丹參酮ⅡA對病毒性心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響*

王德坤　魏漢維　彭　戩（湖北省武漢市東湖醫院，湖北 武漢 430074）

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丹參酮ⅡA對病毒性心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響*

王德坤魏漢維彭戩
（湖北省武漢市東湖醫院，湖北 武漢 430074）

目的 觀察丹參酮ⅡA對病毒性心肌炎小鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）水平的影響。方法 80只雄性BALB/c小鼠隨機分為空白對照組（對照組）20例、病毒性心肌炎模型組（模型組）30例、丹參酮ⅡA治療組（治療組）30例。模型組、治療組腹腔接種柯薩奇病毒B3（CVB3）建立病毒性心肌炎模型，對照組腹腔注射不含病毒的 Eagle's液。治療組于病毒接種0.5 h后腹腔注射丹參酮ⅡA注射液，連續14 d。觀察記錄小鼠一般情況、記錄死亡數，計算小鼠生存率；取血測定小鼠血清IL-6、TNF-α水平；取心臟，計算心臟指數，HE染色，計算病理評分。結果 與對照組小鼠比較，模型組小鼠血清IL-6和TNF-α水平、心臟指數、心臟病理評分均升高（P＜0.05）；與模型組比較，治療組小鼠心臟指數、TNF-α、IL-6水平、心臟病理評分均降低（P＜0.05）。結論 丹參酮ⅡA可通過降低TNF-α、IL-6發揮減輕心肌損傷、治療病毒性心肌炎作用。

病毒性心肌炎丹參酮ⅡA腫瘤壞死因子-α白介素-6

【Abstract】Objective：To study the effect of sodium tanshinoneⅡA sulfonate on tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukine-6（IL-6）in mice with coxsackie B3 viral myocarditis.Methods：Eighty male BALB/c mice were randomly divided into three groups：the control group（n=20），viral myocarditis model group（n=30）and sodium tanshinoneⅡA sulfonate-treated group（n=30）.The first two groups were intraperitoneally inoculated with CVB3 to induce myocarditis，the control group with virus-free Eagle′s medium instead.Sodium tanshinoneⅡA sulfonate-treated group was given andrographis injection through intraperitoneal injection 0.5 hours after injecting virus every day for 14 days.The control group and myocarditis group used normal saline instead.The general state of the mice was observed；deaths were recorded and the survival rate of mice was calculated；the content of TNF-α and IL-6 was tested.Hearts were taken；the cardiac index was calculated；HE staining was adopted；the pathological integral was calculated.Results：Compared with the control group，cardiac index，TNF-α and IL-6 level and the pathological integral in the model group increased（P＜0.05）；compared with the model group，cardiac index，TNF-α and IL-6 level and the pathological integral in sodium tanshinoneⅡA sulfonate-treated group were decreased（P＜0.05）.Conclusion：Sodium tanshinoneⅡA sulfonate can decrease TNF-α and IL-6 serum level of mice and has obvious effects on prevention and treatment.

【Key words】Viral Myocarditis；Sodium tanshinoneⅡA sulfonate；TNF-α；IL-6

病毒性心肌炎（VMC）是心血管常見的疾病之一，腸道病毒尤其是柯薩奇B3病毒（CVB3）是引起VMC的最常見原因［1］。嚴重者可導致血流動力學異常，伴發心功能不全、休克等嚴重并發癥［2］，甚至導致死亡，如何有效治療VMC已經成為當前研究的重要內容。丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）是從天然植物丹參中提取的水溶性物質，有研究表明，STS有消炎抗菌、抗病毒、調節免疫、抗腫瘤及抗氧化的作用［3］。已有研究表明丹參對病毒性心肌炎也有治療作用［4］，但該藥的作用機制目前還不清楚。本實驗通過觀察STS對病毒性心肌炎小鼠血清炎性因子水平的影響，探討其治療病毒性心肌炎的具體機制。

1　材料與方法

1.1動物動物健康雄性BALB/c小鼠購自蘇州大學實驗動物中心［合格證號SCXK（蘇）2008-0005］，4周齡，體質量13～16 g，共80只。

1.2試藥與儀器CVB3 Nancy株購自武漢大學典藏中心病毒原液有效價為102TCID 50/0.1 mL。STS（上海第一生化藥業有限公司，國藥準字Z20026249）。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒，白細胞介素-6（IL-6）試劑盒由上海科敏生物科技公司提供。

1.3造模與給藥將小鼠隨機分為3組：空白對照組（對照組）20例、病毒性心肌炎模型組（模型組）30例和丹參酮ⅡA磺酸鈉治療組（治療組）30例。對照組給予不含病毒的Eagle's液0.1 mL腹腔注射。模型組和治療組給予同體積的CVB3濃度為102TCID 50/0.1 mL的病毒液腹腔注射。于病毒接種0.5 h后治療組腹腔注射STS 0.1 mL/只，每日1次，連續14 d。對照組及模型組注射同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.4標本采集與檢測1）小鼠一般情況：每天觀察小鼠生命體征、飲食及活動情況等，記錄存活率。2）心臟指數：接種病毒2周處死小鼠開胸取出心臟，用濾紙吸干心臟表面血液后稱質量，計算心臟指數（心質量/體質量）。3）血清炎癥因子水平測定：小鼠接種病毒2周，摘眼球取血，離心10 min（4℃，3000 r/min），取上清，嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測血清TNF-α及IL-6水平。4）心肌組織病理學觀察：小鼠心肌組織依次給予10%甲醛固定、乙醇脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，置光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。病理積分計算，無病變計0分，病變面積＜25%計1分，病變面積25%～50%計2分，病變面積50%～75%計3分，病變面積＞75%計4分。

1.5統計學處理應用SPSS16.0統計軟件分析。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結　果

2.1各組小鼠一般情況對照組小鼠活動、飲食等一般狀況良好，皮毛光滑，14 d未死亡，存活率100%。模型組小鼠2 d出現活動減少，飲食下降，皮毛無光澤，蜷縮等癥狀，4 d開始出現死亡，7～10 d達到死亡高峰，14 d共死亡9只，存活率為70.00%。治療組小鼠臨床癥狀比模型組小鼠輕，5 d開始出現死亡，14 d共死亡4只，存活率為86.67%。各組存活率差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2各組心臟指數及心肌病理光鏡觀察結果見表1和圖1。與對照組比較，模型組和治療組小鼠心臟指數均明顯上升（P＜0.05）；治療組心臟指數明顯低于模型組（P＜0.05）。光鏡下見對照組心肌細胞的結構正常，心肌纖維排列整齊，橫紋清晰，間質無充血水腫；模型組心外膜充血水腫，心肌細胞周圍有炎癥細胞浸潤，主要為淋巴細胞以及單核細胞，鄰近心肌細胞出現玻璃樣或空泡，肌纖維排列紊亂、出現腫脹、斷裂；治療組小鼠心肌組織病理學改變較模型組明顯減輕。

表1　各組小鼠心臟指數及炎癥病理積分比較（±s）

表1　各組小鼠心臟指數及炎癥病理積分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n　心臟指數　病理評分對照組　20　4.11±0.07　0模型組　30　4.86±0.15△　2.82±0.41△治療組　30　4.43±.011*△　1.24±.032*△

圖1　小鼠心肌組織病理切片（HE染色，400倍）

2.3各組小鼠血清炎性因子水平比較見表2。與對照組比較，模型組和治療組的血清IL-6及TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，治療組血清IL-6、TNF-α水平降低（P＜0.05）。

表2　各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

表2　各組小鼠血清IL-6、TNF-α水平比較（pg/mL，±s）

組別　n　IL-6　TNF-α對照組　20　10.46±2.48　82.72±12.46模型組　30　29.51±4.23△　176.51±41.57△治療組　30　20.11±4.12*△　138.62±30.81*△

3　討　論

VMC最具特征性的病理特征是心肌細胞的壞死以及心肌炎性細胞浸潤，現認為其主要的發病機制是病毒的直接損害和機體的炎癥免疫損傷［5］。TNF-α是機體炎性反應與免疫系統重要調節因子，已有研究表明CVB3所致心肌的心肌炎癥病變程度與TNF-α的水平有密切的相關性，TNF-α表達水平上升可導致心肌細胞的壞死和炎性細胞的浸潤，使心肌組織的炎性反應加重，此外，持續高水平的TNF-α可改變肌膜蛋白，導致心肌細胞被破壞從而損傷心肌［6］。IL-6是由單核巨噬細胞、T淋巴細胞（Th2）產生的炎性細胞因子，可介導細胞毒性損傷［5］。有研究［5，7-8］發現VMC患者血清IL-6和TNF-α水平明顯升高，提示炎癥反應的過度增強，可導致心肌細胞的凋亡，同時IL-6和TNF-α二者具有協同作用，進一步加重心肌細胞的炎性損傷和壞死。

目前臨床上對于VMC的治療主要以抗炎、心肌保護等對癥治療為主，療效欠佳，有報道指出中藥丹參在病毒性心肌炎的治療有一定優勢，可從多途徑多靶點發揮抗炎、抗氧化、調節免疫等作用，從而改善心肌缺血［4］，但該藥的作用機制目前還不清楚。《吳普本草》有記載丹參味辛、性涼，具有活血化瘀、理氣止痛、涼血消癰及活血通經之效，被廣泛用于臨床心腦血管疾病的治療［9］。丹參酮ⅡA是丹參的有效成分，有消炎抗菌、抗病毒、調節免疫、抗腫瘤及抗氧化等作用，可減輕巨噬細胞產生的炎癥因子NO、TNF-α和IL-6的表達，阻礙NF-κB與DNA相結合，抑制NF-κB下游基因的轉錄［10-13］。國內研究發現丹參酮ⅡA對細胞具有顯著的保護作用，能明顯抑制病毒的繁殖，具有直接殺滅病毒的作用，隨著其藥物濃度的提高，病毒抑制率明顯升高［14-15］。

本研究采用丹參的主要成分丹參酮ⅡA對VMC模型小鼠進行干預，結果發現VMC小鼠的TNF-α、IL-6水平較對照組有顯著性升高（P＜0.05），給予丹參酮ⅡA干預后其炎性因子TNF-α和IL-6水平較模型組明顯降低 （P＜0.05），提示丹參酮ⅡA可降低VMC小鼠的炎癥反應。進一步觀察小鼠的形態學變化，我們發現與對照組比較，模型組小鼠心臟指數明顯上升、心肌出現明顯病理學改變（P＜0.05），丹參酮ⅡA干預后小鼠心臟指數明顯低于模型組（P＜0.05），小鼠心肌組織病理改變較模型組減輕，其存活率（86.67%）較模型組（70.00%）有明顯的提高（P＜0.05）。研究結果表明，丹參酮ⅡA能減輕VMC心肌損傷，提高小鼠生存率，對病毒性心肌炎有治療作用，其機制可能與丹參酮ⅡA可下調TNF-α、IL-6的表達有關。

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Effect of Sodium TanshinoneⅡA Sulfonate on TNF-α and IL-6 in Mice with Coxsackie B3 Viral Myocarditis

WANG Dekun，WEI Hanwei，PENG Jian.Cardiovascular Internal Medicine Department of Donghu Hospital，Hubei，Wuhan 430074，China.

R285.5

A

1004-745X（2016）05-0766-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.05.005

國家自然科學基金項目（30500657）；湖北省自然科學基金項目（211CDB196）

2016-01-07）