褪黑素對人卵裂期胚胎發育的影響及機制研究

胡曉東，熊風，萬才云，李觀貴，黃麗施，彭月婷，孫青，鮑忠劍，曾勇

(深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳　518045)

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·實驗研究·

褪黑素對人卵裂期胚胎發育的影響及機制研究

胡曉東，熊風，萬才云，李觀貴，黃麗施，彭月婷，孫青，鮑忠劍，曾勇*

(深圳中山泌尿外科醫院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點實驗室，深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳518045)

目的探討褪黑素對人第3天(D3)卵裂期胚胎發育成囊胚的影響及其作用機制。方法收集2012年10月至2014年10月在本中心行IVF-ET助孕治療患者捐贈的D3玻璃化冷凍胚胎，復蘇后存活率100%且未發生卵裂球溶解的胚胎納入研究(n=143)，隨機分為褪黑素組(培養液中加入1×10-7mol/L褪黑素，n=71)和對照組(不添加褪黑素，n=72)。兩組胚胎均放于37℃、5%CO2培養箱中培養72 h，統計囊胚及優質囊胚形成率；采用魯米諾化學發光法檢測培養液中總活性氧(ROS)水平；實時熒光定量PCR法分析抗氧化酶類基因CAT、GPx、SOD1、SOD2及凋亡相關基因Bax、Bcl-2的表達。結果褪黑素組的囊胚形成率(42.25%)顯著高于對照組(26.38%)(P<0.05)，優質囊胚形成率(30.00%)略高于對照組(26.32%)，但無顯著性差異(P>0.05)。培養72 h后兩組胚胎培養液中的ROS水平比較(513.33 vs. 556.67 RLUs)無顯著性差異(P>0.05)。褪黑素處理后，胚胎內過氧化氫酶基因CAT的相對表達量(1.68±0.43)較對照組(1.00±0.03)顯著上調(P<0.05)，其他基因包括Bax、Bcl-2、SOD1、SOD2、GPx的表達則沒有顯著性差異(P>0.05)。結論褪黑素能夠促進人卵裂期胚胎繼續發育形成囊胚，其機制可能與上調胚胎中過氧化氫酶基因CAT的表達有關。

褪黑素；人卵裂期胚胎；囊胚；過氧化氫酶

【Abstract】

Objective： To investigate the effect of melatonin on development of human cleavage-stage embryos to blastocyst in vitro.

Methods： The vitrified Day 3 embryos donated by couples undergone IVF treatment in our center from October 2012 to October 2014 were collected. The embryos which blastomere did not dissolved after warming were included in this study (n=143) and randomly divided into two groups according to the embryos were cultures with/without melatonin： the melatonin group (n=71) and the control group (n=72). The warmed embryos in both groups were cultured in the same incubator for 72 hours at 37℃，5% CO2concentration. The formation rates of blastocyst and high-grade blastocyst were compared between the two groups. Chemiluminescence assay was adopted to quantify the ROS levels in culture media. Gene expression of antioxidant enzymesCAT，GPx，SOD1 andSOD2，and apoptosis related genesBcl-2 andBaxin the embryos were analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR.

Results： The blastocyst formation rate of melatonin group(42.25%)was significantly increased compared to the control group(26.38%)(P<0.05)，while the high-grade blastocyst formation rate was slightly increased but no statistic difference(30.00% vs. 26.32%)(P>0.05). The ROS levels in the culture media after 72 hours culture were comparable between the two groups(513.33 vs. 556.67 RLUs)(P>0.05). The mRNA level ofCATwas significantly increased in the melatonin group compared with the control group [(1.68±0.43)vs.(1.00±0.03)] (P<0.05)，but no significant difference was found in the mRNA level ofGPx，SOD1，SOD2，Bcl-2 andBax(P>0.05).

Conclusions： Melatonin can promote human Day 3 cleavage-stage embryos develop to blastocyst. The mechanism could be associated with up-regulating expression of catalase gene by melatonin.

(JReprodMed2016，25(8)：719-724)

胚胎發育發生在有氧環境中，因自身代謝會產生一定量的總活性氧(ROS)。ROS積累能夠導致細胞膜脂質過氧化、損傷DNA、基因表達異常，造成毒性作用，ROS引起的氧化損傷可導致胚胎發育阻滯[1]。體內條件下，卵泡液與輸卵管液及其上皮含有大量酶類以及非酶類抗氧化劑，以保護胚胎免受氧化損傷。這些抗氧化劑包括非酶性抗氧化物如褪黑素，維生素A、C、E，丙酮酸鹽，谷胱甘肽，(亞)牛磺酸，半胱胺等，以及自身的酶性抗氧化劑如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物氧化還原酶(PRDX)等[2]。然而，體外胚胎培養條件下則失去這些保護機制[3]，目前一般采用三氣培養箱的低氧環境來減少ROS的產生。雖然也有添加L-肉堿[4]、維生素E[5]等抗氧化劑促進胚胎發育的研究，但是作用并不明顯，仍然缺乏一種非常有效的生理性抗氧化保護劑。

褪黑素(化學名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺)是哺乳動物和人的松果體分泌的一類吲哚類激素，在包括生殖系統的多個器官和組織中都有分布，是一個生理安全性自由基清除劑和抗氧化劑[6]。已有研究表明，在胚胎培養液中添加褪黑素能夠促進包括小鼠[7]、綿羊[8]、牛[9]和豬[10]等哺乳動物早期胚胎的發育，促進囊胚的形成。然而褪黑素對人類胚胎發育及囊胚形成的影響卻未見報道。本研究以人第3天(D3)卵裂期冷凍復蘇胚胎為材料，研究褪黑素對人類胚胎囊胚發育的影響，并初步探討褪黑素作用于人卵裂期胚胎的可能機制。

材料與方法

一、研究對象

收集2012年10月至2014年10月在我院生殖中心行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者自愿放棄并捐贈用于科研的D3胚胎。所有胚胎均是按照Quinns’s Advantage?玻璃化冷凍試劑盒(SAGE，美國)說明書行玻璃化冷凍的胚胎。根據其配套的玻璃化解凍試劑盒解凍所有胚胎，復蘇1 h后進行復蘇存活率評估及形態學評級。其中，復蘇存活率為100%且所有卵裂球均未發生溶解的胚胎納入本次研究。本研究經本院倫理委員會討論通過。

二、主要試劑與儀器

Quinns’s Advantage?胚胎培養液、Quinns’s Advantage?玻璃化冷凍與解凍試劑盒(SAGE，美國)；褪黑素、二甲基亞砜(DMSO)、魯米諾(5-氨基-2，3-二氫-1，4-二氮雜萘二酮)(Sigma，美國)；實時熒光定量PCR試劑盒Power SYBR Green Cells-to-CT(Life Technologies Corporation，美國)；PCR所用引物由上海生工公司合成；Synergy H1TM全功能酶標儀(Biotek，美國)；ABI 7500實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，美國)。

三、分組及培養方式

根據Scott采用的胚胎形態學分級標準[11]對復蘇后的胚胎進行評級，3級以上胚胎納入本次研究(n=143)，在保證兩組間的胚胎評級沒有顯著性差異的前提下，隨機分為兩組，褪黑素組(n=71)和對照組(n=72)。根據前期預實驗基礎和相關文獻經驗[12-13]，褪黑素組囊胚培養液中加入1×10-7mol/L褪黑素，對照組則不添加褪黑素。胚胎培養方式均采用Quinns’s Advantage?囊胚培養液進行微滴單個培養，微滴大小40 μl。兩組胚胎均放置于37℃、5% CO2培養箱中培養72 h，觀察并統計囊胚形成情況。根據Gardner & Schoolcraft標準[14]對囊胚進行質量評估。

四、培養液ROS檢測

囊胚培養液中的ROS含量采用魯米諾化學發光法檢測。體外培養胚胎72 h的培養液作為檢測組，檢測無胚胎培養、置于培養箱相同條件下72 h培養液中的ROS水平作為背景值。10 μl培養液中加入0.5 μl濃度為5 mmol/L的魯米諾，采用Synergy H1TM全功能酶標儀37℃條件下進行檢測，參照之前文獻[15]采用的方法，每個樣品測量15 min，讀取化學發光值，最終培養液中的ROS含量用相對光單位(RLUs)表示。每個樣品測兩個復孔。

五、熒光定量PCR

采用SYBR Green試劑盒定量分析兩組胚胎中抗氧化酶類基因的表達情況，如銅鋅超氧化物歧化酶基因(SOD1)、錳超氧化物歧化酶基因(SOD2)、谷胱甘肽過氧化物酶基因(GPx)、過氧化氫酶基因(CAT)，及凋亡相關基因，如抗凋亡的B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)、促凋亡的Bcl-2相關X蛋白基因(Bax)。GPx、CAT、SOD1、SOD2、Bax和Bcl-2基因的引物序列見表1。具體流程參照試劑盒說明書，分別收集培養72 h的褪黑素組和對照組所有胚胎，PBS溶液清洗2次后加入裂解液稀釋100倍的DNase I，提取RNA。加入20×RT酶混合液，2×SYBR RT緩沖液，在37℃ 60 min，95℃ 1 min條件下逆轉錄成cDNA。取1 μl cDNA模板，5 μl 2×SYBR Green PCR酶混合物，0.2 μl引物，ddH2O補至10 μl體系。利用ABI 7500實時熒光定量PCR儀進行擴增。擴增條件為：95℃預變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環。選擇β-actin作為內參基因，計算目標基因相對mRNA表達量。每個基因重復3次實驗。

表1　實時熒光定量PCR引物

六、統計學分析

結　　果

一、褪黑素對人卵裂期胚胎繼續培養形成囊胚的影響

褪黑素組和對照組的復蘇后胚胎質量比較無顯著性差異(P>0.05)(表2)。兩組胚胎在相同條件下培養72 h，觀察囊胚形成數量及質量，結果顯示，褪黑素組胚胎發育為囊胚的比例顯著高于對照組胚胎(42.25% vs. 26.38%，P<0.05)。褪黑素組優質囊胚的形成率有所提高，但是二者比較無顯著性差異(30.00% vs. 26.32%，P>0.05)(表3)。

表2　兩組復蘇胚胎的質量比較 [n(%)]

表3　兩組囊胚形成情況比較 [n(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

二、培養液中ROS水平檢測

采用魯米諾化學發光法檢測培養液中的ROS含量，結果顯示褪黑素組囊胚培養液中的ROS水平與對照組相當(513.33 vs. 556.67 RLUs)，無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1　兩組囊胚培養液中ROS水平比較

三、Bcl-2、Bax、CAT、GPx、SOD1和SOD2基因表達的定量分析

實時熒光定量PCR結果顯示，褪黑素組胚胎中CAT基因mRNA的相對表達量(1.68±0.43)較對照組(1.00±0.03)顯著升高(P<0.05)，其它基因的表達兩組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05圖2　熒光定量PCR檢測Bcl-2，Bax，CAT，GPx，SOD1和SOD2的相對表達量

討　　論

目前，輔助生殖技術是治療不孕不育癥最為有效的方法。經過30多年的發展，大家開始認識到傳統卵裂期胚胎的移植存在種植率不高、移植胚胎數多、多胎現象嚴重等問題[16]，有學者開始嘗試從卵裂期胚胎移植向囊胚移植甚至單囊胚移植過渡，認為在提高臨床妊娠率的同時，顯著降低多胎妊娠風險[17]，囊胚培養與移植可能是未來輔助生殖技術的發展趨勢[18]。這就對囊胚培養技術提出了極大的挑戰。雖然目前有研究嘗試對培養液及培養條件等進行優化，但囊胚形成率仍不高，若全部進行囊胚培養，仍有約10%的患者無囊胚形成而無可用胚胎[19]。因此，為了更有效、更安全地實施輔助生殖技術，提高囊胚形成率十分關鍵。本研究將褪黑素作為抗氧化保護劑添加到培養液中，結果顯示褪黑素顯著提高了人類卵裂期胚胎的囊胚形成率，提示其可能用于改善目前體外培養條件下囊胚形成不高、無囊胚形成發生率較高的現況。

褪黑素是人及其它哺乳動物體內合成的一類生理性激素，已有報道其作為活性氧清除劑應用于動物胚胎的研究中。在小鼠模型中，褪黑素能夠誘導2細胞期冷凍復蘇胚胎內源性谷胱甘肽的表達以及降低活性氧水平，提高囊胚形成率及胚胎質量[20]。褪黑素的添加也能提高綿羊冷凍復蘇胚胎發育成囊胚的細胞數與孵出率[21]。我們的研究結果較為類似，在人D3冷凍復蘇胚胎囊胚培養液中添加1×10-7mol/L褪黑素，顯著提高了囊胚形成率，提示褪黑素可能參與人卵裂期胚胎囊胚發育過程，并起到促進作用。然而，添加褪黑素后，雖然形成囊胚的質量有提高趨勢，但與對照組比較并沒有顯著性差異，這與之前報道的褪黑素提高動物胚胎形成囊胚的質量[20]不同。分析其原因，一方面可能是由于樣本量的局限性；另一方面，本研究中，只在D3胚胎向后繼續培養的囊胚培養液中添加褪黑素，與胚胎體外發育早期就添加褪黑素的相比，對胚胎發育的影響可能存在一定的差異。此外，動物胚胎的質量評估體系主要是根據囊胚細胞數來評估囊胚質量；而對于人類胚胎而言，根據Gardner & Schoolcraft標準，需要綜合考慮囊胚腔直徑、擴張程度、內細胞團的緊密程度及內細胞團和滋養層的細胞數，是一個綜合性的質量評估[14]。兩種不同的質量評估體系可能也是導致人和動物胚胎形成囊胚質量差異性的原因。另外，本研究中所用的褪黑素作用濃度為1×10-7mol/L，這主要是基于我們前期的濃度梯度摸索實驗(0 mol/L、1×10-9mol/L、1×10-7mol/L和1×10-5mol/L)及相關文獻經驗[12-13]，證實1×10-7mol/L的使用濃度可以獲得滿意的受精率與優胚率，加之有文獻報道高濃度的褪黑素反而會抑制細胞分裂從而不利于胚胎的發育[22]，但1×10-7mol/L是不是褪黑素的最佳作用濃度尚有待進一步研究驗證。

胚胎的玻璃化冷凍及解凍操作可能會破壞胚胎自身的抗氧化保護機制[23]，因此體外培養過程中可能需要體外添加抗氧化保護劑。由于人類胚胎的特殊性，本研究選擇了冷凍復蘇的胚胎研究褪黑素對人類胚胎發育的影響，并不能很直接地反應人類新鮮胚胎發育的情況。Choi等[24]的研究表明，在培養液中添加1×10-10mol/L褪黑素能顯著提高豬新鮮胚胎的囊胚形成率；亦有研究證實褪黑素有利于新鮮鼠胚的囊胚發育[20]。上述研究提示，褪黑素可能對冷凍胚胎和新鮮胚胎的發育均有積極作用，有可能僅在最適作用濃度上存在區別。

褪黑素發揮抗氧化作用的具體機制包含兩條途徑：(1)不依賴受體途徑：褪黑素有高的親脂性，能夠自由進出細胞膜性結構，與ROS分子直接結合并進行清除，而且褪黑素與ROS反應的代謝產物還具有活性氧清除功能[6]。(2)依賴受體途徑：褪黑素與細胞膜上的褪黑素受體結合，向細胞內傳遞抗氧化信號，通過級聯放大效應激活細胞內的抗氧化酶類(SOD、GPx、CAT、PRDX等)的表達從而發揮抗氧化的保護功能[25]。通過兩種途徑，最終有效減少ROS的含量，從而促進動物胚胎的發育[26]。

培養液是體外培養中胚胎的生長環境，培養液中的營養物質及胚胎的代謝產物，對胚胎的生長發育都十分關鍵。其中，胚胎自身代謝產生及外環境釋放的ROS物質都可能嚴重阻滯胚胎發育[27]。因此，本研究采用魯米諾化學發光法檢測了體外培養72 h后培養液中的總ROS水平。但出乎意外的是，褪黑素組與對照組培養液中的ROS含量比較并沒有顯著性差異，提示褪黑素的添加并不能有效去除培養液中的ROS，也就是說褪黑素可能是通過胚胎細胞膜上的褪黑素受體，向細胞內傳遞氧化應激信號，從而提高對ROS的耐受，促進囊胚形成。因此，本研究分析了褪黑素處理72 h后，胚胎中Bcl-2、Bax、CAT、GPx、SOD1和SOD2基因表達的情況。結果顯示CAT基因表達顯著上調，這與已有文獻[28]報道一致；其他基因(Bcl-2、Bax、GPx、SOD1和SOD2)的表達兩組間比較則沒有顯著性差異。而之前有文獻報道，褪黑素能顯著促進牛胚胎中抗氧化酶基因GPx、SOD1和抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制促凋亡基因Bax的表達，降低細胞內的ROS含量和細胞凋亡[29]；對于豬體細胞核移植胚胎，褪黑素能通過上調Bcl-2和下調Bax的基因表達促進囊胚的形成[30]；而在小鼠胚胎中，褪黑素上調表達SOD和Bcl-2基因，減少細胞內的ROS產生和抑制細胞凋亡，并不影響GPx和Bax等基因的表達[7]。如果不考慮褪黑素添加時間對基因表達的影響，這種差異可能是由于物種間的差異性造成的，即對于不同物種的胚胎，在體外發育過程中，褪黑素調控的下游基因可能并不相同。

綜上所述，本研究嘗試將褪黑素添加到人的胚胎培養液中，揭示了褪黑素對人卵裂期胚胎生長發育的促進作用。褪黑素的添加并不能直接改善胚胎培養液中的ROS水平，其可能機制與通過上調胚胎內CAT基因的表達，從而提高胚胎的抗氧化能力有關。但是，本研究并沒有對胚胎內CAT蛋白表達情況及細胞內的ROS含量進行檢測。因此，對于褪黑素究竟是如何影響CAT的表達水平以及如何通過上調CAT的表達來影響人類胚胎的發育，還需要更加深入的研究。

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[編輯：肖曉輝]

Effect of melatonin on development of human cleavage-stage embryos in vitro

HU Xiao-dong，XIONG Feng，WAN Cai-yun，LI Guan-gui，HUANG Li-shi，PENG Yue-ting，SUN Qing，BAO Zhong-jian，ZENG Yong*

FertilityCenter，ShenzhenZhongshanUrologyHospital，ShenzhenKeyLaboratoryofReproductiveImmunologyforPeri-implantation，ShenzhenZhongshanInstituteforReproductionandGenetics，Shenzhen518045

Melatonin；Human cleavage-stage embryos；Blastocyst；Catalase

2015-12-29；

2016-02-02

深圳市基礎研究項目(JCYJ20150402165325174)；深圳市科技計劃項目(201202200)；廣東省醫學科研基金項目(A2014658)

胡曉東，女，廣東人，本科，副主任醫師，婦產科學專業.(*

，Email：szsz01@sina.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.010