大負荷運動對雌性大鼠雌激素及抗苗勒管激素的影響

曹振蘭，蘭曉霞，胡春秀，趙化冰

(1. 遼寧醫學院，錦州　121000；2. 武警后勤學院附屬醫院婦產科，天津　300162；3. 天津市職業與環境危害防制重點實驗室，天津　300309；4. 武警后勤學院部隊流行病學與統計學教研室，天津　300309)

?

大負荷運動對雌性大鼠雌激素及抗苗勒管激素的影響

曹振蘭1，2，蘭曉霞3，4 #，胡春秀2，趙化冰3*

(1. 遼寧醫學院，錦州121000；2. 武警后勤學院附屬醫院婦產科，天津300162；3. 天津市職業與環境危害防制重點實驗室，天津300309；4. 武警后勤學院部隊流行病學與統計學教研室，天津300309)

目的探討大負荷運動對卵巢功能的影響，為防治運動性月經失調，提高訓練成績提供依據。方法選擇20只動情周期穩定的健康雌性SD大鼠，隨機分為兩組，實驗組和對照組各10只，按預設方案進行跑臺訓練；動態觀察陰道脫落細胞；監測大鼠的體重及血清雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)水平。結果隨著運動負荷增加，實驗組大鼠于第4周起開始出現動情周期紊亂現象；第5、6周實驗組大鼠的平均體重[分別為(288.80±8.51)g、(286.70±12.95)g]顯著低于對照組[分別為(305.76±7.57)g、(314.67±11.08)g](P均<0.01)；第5、6周實驗組大鼠的血清E2水平[分別為(349.86±25.84)pmol/L、(332.14±27.82)pmol/L]顯著低于對照組[分別為(412.80±36.81)pmol/L、(417.79±22.24)pmol/L](P均<0.01)，AMH水平[分別為(2.06±0.42)ng/ml、(1.81±0.48)ng/ml]亦顯著低于對照組[分別為(2.55±0.50)ng/ml、(2.46±0.55)ng/ml](P均<0.05)。結論持續的大負荷運動會造成大鼠動情周期紊亂，血清E2和AMH水平下降，提示大負荷運動應激導致月經失調的發生機制可能與卵巢功能下降有關。

大負荷運動；動情周期；雌激素；抗苗勒管激素

【Abstract】

Objective： To investigate the effects of high intensity exercise on ovarian function，in order to provide the basis evidences for preventing exercise-induced menstrual disorders and improving training results.

Methods： Twenty healthy female SD rats with stable estrus cycle were randomly divided into two groups according to different exercise training scheme： the experimental group and control group，ten for each group. The vaginal exfoliated cells and serum levels of estrogen & anti-mullerian hormone (AMH) were dynamically observed and monitored.

Results： Along with the exercise load increased，the rats in the experimental group began to appear estrus cycle disorder from the fourth week. In the fifth and sixth week，the average weight in experimental rats [(288.80±8.51) g and (286.70±12.95) g，respectively] was significantly lower than the control group [(305.76±7.57) g and (314.67±11.08) g，respectively] (P<0.01). The serum levels of estrogen [(349.86±25.84) vs. (412.80±36.81) pmol/L and (332.14±27.82) vs. (417.79±22.24) pmol/L] were significantly lower than those in the control group (allP<0.01), and AMH [(2.06±0.42) vs. (2.55±0.50) ng/ml and (1.81±0.48) vs. (2.46±0.55) ng/ml] were also significantly lower than those in the control group (allP<0.05).

Conclusions： The present experiment results suggest that high intensity exercise can result in abnormal estrus cycle，the decrease of serum levels of estrogen and AMH in female rats，which indicates that the mechanism lead to menstrual disorder by high intensity exercise may be related to a decline in ovarian function.

(JReprodMed2016，25(8)：725-730)

大負荷運動常可導致運動性月經失調(EAMD)。資料顯示，EAMD在女性耐力運動員和舞蹈演員中的發生率約為5%～20%，包括運動性閉經(AA)、月經稀疏、無排卵周期和黃體功能不全(LPD)等[1]。EAMD的發生不僅影響運動員的運動能力，其對運動員生育功能的影響也越來越受到重視。抗苗勒管激素(AMH)作為反應卵巢儲備功能最早的敏感性指標[2-3]，在預測卵巢功能方面的作用已得到公眾認可，但其在EAMD中的水平變化少見報道。本研究動態監測大負荷運動中大鼠血清雌激素和AMH水平的變化，為探討EAMD的發生機制、預測EAMD患者的卵巢功能提供一定參考。

材料和方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：清潔級雌性8周齡SD大鼠25只，平均體重(238.53±8.35)g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供[許可證號：SCXK-(軍)2012-0004]。參照實驗動物飼養標準常規飼料喂養，每天光照12 h，自由攝水進食，室溫20～25℃，相對濕度45%～55%。

2. 實驗耗材和試劑：玻璃毛細管、吸管、24孔板、載玻片、1 ml注射器、EP管、試管架、記號筆、10%水合氯醛、苦味酸、生理鹽水，大鼠雌激素酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠AMH ELISA試劑盒(均由上海拜沃生物科技有限公司提供)。

3. 主要實驗儀器：動物跑步機(FT-200動物跑步機，成都泰盟軟件有限公司提供)；微量高速離心機(TG16W，湖南長沙平凡儀器儀表有限公司提供)；酶標儀(Sunrise-Basic，TECAN，澳大利亞)；隔水式恒溫培養箱(GNP-9080，蘇州江東精密儀器有限公司提供)；洗板機(AC8，Thermo，美國)；顯微鏡(Alphaphot-2 YS2，尼康，日本)。

二、實驗方法

1. 動物分組及適應性訓練：實驗前每天早上8：00～9：00對大鼠進行陰道涂片檢查，連續觀察兩個動情周期，選取具有正常動情周期的大鼠進入實驗。按預設方案進行適應性跑臺訓練1周(詳見表1)，選取能適應跑臺運動且有規律動情周期的大鼠20只，參照隨機數字表隨機分成實驗組和對照組，每組10只。

表1　適應性訓練方案

2. 跑臺訓練：本實驗參照Bedford等[4]動物運動的負荷標準及王人衛等[5]大鼠動情周期抑制模型訓練方案。實驗組采用泰盟FT-200動物跑步機進行跑臺訓練，以1周為一個周期(運動6 d，休息1 d)，共訓練6周，訓練方案詳見表2。對照組則自由活動。

3. 內眥采血：每周于第7 d，給大鼠稱重，并行陰道脫落細胞學檢查，盡可能于動情間期進行采血。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(3 ml/kg)，左手拇指和食指抓住大鼠頸部，輕輕壓迫動物的頸部兩側，使眶后靜脈叢充血。右手拇指和食指持玻璃毛細管(長約3～4 cm，內徑1.0 mm)，將光滑一端于內眥部以45°角輕輕旋轉刺入約4～5 mm，待有血液流入毛細管，立即提起大鼠尾部，使其處于尾高頭低位，使血液自毛細管流到EP管中，一次采血1～1.5 ml，采血結束，停止壓迫大鼠頸部，將其平放于試驗臺，拔出毛細管。血液于4℃冰箱靜置30 min，3 500 rpm/min，離心20 min，取上清，-80℃保存。

表2　實驗組運動訓練方案

4. 陰道脫落細胞學涂片：每天早上8：00～9：00，大鼠置于試驗臺上，輕撫大鼠使其安靜，左手拇指和食指固定尾部，其余三指輕壓大鼠背部，以暴露陰道，右手持無菌吸管(吸有少量生理鹽水)，輕輕旋轉插入陰道內少許，輕輕吹打幾次，吸出混有陰道分泌物的生理鹽水，置入干凈的24孔板，吹打均勻，標記。取1～2滴滴在載玻片上，顯微鏡下觀察，根據鏡下陰道涂片的細胞數量和形態來確定動情周期。隨動情周期變化，陰道脫落細胞也發生變化，動情前期：細胞數量多，以有核的上皮細胞為主；動情期：大量細胞，以角化的上皮細胞為主；動情后期：可見3種形態的細胞：有核上皮細胞、無核角化的上皮細胞、白細胞，且三者數量相當；動情間期：以白細胞為主，有時少見細胞[6]。

5. ELISA法測定血清E2、AMH水平：選擇處于動情間期的大鼠血清樣品測定E2水平，AMH水平測定則可以選用任何動情周期的大鼠血清樣品。試劑盒在室溫下平衡30 min，具體實驗步驟參照試劑盒說明書。

三、數據處理

結　　果

一、大負荷運動對大鼠體重的影響

隨著周齡的增加，對照組大鼠體重呈逐漸上升趨勢，實驗組大鼠跑臺訓練前4周體重逐漸增加，第5周起體重呈下降趨勢。實驗組與對照組相比，前4周體重差異無統計學意義(P>0.05)，第5、6周實驗組大鼠的平均體重[分別為(288.80±8.51)g、(286.70±12.95)g]顯著低于對照組[分別為(305.76±7.57)g、(314.67±11.08)g](P均<0.01)(圖1、表3)。

注：與對照組比較，**P<0.01圖1　不同訓練周期實驗組和對照組大鼠體重變化趨勢

二、大負荷運動對大鼠動情周期的影響

運動前各組大鼠均有正常動情周期，平均4～5 d，陰道脫落細胞呈規律性變化。實驗組大鼠在跑臺訓練早期，有2只大鼠動情周期延長，分別為6 d和7 d，隨后恢復正常周期。隨著跑臺訓練的進行，于第4周開始實驗組大鼠出現動情周期紊亂現象：陰道涂片觀察到動情前期有核上皮細胞和動情期角化細胞逐漸減少，涂片中較少出現落葉狀大片角化細胞，動情間期粘液增多，動情后期、動情間期逐漸延長。第4周實驗組中有1只大鼠出現動情周期延長(達9 d)。至6周訓練結束，實驗組大鼠均出現了動情周期紊亂現象，其中有2只大鼠連續15 d處于動情間期。

三、大負荷運動對大鼠血清E2和AMH水平的影響

整個實驗周期，對照組大鼠血清E2水平相對平穩；實驗組大鼠血清E2水平隨運動訓練的持續呈現逐漸下降的趨勢，運動訓練前4周下降幅度較緩慢，第5～6周降幅顯著增大，顯著低于對照組(P<0.01)(圖2、表3)。對照組大鼠血清AMH水平相對平穩，實驗組大鼠血清AMH水平前3周較平穩，第4周起呈逐漸下降趨勢，第5、6周AMH水平顯著低于對照組(P<0.05)(圖3、表3)。

注：與對照組比較，**P<0.01圖2　不同訓練周期實驗組與對照組大鼠血清E2水平變化

注：與對照組比較，*P<0.05圖3　不同訓練周期實驗組與對照組大鼠血清AMH水平變化

時間(周)體重(g)E2(pmol/L)AMH(ng/ml)對照組實驗組對照組實驗組對照組實驗組1270.30±15.32267.07±9.64408.10±41.62442.93±46.722.48±0.772.46±0.502276.53±10.45276.54±10.89415.37±49.03430.56±38.872.52±0.702.44±0.573291.80±6.89286.58±11.25414.53±77.11407.81±38.762.48±0.572.45±0.504301.12±15.59293.32±13.02412.69±34.68401.50±26.132.59±0.562.31±0.355305.76±7.57288.80±8.51**412.80±36.81349.86±25.84**2.55±0.502.06±0.42*6314.67±11.08286.70±12.95**417.79±22.24332.14±27.82**2.46±0.551.81±0.48*

注：與同時期對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

討　　論

一、大鼠動情周期變化

下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)維持著雌性大鼠體內雌激素的水平，大鼠的陰道上皮細胞在雌激素水平作用下，不斷分裂、增生、成熟，最后角化脫落，稱為動情周期。大鼠動情周期約4～5 d，可分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。動情周期中陰道脫落細胞表現出不同的特點，因此可以通過陰道脫落細胞學檢查確定大鼠所處的動情周期[6]。如果出現上皮細胞周期性變化消失、動情期角化細胞減少直至消失、正常動情周期時間延長或沒有規律等，均提示大鼠發生了動情周期紊亂。

本實驗中，大負荷運動實驗組大鼠在跑臺訓練早期，有兩只大鼠動情周期延長，隨后恢復正常周期。這可能與大鼠的個體差異有關，開始對運動訓練比較敏感，之后產生了適應性。隨著運動負荷進一步增加，實驗組大鼠逐漸出現動情周期紊亂現象，提示大鼠已不適應逐漸增大的運動負荷，出現動情周期的紊亂。本研究結果顯示6周的大負荷運動可以導致大鼠動情周期紊亂，并且運動性動情周期的紊亂是一個漸進的過程，與以往的研究[7]相一致。有文獻報道長期參與劇烈運動的女運動員EAMD的發生率顯著高于正常人群[8]，這可能與大負荷運動抑制HPO軸的功能，使卵巢功能下降有關。

二、大負荷運動影響體重變化

體重下降是機體對超出機體耐受程度的運動負荷的一種反應，常用來作為判斷過度訓練的依據之一，也是大強度耐力運動導致運動性動情周期紊亂的表現形式之一，其下降程度與運動負荷及機體對負荷的耐受度有關。在長時間的大負荷運動中，能量消耗增加，導致體重降低。本實驗中前4周的訓練，隨著運動負荷的增長，實驗組大鼠體重呈逐漸增長趨勢，且與對照組比較無顯著性差異，提示大鼠對運動負荷具有一定的耐受力。自第5周起，實驗組大鼠體重逐漸下降，與對照組比較開始出現顯著性差異，提示訓練過度，大鼠機體已不再耐受負荷運動。

三、大負荷運動對大鼠體內激素水平的影響

雌激素是由卵巢顆粒細胞及膜細胞合成并分泌的，受HPO軸的調節，其中E2生物活性最強。正常情況下，下丘腦合成促性腺激素釋放激素(GnRH)，并以脈沖方式將其釋放入垂體門脈系統，促進垂體分泌釋放卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)，促進卵泡的發育成熟和雌、孕激素的分泌。在性成熟的雌性動物體內雌激素的合成分泌呈周期性變化，在動情期達到最高水平，在動情前期則處于最低水平。有研究顯示長期運動訓練的女性，常表現出低性腺類固醇激素水平，月經失調發生率較高[9]。動物實驗也表明長期大負荷的運動使大鼠動情周期抑制，血清雌激素濃度下降，促性腺激素水平降低[10]。提示長期的大負荷運動可以抑制卵巢的正常分泌功能。

本實驗運用ELISA方法檢測大鼠動情間期血清E2水平，結果顯示實驗組大鼠血清E2水平隨運動訓練進行呈現逐漸下降的趨勢，并在第5～6周降幅明顯增大，顯著低于對照組(P<0.01)。其原因可能是長期的大強度運動引起HPO軸功能抑制，尤其是下丘腦GnRH分泌的幅度、脈沖頻率降低，抑制垂體促性腺激素的分泌，使卵巢分泌功能下降、性腺激素分泌不足[11]。

AMH是轉化生長因子-β家族成員之一，主要由卵巢竇前卵泡以及小竇卵泡顆粒細胞分泌，與卵巢功能密切相關，是最新發現的評價卵巢年齡的重要指標[12-13]。有研究證實當卵巢功能和卵巢儲備能力發生變化時，AMH水平改變要早于E2和孕酮(P)水平的變化；月經周期第3 d的血清AMH水平可反映出卵巢竇卵泡的數量，并且AMH水平在女性體內保持相對穩定，既不隨月經周期發生變化，也不受促性腺激素的反饋調節，可準確、靈敏地評估卵巢儲備功能[14-15]。目前AMH對卵巢功能評價的研究較多，但AMH在EAMD中的變化研究少見報道。

本實驗結果顯示，實驗組大鼠血清AMH水平自第4周起逐漸下降，于第6周降至最低水平，顯著低于對照組(P<0.05)，提示實驗組大鼠的卵巢功能受到了影響。之前有研究顯示，持續大負荷運動可導致大鼠卵泡發生閉鎖，竇前卵泡和竇狀卵泡數量減少[16]。鄭陸等[17]研究發現，持續負荷運動可導致大鼠卵巢超微結構發生變化，卵泡基本處于較原始狀態。因此，推測本實驗中動情周期紊亂的實驗組大鼠其卵巢結構可能也發生了變化，從而影響了卵巢功能，但這仍需進一步研究證實。

綜上所述，本實驗中對照組大鼠動情周期規律，體重逐漸增加，血清E2、AMH水平基本平穩，提示對照組大鼠在整個實驗期間機體狀態較好，性腺軸功能基本正常。而6周的大負荷運動導致了實驗組大鼠的動情周期紊亂，血清E2、AMH水平顯著下降，提示持續的大負荷運動應激導致月經失調的發生機制可能與HPO軸的功能異常及卵巢功能下降有關，但其具體作用機制尚有待于進一步的研究探討。

[1]王杰龍，王人衛，方子龍，等. 女運動員黃體功能不全和無排卵發生率研究[J]. 中國運動醫學雜志，2009，28：142-146.

[2]Freeman EW，Sammel MD，Lin H，et al. Anti-mullerian hormone as a predictor of time to menopause in late reproductive age women[J]. J Clin Endocrinol Metab，2012，97：1673-1680.

[3]葉碧綠. 卵巢儲備功能的生物學指標[J]. 生殖醫學雜志，2015，24：687-691.

[4]Bedford TG，Tipton CM，Wilson NC，et al. Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures[J]. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol，1979，47：1278-1283.

[5]王人衛，陸愛云，陳佩杰，等. 遞增負荷的運動性閉經動物模型的建立[J]. 中國運動醫學雜志，2000，19：293-296.

[6]王潔，吳素慧，尚海霞. 性成熟雌性SD大鼠動情周期的觀察[J]. 當代醫學，2013，19：25-26.

[7]王人衛，高勇，陸愛云，等. 大強度運動訓練對雌性大鼠性激素和骨密度的影響[J]. 中國運動醫學雜志，2003，22：121-125.

[8]Goodman LR，Warren MP. The female athlete and menstrual function[J]. Curr Opin Obstet Gynecol，2005，17：466-470.

[9]Wojtys EM，Jannausch ML，Kreinbrink JL，et al. Athletic activity and hormone concentrations in high school female athletes[J]. J Athl Train，2015，50：185-192.

[10]高麗，鄭陸，沈東穎，等. 運動性動情周期抑制雌性大鼠下丘腦谷氨酸與GnRHmRNA關系的探討[J]. 山東體育學院學報，2006，22：63-66.

[11]王平，李敏，張林. 遞增負荷運動對大鼠脛骨雌激素受體和轉化生長因子-β1表達的影響[J]. 北京體育大學學報，2010，33：44-46.

[12]Hyldgaard JM，Ingerslev HJ，T?rring N，et al. Anti-Müllerian hormone is a clinical useful measure of the ovarian reserve[J]. Ugeskr Laeger，2015，177：V09140477.

[13]Alshiek JA，Lessing JB，Amit A，et al. Anti mullerian hormone (AMH)--is it a new reliable marker of the ovarian reserve? Its role in predicting the ovarian response in assisted reproductive technology (ART)[J]. Harefuah，2012，151：416-420.

[14]Catlin EA，MacLaughlin DT，Donahoe PK. Müllerian inhibiting substance： new perspectives and future directions[J]. Microsc Res Tech，1993，25：121-133.

[15]Anderson RA，Cameron DA. Pretreatment serum anti-müllerian hormone predicts long-term ovarian function and bone mass after chemotherapy for early breast cancer[J]. J Clin Endocrinol Metab，2011，96：1336-1343.

[16]高麗，隋波，沈東穎，等. 雌性大鼠運動性動情周期抑制與卵巢、子宮顯微結構及相關激素水平的變化[J]. 中國臨床康復，2006，10：109-111.

[17]鄭陸，潘力平，隋波，等. 遞增負荷運動大鼠卵巢子宮超微結構變化及其恢復過程觀察[J]. 山東體育學院學報，2006，22：47-50.

[編輯：辛玲]

Effects of high intensity exercise training on estrogen and anti-mullerian hormone in female rats

CAO Zhen-lan1，2，LAN Xiao-xia3，4 #，HU Chun-xiu2，ZHAO Hua-bing1，3*

1.LiaoningMedicalCollege，Jinzhou121000 2.HospitalAffiliatedLogisticsCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300162 3.TianjinKeyLaboratoryforPreventionandControlofOccupationalandEnvironmentalHazard，Tianjin300309 4.DepartmentofEpidemiology，LogisticsCollegeofChinesePeople’sArmedPoliceForces，Tianjin300309

High intensity exercise training； Estrous cycle； Estrogen； Anti-mullerian hormone

2016-01-20；

2016-03-24

武警醫學院重大項目資助課題(wjz2007-4)

曹振蘭，女，山東臨沂人，碩士研究生，婦產科專業.(#共同第一作者；*

，Email：lanxx1995@163.com)

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.08.011