、dNTP Mixture(10mM dNTP)、Random Primer(9mer)隨機引物及DL2000 DNA Marker,購自Takara；瓊脂糖,購自Invitrogen；GoldView：購自TIANGEN。

1.3.2主要儀器生物安全柜,購自NUAIR-NU-440-400E；倒置顯微鏡,購自Nikon-ECLIPSE TE2000-S；二氧化碳孵箱,購自Thermo 3111；臺式冷凍離心機,購自SIGMA 3K15；PCR擴增儀,購自BIO-RADiQTM 5。

1.3.3病毒分離

1.3.3.1蚊蟲標本的處理將裝有蚊蟲的凍存管從液氮罐中取出后，隨機將50只蚊蟲計為1組置于預冷的無菌乳缽中，加入1.5 mL標本處理液將蚊蟲標本反復研磨至無較大組織碎片后，全部移入2 mL凍存管中，置于-80 ℃保存。取蚊懸液250 μL于4 ℃12 000 r/min離心，取上清用于接種細胞。

1.3.3.2細胞傳代將C6/36細胞棄去培養液，加入3 mL生長液(10%FBS 1640)，反復吹打細胞生長面，將細胞生長面吹下并分散細胞。按1∶4的比例傳代后，28 ℃培養。

1.3.3.3蚊蟲標本病毒分離將C6/36細胞接種于24孔細胞培養板并長成單層后，吸棄生長液，接種蚊懸液上清0.1 mL/孔，于32 ℃吸附1 h，每個細胞培養板均設有2孔C6/36細胞對照。吸棄蚊懸液后，補加1 mL維持液(2% FBS 1640)，置于32 ℃靜置培養，逐日觀察細胞病變(CPE)。于第7 d收細胞凍存于-40 ℃。再取凍融1次的細胞懸液0.1 mL，進行傳代，按上述方法觀察和保存。對所有標本均盲傳3代。

1.3.4病毒鑒定

1.3.4.1蚊蟲RNA提取隨機將每種蚊種以50只蚊蟲計為1組參照試劑盒說明提取蚊蟲RNA。將310 μg的carrier RNA溶解在310 μL AVE緩沖液中，使其終濃度為1 g/L。每個1.5 mL EP管中，加入560 μL AVL和5.6 μL含carrier RNA的AVE后，加入140 μL病毒分離液上清，并用移液器混勻15 s，室溫放置10 min(15～25 ℃)。上述樣品中加560 μL無水乙醇，輕柔混勻15 s。將該液體分2次加入QIAamp柱子中(630 μL/次)，8 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入500 μL AW1洗柱，8 000 r/min離心1 min，棄廢液。加入500 μL AW2洗柱，13 000 r/min離心3 min，棄廢液。原管離心13 000 r/min，1 min，甩干柱子。將柱子置于一個新1.5 mL EP管中，加40 μL AVE，室溫放置1 min。離心8 000 r/min，1 min，收集洗脫后的RNA，立即進行后續試驗或存于-80 ℃冰箱。

1.3.4.2引物設計、合成與PCR擴增針對云南分離到的7個病毒科(包括Toti病毒)基因組設計、合成特異引物(見表1)。

1.3.4.3RT-PCR將1 μL隨機引物以及15 μL RNA模板混勻離心后，70 ℃水浴5 min，冰浴5 min。再加入5×反應緩沖液5 μL、10 mmol dNTP、RNasin40 μ/μL和M-MLV(200 μ/μL)25 μL混合液，混勻離心后，42 ℃、60 min，95 ℃、10 min，-20 ℃保存。PCR反應體系(25 μL體系)，上、下游引物(10 μmol)各1 μL，GoTaq Green Master Mix2x緩沖液 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，擴增條件(見表1)。

1.4數據分析將數據錄入excel 表并進行構成比計算，批陽性率、總批陽性率計算公式如下：

批陽性率=(某種蚊蟲某縣陽性組數/某種蚊蟲某縣所有組數)×100%

總批陽性率=(某種蚊蟲3縣陽性組數/某種蚊蟲3縣所有組數)×100%

表1云南常見蚊蟲傳播病毒的PCR擴增引物和反應條件

Tab.1PCR amplified primers and reaction conditions for identification of viruses from common mosquito in Yunnan Province

病毒科Viraceae病毒屬(種)Potyvirus擴增位置Amplificationlocation引物名稱Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')擴增長度/bpAmplifiedfragmentlength/bp反應條件Reactionconditions黃病毒科Flaviviridae黃病毒屬FlavivirusNS5F1TACAACATGATGG-GAAAGAGAGAGAA26694℃,3min;94℃30s,52℃30s,72℃30s,35個循環;72℃10minF2GTGTCCCAGCCGGCGGT-GTCATCAGCNS5FU2GCTGATGACACCGCCG-GCTGGGACAC850cFD3AGCATGTCTTCCGTGGT-CATCCAJEVE蛋白EproteinJEV-EFJEV-ERAAGATGCCACTTCCA-CAYCTCAAGATGCCACTTCCA-CAYCTC1663披膜病毒科Togaviridae甲病毒屬Alphavirus通用引物UniversalprimerM2wcMw3M2W2YAGAGCDTTTTCGCAY-STRGCHWACATRAANKGNGTNGTRT-CRAANCCDAYCCTGYCCNVTGMDNWSYVC-NGARGAYCC434(M2w和cMw3)310(M2W2和cMw3)94℃,3min;94℃30s,52℃/55℃*30s30s,72℃30s,35個循環;72℃10min呼腸孤病毒科ReoviridaeBAV第12片段12thfragments12-854-SAAATTGATAGYGYTTGCG-TAAGAGAC84512-B2-RGTTCTAAATTGGATACG-GCGTGC506LNNV第12片段12thfragmentsLNV12s1GGAAGAATCAATGCCG-TAGCCLNV12r1GTGACGATCTTCTCT-GAACCAGTG94℃,3min;94℃30s,55℃40s,72℃30s,35個循環;72℃10minKDV第12片段12thfragmentsKDV-12-FGACGCTTTGAGAT-TATCTCGAC354KDV-12-RGCTCAATCGCATTCTCACC表1(續)病毒科Viraceae病毒屬(種)Potyvirus擴增位置Amplificationlocation引物名稱Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')擴增長度/bpAmplifiedfragmentlength/bp反應條件Reactionconditionskdv526RGGTGCCGAAGGATCAG-GCTTAC503kdv24FCAACGCTTTGAGATT-AGCTCGACYUOV7片段7fragmentsYUOVS7FAGCATTCGGTACGCAG-TATCTCG470YUOVS7RGCCGAGCCGATCATGT-CACGTGT

注：*為第2輪反應的溫度

Note:* for the second round of reaction temperature.

2　結　果

2.1蚊蟲組成共捕獲4屬15種12 384只蚊蟲，包括庫蚊屬(GenusCulex)5種，按蚊屬(GenusAnopheles)6種、騷擾蚊屬(GenusOchlerotatus)2種和阿蚊屬(GenusArmigeres)2種。其中三帶喙庫蚊(Cx.tritaeniorhynchus)7 424只，中華按蚊(An.sinensis)2 391只，致倦庫蚊(Cx.pipiensquinquefasciatus)1 350只，微小按蚊(An.minimus)511只，希氏庫蚊(Cx.theileri)355只，多斑按蚊(An.maculatus)104只，威氏按蚊(An.willmiri)56只，偽威氏按蚊(An.pseudowillmori)51只，騷擾阿蚊(Ar.subalbatus)35只，其它蚊種(每種<30只)共169只。三帶喙庫蚊、中華按蚊、致倦庫蚊和微小按蚊分別占捕獲蚊蟲總數的59.95%、19.31%、10.90%和 4.13%，三帶喙庫蚊和中華按蚊為當地優勢蚊種(見表2)。

表2楚雄3縣誘蚊燈捕蚊法捕獲蚊蟲種類情況

Tab.2Composition and distribution of mosquitoes collected from residential areas of 3 counties of Chuxiong Prefecture by lamp-traps

蟲種Mosquitospecies元謀縣Yuanmou武定縣Wuding雙柏縣Shuangbai合計Total數量Quantity(只)數量Quantity(只)數量Quantity(只)數量Quantity(只)百分比Percentage(%)三帶喙庫蚊Cx.tritaeniorhynchus19854589850742459.95中華按蚊An.sinensis6501052689239119.31致倦庫蚊Cx.pipiensquinquefasciatus385655310135010.90微小按蚊An.minimus653251215114.13其他蚊種other1961084047085.71合計Total32816729237412384100.00

2.2蚊媒病毒分離共進行蚊蟲病毒分離116組，其中29組有細胞病變，在培養7 d后的乙型腦炎病毒(JEV)E、版納病毒(BAV)B、Totivirus 病毒(TOV)D、和Nam Dinh病毒(NDiV)C和培養7 d的對照細胞A比較分別呈現:細胞聚集和細胞融合、細胞脫落和細胞內有顆粒物、細胞脫落和細胞大小不等、細胞聚集和細胞脹大的變化 (見圖1)。

A：細胞對照；B：BAV；C：Nam Dinh；D：Toti；E：JEV圖1　BAV、NDiV、TOV、JEV4種病毒感染細胞的形態變化Fig.1　Morphological changes of infected cells by four kinds virus of BAV, NDiV, TOV, JEV

2.2.1病毒分離情況從29組細胞病變中共分離到4科，即黃病毒科、呼腸孤病毒科、Toti病毒科、Mesoniviridae 病毒科的4種病毒，分別為乙型腦炎病毒(JEV)、版納病毒(BAV)、Totivirus 病毒(TOV)、和Nam Dinh病毒(NDiV)，其中3縣同時檢測到BAV和NDiV(見表3)。

表3楚雄3縣蚊媒病毒分離情況

Tab.3Mosquito borne virus isolated from mosquitoes collected from residential areas of 3 counties of Chuxiong Prefecture

地區Region黃病毒科Flaviviridae呼腸孤病毒科ReoviridaeToti病毒科TotiViraceaeNamDinh病毒科NamDinhViraceae合計TotalJEVBAVTOVNDiV元謀縣Yuanmou02013武定縣Wuding1811020雙柏縣Shuangbai00156合計Total11021629

2.2.2病毒基因檢測情況通過巢式PCR擴增，在三帶喙庫蚊、希氏庫蚊、致倦庫蚊和中華按蚊4種蚊蟲檢出4種病毒基因(見圖2)。

圖2　4種蚊媒中PCR擴增JEV、NDiV、TOV、BAV基因的電泳圖Fig.2　Electrophoretogram of PCR amplification of JEV, NDiV, TOV and BAV genes from four mosquito vectors

其中，從三帶喙庫蚊中分離到4種病毒，從希氏庫蚊分離到1種病毒，從致倦庫蚊和中華按蚊分別分離到2種病毒。三帶喙庫蚊中JEV、BAV、TOV和NDiV基因擴增批陽性率分別為1.87%、11.32%、3.77%和9.43%,希氏庫蚊的NDiV基因擴增批陽性率為25.00%，致倦庫蚊的BAV和NDiV基因擴增批陽性率分別為20.00%和33.34%，中華按蚊的BAV和NDiV基因擴增批陽性率分別為5.00%和7.50%。

3　討　論

1975年以來在滇西、滇西北、滇西南和滇南約50余個縣開展了大量的蚊蟲攜帶病毒狀況調查，分離鑒定約5個病毒科5病毒屬11種病毒321株病毒；在鑒定的11種病毒中包括辛德畢斯病毒(SINV)、基孔肯雅病毒(CHIKV)、蓋塔病毒(GETV)、乙型腦炎病毒(JEV)、登革病毒(DENV)、云南新環狀病毒(YUOV)、Colti病毒(Coltivirus)、Kadipiro病毒(KDV)、版納病毒(BAV)、濃核病毒(DNV)和巴泰病毒(BATV)[3]。其中,在與云南金沙江中部楚雄相鄰的大理州過去從蚊蟲中僅分離出24株JEV，未發現其他病毒種類[4-7]；同時有研究報道在云南金沙江下游地區三帶喙庫蚊中分離出1株JEV和5株DNV病毒，及從中華按蚊中分離出2株DNV病毒[8]。而本次調查在楚雄3個縣蚊蟲中不僅發現了JEV病毒，而且還分離出了BAV、Toti病毒和Nam Dinh病毒。對于JEV，近10多年許多學者在滇西、滇西北、滇西南和滇南多個州(市)、十余種蚊蟲中均分離到了上百株JEV病毒,也證實了三帶喙庫蚊屬于這些地區乙型腦炎的主要媒介[3，9]。在楚雄，雖然未見從該州區域蚊蟲中分離發現JEV的報道，但近幾年JEV病例分析發現，該州JEV病例一直屬于云南省JEV中度發病地區(發病率(1.5～3)/10萬)[10]。而本次調查從當地優勢蚊種三帶喙庫蚊中首次發現了JEV，為此對于該蚊或其他優勢蚊種在楚雄州JEV流行病學特征的研究仍需開展進一步的研究，提示當地疾控部門應加強針對三帶喙庫蚊為主的防蚊滅蚊措施和宣教活動，以保護當地居民的健康。BAV病毒在云南的研究較多，早在1987年就首次從云南省西雙版納一名無名熱及腦炎患者血清和腦脊液中分離到發現，此后相繼從滇東、滇西南、滇西北地區三帶喙庫蚊、中華按蚊等蚊蟲中分離到版納病毒[11-15]。本次在楚雄元謀和武定調查中也均發現了大量的版納病毒(10株)，該病毒是否已經在云南流行及其該病毒引起的疾病傳播規律或致病機制等問題還有待深入研究。至于Toti病毒和Nam Dinh病毒，因不能在哺乳動物細胞內繁殖，對人的致病性未知，由此對該2種病毒的進一步相關研究報道相對較少[15]。結合以往在云南勐臘縣采集的三帶喙庫蚊中首次分離到Toti病毒，本次在楚雄的2個縣采集的三帶喙庫蚊中分離到Toti病毒，說明該病毒為云南三帶喙庫蚊主要攜帶的蚊媒病毒之一[15]。NDiV病毒，首次在越南采集的庫蚊中分離到，我國2009-2011年在深圳市龍崗區的致倦庫蚊標本中檢測到我國4株Nam Dinh病毒，也通過系統進化樹分析提示，4株深圳NDiV株與越南NDiV株的親緣性較近，應屬于同一個進化分支[16]。本次調查從4種蚊蟲中也分離到NDiV，結合以往曾在大理南澗縣和老撾庫蚊中分離到NDiV病毒，說明該病毒不僅在云南蚊蟲媒介種類多，而且地理分布廣泛。

楚雄3個縣蚊蟲種類豐富度為4屬15種，乙腦傳播媒介三帶喙庫蚊、致倦庫蚊，瘧疾媒介中華按蚊、微小按蚊數量較多,屬于當地優勢蚊種；蚊蟲攜帶病毒種類較多，共4種，其中三帶喙庫蚊攜帶JEV、BAV、Toti和Nam Dinh病毒,希氏庫蚊攜帶Nam Dinh病毒，致倦庫蚊攜帶BAV和Nam Dinh病毒，中華按蚊攜帶BAV和Nam Dinh病毒。結果提示相關部門應加強楚雄州蟲媒和蟲媒病毒的研究，可為未來楚雄州蟲媒病毒與疾病流行關系的研究提供參考。

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Investigations of mosquito species and arbovirus in the part areas of Chuxiong Prefecture, Yunnan, 2014

WANG Jian1, GUO Xiao-fang1, BAO Jian-zhong2, DONG Xue-shu1,SUN Xiao-dong1,LIN Zu-rui1, JIANG Jin-yong1, ZHOU Hong-ning1

(1.YunnanInstituteofParasiticDisease/YunnanProvincialKeyLaboratoryofVector-borneDiseasesControlandResearch/YunnanProvincialCenterofArborvirusResearch/YunnanProvincialCollaborativeInnovationCenterforPublicHealthandDiseasePreventionandControl,YunnanCenterforMalariaResearch,Pu’er665000,China;2.ChuxiongCenterforDiseaseControlandPrevention,Chuxiong675000,China)

We investigated the species of mosquito and arborvirus in Yuanmou, Wuding and Shuangbai counties of Chuxiong Prefecture in Yunnan Province for providing effective evidences of local arbovirus borne infectious diseases control. We used mosquito trapping lamps in the survey point overnight to catch mosquitoes during the period from June to July in 2014, completing the morphological classification and identification of mosquitoes. In the laboratory, the supernatant were inoculated C6/36 cells to isolate the virus, the virus were identified by RT-PCR. Results showed that there were 15 species in 4 genus, 12 384 mosquitoes were collected by mosquito trapping lamps, of thoseCx.tritaeniorhynchus, An.sinensis,Cx.pipiensquinguefasciatusandAn.minimustheir percentages were respectively 59.95%,19.31%,10.90%and4.13%. Totally 29 cytopathic patches were found from 116 patches by C6/36 cells isolation, of those 4 arborviruses were identified fromCx.tritaeniorhynchus,Cx.pipiensquinguefasciatus,Cx.theileriandAn.sinensisby real-time PCR, i.e. They were Banna virus (BAV), Totivirus (TOV), Japanese encephalitis virus (JEV) and Nam Dinh virus (NDiV); their rates of positive patches of JEV, BAV, TOV and NDiV inCx.Tritaeniorhynchuswere 1.87%, 11.32%,3.77% and 9.43%, respectively, and that of NDiV inCx.theileriwas 25.00%, those of BAV and NDiV inCx.pipiensquinguefasciatusandAn.sinensiswere 20.00%、33.34% and 5.00%、7.50% respectively. There were many species of mosquito in Chuxiong Prefecture. TheCx.tritaeniorhynchusandAn.sinensiswere belonged to local predominant species, and the JEV, TOV, BAV and NDiV were isolated from them, which shows a higher epidemic risk of Japanese encephalitis and other arborvirus diseases in the investigate area.

Chuxiong Prefecture of Yunnan; mosquito; arborvirus; virus isolation; gene identification

Zhou Hong-ning, Email: zhn@yipd.org

周紅寧，Email：zhn@yipd.org

1.云南省寄生蟲病防治所、云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室、云南省蟲媒病毒研究中心、云南公共衛生與疾病防控協同創新中心、云南瘧疾研究中心，普洱665000；2.楚雄州疾病預防控制中心，楚雄675000

R373.3

B

1002-2694(2016)06-0581-08

收回日期：2016-01-25；2016-03-03

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.06.014