基于QuEChERS提取的HPLC-MS/MS法測定禽肉中的利巴韋林與金剛烷胺

郭禮強，孫　軍，田國寧，張金玲，王梅玲，李　凱

(濰坊出入境檢驗檢疫局，山東　濰坊　261041)

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基于QuEChERS提取的HPLC-MS/MS法測定禽肉中的利巴韋林與金剛烷胺

郭禮強*，孫軍，田國寧，張金玲，王梅玲，李凱

(濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊261041)

建立了液相色譜-串聯質譜(HPLC-MS/MS)同時測定禽肉中利巴韋林和金剛烷胺的檢測方法。禽肉樣品用1%(體積分數)三氯乙酸水溶液-甲醇(1∶1,體積比)提取，經PCX固相萃取柱和QuEChERS方法凈化后，以含5 mmol/L乙酸銨水溶液與甲醇為流動相梯度洗脫，BEH HILIC(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 色譜柱分離，電噴霧正離子模式電離，多級反應監測(MRM)模式進行檢測，內標法定量。結果表明，利巴韋林和金剛烷胺在0.50～200 μg/L范圍內呈良好線性，相關系數均大于0.997。兩種目標分析物的方法檢出限(S/N≥3)分別為0.30 μg/kg和0.15 μg/kg，定量下限(S/N≥10)分別為1.00 μg/kg和0.50 μg/kg，樣品在其1倍、2倍、10倍定量下限3個加標水平下的日內回收率為92.5%～104.7%，相對標準偏差(RSD)為3.4%～7.8%；日間回收率為93.3%～106.0%，RSD為6.0%～10.7%。該方法靈敏、簡便、準確，可用于禽肉中利巴韋林和金剛烷胺殘留的同時檢測。

分散固相萃取；利巴韋林；金剛烷胺；液相色譜-串聯質譜；禽肉

2012年12月，央視曝光養殖企業違規向白羽雞飼料中添加利巴韋林、金剛烷胺等抗病毒藥物，從而引起消費者對“速生雞”事件的廣泛關注。利巴韋林易產生耐藥性，對人體的最突出安全性問題是溶血性貧血及動物實驗顯示的遺傳毒性、生殖毒性和致癌性等[1]。金剛烷胺也有致畸性，可導致精神病患者精神分裂癥狀加重，并出現難治性雙下肢水腫[2]。禽畜濫用抗病毒藥物不僅會造成禽畜肉質風味的下降，且會導致禽畜肉中大量的藥物殘留，進而通過食物鏈危害人類健康。農業部在2005年發布了《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，明確規定禁止利巴韋林、金剛烷胺等抗病毒獸藥的銷售和使用。

目前，檢測利巴韋林和金剛烷胺的方法主要有液相色譜法[3-7]和液相色譜-串聯質譜法[8-14](LC-MS/MS)，液相色譜法靈敏度偏低，受基質干擾影響大，不能滿足食品安全中關于禽肉中抗病毒藥物殘留的檢測需求；液相色譜-串聯質譜法可提供檢測化合物的結構信息，具有高通量和高選擇性，可以同時檢測兩種目標分析物。由于禽肉樣品中殘留的抗病毒藥物含量少，基質干擾多，亟需建立可行的前處理技術以及靈敏度高的檢測方法。本研究選擇雞鴨養殖中常見抗病毒獸藥利巴韋林和金剛烷胺為研究對象，結合QuEChERS和SPE柱凈化前處理提取方法，建立了禽肉中利巴韋林和金剛烷胺的快速LC-MS/MS測定方法。該方法可操作性強，檢測周期短，為企業和食品安全監管部門提供了有效的技術支撐。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

高效液相色譜-串聯質譜聯用儀：Agilent 1290-6430(美國Agilent公司)，配電噴霧離子源(ESI)；5810R型離心機(德國Eppendorf公司)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation Associates公司)；Milli-Q純水機(美國Millipore公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Cleanert PCX-SPE凈化柱(天津博納艾杰爾公司)；利巴韋林專用柱(Poroshell 120,2.1 mm×150 mm，2.7 μm)和C18柱(Eclipse Plus C18，3.0 mm×100 mm，1.8 μm)購于美國Agilent公司；ACQUITY UPLC BEH HILLIC柱(HILLIC,2.1 mm×100 mm，1.7 μm)購于美國Waters公司。

利巴韋林(Ribavirin)和金剛烷胺(Amantadine)購于德國Sigma公司；利巴韋林內標(Ribavirin-13C5)購于上海安譜公司；金剛烷胺內標(Amantadine-D15)購于德國Dr.Ehrenstorfer公司；中性氧化鋁(Alumina-N，100～200目)購于天津市科密歐公司；石墨炭黑粉(GCB，120～400目)、C18粉(ODS，50 μm)、PSA粉(PSA，40～60 μm)、氨丙基粉(NH2，40～60 μm)購于Agela technologies inc公司；乙腈和甲酸均為色譜純，購于美國Biopure公司；實驗用水為超純水。

1.2溶液的配制

標準工作液：準確移取兩種待測物標準品1 mL于100 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混勻，配成終濃度為1 μg/mL的標準工作溶液。同法配成利巴韋林和金剛烷胺內標工作液為1 μg/mL。

混合標準工作液：移取10 mL利巴韋林和5 mL金剛烷胺標準中間液置于100 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，混勻，配成利巴韋林和金剛烷胺的濃度分別為100 ng/mL和50 ng/mL。同法配成利巴韋林和金剛烷胺內標濃度分別為100 ng/mL和50 ng/mL。

提取液：稱取三氯乙酸1.0 g置于500 mL燒杯中，依次加入100 mL水和100 mL甲醇，攪拌均勻。

洗脫溶液：5 mL氨水、25 mL異丙醇和70 mL甲醇混合均勻。

定容液：30 mL水和70 mL甲醇混合均勻。

1.3色譜條件

色譜柱：BEH HILIC(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)；流動相：A為5 mmol/L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0 ～3.0 min，75%～30%B；3.0 ～3.01 min，30% ～75%B；3.01 ～5.0 min，75%B；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：10 μL。

1.4質譜條件

對海外發行的重視是嶺南報刊的重要特色，這一傳播格局的基礎是數量眾多的華僑。嶺南是中國移民最早的地區，19世紀資本主義擴張對勞動力的需求，出現了移民潮，移民地區主要是“美洲、大洋洲、非洲和東南亞的一些國家”。[12]東南亞許多國家中粵籍都在華僑中占多數，[13]其他地區，如南美地區，“古巴華僑幾乎全是廣東省人，其中臺山縣的約占百分之四十”。[14]

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；監測方式：多級反應監測(MRM)；氣簾氣壓力：35 psi；離子電壓：5 500 V；碰撞氣：氮氣；干燥氣溫度：550 ℃；噴霧氣(GS1)壓力：55 psi，輔助霧化氣(GS2)壓力：55 psi；2種化合物及其內標的質譜檢測參數見表1。

表1　利巴韋林和金剛烷胺的部分質譜參數

*quantitative ion

1.5樣品處理

準確稱取(4±0.01) g絞碎均勻的樣品(雞肉或鴨肉)，置于100 mL具塞離心管內，依次加入內標工作液80 μL和提取液20 mL，均質1 min，以10 000 r/min離心10 min，經脫脂棉過濾，將上清液全部轉移至PCX凈化柱(預先用3 mL甲醇和3 mL水活化)，再用3 mL 0.1%甲酸水和3 mL甲醇淋洗小柱，真空抽干后，加入6 mL洗脫液，收集洗脫液于10 mL干凈玻璃試管中氮氣吹干，在玻璃管中加入50 mg Alumina-N，100 mg NH2和1 mL定容液，于渦旋振蕩器上振蕩1 min，過0.22 μm雙系濾膜，供LC-MS/MS分析測定。

2　結果與討論

2.1色譜條件的優化

色譜流動相常用的有機溶劑有甲醇[8]和乙腈[11-12]，本文考察了此兩種有機溶劑對目標物分析的影響，發現當流動相中的有機溶劑由乙腈改成甲醇時，兩種目標分析物的響應值均提高了2倍以上，與文獻[8]結論相同。同時考察了C18柱、HILIC柱和利巴韋林專用柱對兩種目標分析物的影響，結果發現使用C18柱分離時兩種目標分析物的響應值不足HILIC柱的1/5，使用利巴韋林專用柱時利巴韋林的峰響應值和HILIC柱差異不明顯，但金剛烷胺的響應值偏低且出現雙峰，而HILIC柱對兩種目標分析物均可良好分離，響應值最好。實驗發現，水相中添加甲酸或乙酸銨均能提高目標分析物的響應值，但添加甲酸時利巴韋林的峰形偏寬，添加乙酸銨時兩種目標分析物能有效分離，峰形好，而在水相中同時添加甲酸和乙酸銨時，兩種目標分析物的響應值反而略有降低。考察不同濃度乙酸銨溶液對兩種目標分析物的影響，選擇5 mmol/L乙酸銨水溶液為水相，此時目標分析物的響應值和峰形最佳，同時提高柱溫為40 ℃，調整流動相比例，以進一步提高色譜的靈敏度和穩定性。

2.2質譜條件的優化

利巴韋林和金剛烷胺在正離子模式下的響應值較高[8,11-12]。首先將500 μg/L的混合標準溶液分別通過自動進樣泵以5 μL進樣量直接注入ESI離子源，通過正離子掃描，找到目標分析物各自的準分子離子峰[M+H]+后，再分別優化其質譜參數，得到碎片離子信息，優化的MRM質譜參數見表1。圖1為利巴韋林和金剛烷胺混合標準溶液(1 μg/L)在MRM模式下的色譜圖。

2.3提取條件的優化

利巴韋林和金剛烷胺均屬于極性化合物，在有機溶劑中溶解度很小，一般選用有機溶劑-水[8,11]的混合溶液提取。考察了乙腈-水(1∶1，體積比)和甲醇-水(1∶1，體積比)對目標分析物回收率的影響，結果顯示甲醇-水作為提取液時回收率比乙腈-水高30%。進一步考察了加酸對回收率的影響，在甲醇-水中添加不同比例的甲酸、乙酸和三氯乙酸，發現添加甲酸對回收率的影響不大，添加乙酸和三氯乙酸會使回收率由51.3%分別提高到61.2%和65.1%，考慮到三氯乙酸有沉淀蛋白的作用，起到一定的凈化效果，可以提高方法的靈敏度，最終選用甲醇-1%三氯乙酸水溶液(1∶1)作為提取溶劑。

2.4凈化方式的選擇

直接采用提取液提取禽肉中的利巴韋林和金剛烷胺時，發現樣品中的脂肪、蛋白質等干擾目標分析物的檢測，尤其是利巴韋林在低濃度時受基質影響比較嚴重。考察了常用的固相萃取柱PBA柱[1，11-12]、SCX柱[8]、C18柱[14]和PCX柱對目標物的凈化效果。結果顯示，C18柱對目標分析物無保留，PBA柱、SCX柱和PCX柱均可保留目標物，且SCX柱和PCX柱的保留效果高于PBA柱。由于SCX柱和PCX柱的材料相似，對兩種目標物的回收率無明顯差異，考慮到PCX柱的性價比更好，最終選擇該柱進行考察。實驗中還發現一些帶皮的樣品(如煙熏去骨整鴨、凍鴨肉等)，用PCX柱凈化時基質影響仍比較嚴重，本文結合QuEChERS[15-16]方法，進一步考察了Alumina-N，GCB，ODS，PSA，NH25種凈化粉對利巴韋林和金剛烷胺的吸附回收率，通過標準品加凈化粉經質譜檢測并計算回收率，結果發現Alumina-N凈化的回收率為75.3%～84.5%，NH2凈化的回收率為70.0%～87.6%，兩種凈化粉的回收率較好；而ODS，GCB和PSA對目標分析物的吸附非常嚴重，導致回收率偏低(回收率為22.6%～64.5%)。Alumina-N粉末具有粒徑小、表面積大、吸附性能強的優點，能吸附肉類基質中的多種雜質特別是含硫化合物。NH2具有比PSA相對較弱的陰離子交換能力，可與一定的有機酸、色素以及糖類發生離子交換作用。通過對比PCX柱結合兩種凈化粉不同添加比例組合對目標分析物的凈化效果，確定最佳比例條件如“1.5”所示。

2.5標準曲線及檢出限

在優化條件下，對兩種目標分析物質量濃度在0.50～200 μg/L之間的系列混合標準溶液進行測定，以各化合物定量離子與內標校正離子峰面積之比的平均值(Y)對其質量濃度(X，μg/L)繪制標準曲線。結果顯示利巴韋林和金剛烷胺在0.50～200 μg/L范圍內呈良好線性；相關系數(r)分別為0.998 2和0.997 8。在禽肉中添加系列濃度的混合標準物質，以信噪比(S/N)為3作為方法的檢出限(LOD)，以S/N=10作為方法的定量下限(LOQ)。利巴韋林和金剛烷胺的LOD分別為0.30 μg/kg和0.15 μg/kg，LOQ分別為1.00 μg/kg和0.50 μg/kg。

2.6樣品基質的影響

電噴霧離子化效率受樣品基質的影響較大。本研究用抑制率評價樣品基質對目標分析物的抑制作用，即基質空白中添加標準品的監控離子響應強度與有機溶劑中添加標準品的相應監控離子響應強度減少的百分比。以不含目標分析物的雞肉和鴨肉為基質空白，分別添加定量下限濃度水平的利巴韋林和金剛烷胺標準溶液，與相應標準溶液進行比較。結果表明，樣品基質對兩種目標分析物有一定的抑制作用，但不同基質對兩種目標分析物的抑制率相差不大，利巴韋林的平均抑制率為18.2%，金剛烷胺為14.3%。為消除基質對檢測的影響，同時有效評估提取和凈化方法的損失，保證方法的通用性和適用性，本方法以內標法定量，可同時消除不同因素對測定結果的影響。

2.7回收率與精密度

在空白樣品中添加利巴韋林和金剛烷胺定量下限1倍、2倍、10倍3個水平的混合標準物質進行加標回收實驗，按“1.5”方法進行樣品預處理，日內每個濃度平行測定6個樣品，連續測定3 d。結果表明，兩種目標分析物的日內回收率為92.5%～104.7%，相對標準偏差(RSD)為3.4%～7.8%；日間回收率為93.3%～106.0%，RSD為6.0%～10.7%(見表2)。

表2　方法的加標平均回收率與相對標準偏差

2.8實際樣品的測定

日本對我國禽肉中利巴韋林殘留的出口限量為10.0 μg/kg，金剛烷胺限量為2.0 μg/kg。采用本方法對從出口企業抽檢的60份雞肉或鴨肉樣品中的利巴韋林和金剛烷胺進行測定，1份煙熏鴨胸肉中金剛烷胺的殘留量超出了日本的限量標準，其含量為5.9 μg/kg。表明方法可用于實際樣品的檢測。

3　結　論

本文基于PCX凈化柱和QuEChERS粉凈化的前處理技術，建立了一種結合超高效液相色譜-串聯質譜快速測定禽肉中利巴韋林和金剛烷胺的方法，能夠實現對兩種目標分析物的同時定性、定量分析。該方法具有靈敏、準確、實用性強等優點，可滿足禽肉中利巴韋林和金剛烷胺的檢測要求，為禽肉中抗病毒藥物殘留的綜合風險分析提供了技術支持。

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Determination of Ribavirin and Amantadine in Poultry Meat by QuEChERS-based Extraction with Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang*,SUN Jun,TIAN Guo-ning,ZHANG Jin-ling,WANG Mei-ling,LI Kai

(Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weifang261041,China)

A method was developed for the simultaneous determination and identification of ribavirin and amantadine residues in poultry meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The samples were purified with solid phase extraction column of PCX and QuEChERS method after extraction with 1% trichloroacetic acid-methanol(1∶1),then separated on a BEH HILIC column(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) by gradient elution with mobile phases of 5 mmol/L ammonium acetate-methanol.An internal standard method was used for quantitative analysis.The electrospray was operated in positive mode and a multiple reaction monitoring(MRM) as survey scan.The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.50-200 μg/L for two analytes with correlation coefficients(r) more than 0.997.The limits of detection(LODs,S/N≥ 3) for ribavirin and amantadine were 0.30 μg/kg and 0.15 μg/kg,respectively,and the limits of quantitation(LOQs,S/N≥ 10) were 1.00 μg/kg and 0.50 μg/kg,respectively.On the basis of LOQs,the intra-day average recoveries for two analytes in poultry meat samples at three spiked levels(1,2,10 times LOQ) ranged from 92.5% to 104.7% with relative standard deviations(RSDs) of 3.4%-7.8%,while the inter-day average recoveries ranged from 93.3% to 106.0% with RSDs of 6.0%-10.7%.The method was sensitive,convenient and accurate,and could satisfy the demands for detection of ribavirin and amantadine residues in poulrty meat.

dispersive solid phase extraction;ribavirin;amantadine;liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS);poultry meat

2015-12-06；

2015-12-27

濰坊市2015年科學技術發展計劃(2015ZJ1101)；山東出入境檢驗檢疫局科研基金(SK201349)

郭禮強，碩士，工程師，研究方向：農藥和獸藥殘留檢測，Tel：0536-8582561，E-mail：glq1980@sina.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.06.019

O657.63;TQ460.7

A

1004-4957(2016)06-0739-05