2型糖尿病大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道α、β1亞基蛋白及mRNA表達(dá)水平變化*

段洪霞，葛李，崔傳寶，吳知桂，陳美娟

（四川醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，四川 瀘州 646000）

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·論著·

2型糖尿病大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道α、β1亞基蛋白及mRNA表達(dá)水平變化*

段洪霞，葛李，崔傳寶，吳知桂，陳美娟

（四川醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，四川 瀘州 646000）

目的探討2型糖尿?。═2DM）大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）α、β1亞基蛋白及mRNA表達(dá)水平變化，從分子水平闡明T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜BKCa通道活性改變的具體機(jī)制，為T2DM的綜合治療提供新靶點(diǎn)；為特異性針對(duì)此環(huán)節(jié)的藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法SD大鼠高糖高脂飲食1個(gè)月后腹腔注射鏈脲菌素STZ（25 mg/kg）建立T2DM大鼠模型。免疫印記法和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定腸系膜動(dòng)脈BKCa通道α和β1亞基的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果①免疫印跡結(jié)果顯示：模型組在第8周和第12周腸系膜動(dòng)脈大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.093±0.251）和（0.921±0.153），與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；β1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.334±0.200）和（0.193±0.310），與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示，模型組在第8周和第12周腸系膜動(dòng)脈BKCa α亞基mRNA的表達(dá)分別為（1.15±0.03）和（0.92± 0.04），與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；β1亞基mRNA的表達(dá)分別為（0.47±0.10）和（0.37± 0.12），與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈BKCa β1亞基蛋白和mRNA表達(dá)在8周及12周明顯降低。

2型糖尿??；大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；腸系膜動(dòng)脈；α、β1亞基

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）的血管并發(fā)癥是本病致殘致死的主要原因，作為血管張力的最終執(zhí)行者及各種生化因子的最終作用靶點(diǎn)的血管平滑肌在眾多的生化機(jī)制（氧化應(yīng)激、慢性炎癥、糖基化終產(chǎn)物損害、醛糖還原酶等）作用下，是否發(fā)生變化還尚未可知，血管平滑肌上的大電導(dǎo)鈣激活 鉀 通 道 （large-conductancecalcium-activated potassium channels，BKCa）是血管張力調(diào)節(jié)的關(guān)鍵負(fù)反饋器，葉春玲等［1］發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈BKCa關(guān)閉時(shí)間縮短；李尚儉等［2］報(bào)道，胰島素抵抗大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌BKCaβ1亞單位蛋白和mRNA表達(dá)降低。但有關(guān)T2DM大鼠腸系膜血管平滑肌BKCa是否存在異常的研究尚鮮有報(bào)道，本課題組前期研究［3］發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠血管反應(yīng)性存在變化，并與血管平滑肌上BKCa可能存在相關(guān)性，本研究采用免疫印跡法（Western blot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)探討T2DM大鼠不同病程阻力血管（腸系膜動(dòng)脈）平滑肌上BKCaα、β1亞基蛋白及mRNA表達(dá)是否存在異常，以期為T2DM的綜合治療提供新靶點(diǎn)，為特異性針對(duì)此環(huán)節(jié)的藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象成年SD大鼠，雄性，體重180～200 g，購自成都達(dá)碩動(dòng)物有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXKC川22008-23。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑鏈脲佐菌素（Streptozotoxin，STZ），總RNA提取試劑TRIzol（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System（成都博瑞克生物公司），小鼠抗人Actin單抗（美國Santa Cruz公司），兔抗人KCNMA1（BKCAα）多抗，批號(hào)：Lot#A1455，兔抗人KCNMB1（β1）（英國Abcam公司），熒光定量PCR試劑（日本Takara公司），批號(hào)：Lot No.1131801，膜蛋白提取試劑盒（上海碧云天生物研究所），聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物研究所），Taq酶PCR試劑（北京TIANGEN生物公司），批號(hào)：K9104瓊脂糖（美國進(jìn)口分裝公司），RIPA裂解液（上海碧云天生物研究所），蛋白預(yù)染Marker（美國Fermentas公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence，ECL）發(fā)光液（美國millipore公司）批號(hào)：Lot No.1131801。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器BIORAD電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（美國BIORAD生物公司），ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司），血糖監(jiān)測(cè)儀，ND-100核酸蛋白檢測(cè)儀（美國Nanodrop公司）。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型的建立［4］將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組10只、模型組40只，模型組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料（10%豬油、2.5%膽固醇、20%蔗糖、1%膽酸鹽和66.5%的普通飼料）4周，腹腔注射STZ（25 mg/kg）1次，1周后以空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥11.0 mmol/L且伴有胰島素敏感性降低者（P＜0.05）為成模指標(biāo)，篩選出成模鼠20只繼續(xù)高脂高糖飼養(yǎng)至12周，對(duì)照組大鼠普通飼料喂養(yǎng)12周，腹腔注射同體積檸檬酸緩沖液。

1.2.2標(biāo)本的采集于8周、12周對(duì)照組、模型組大鼠分批腹腔注射1%戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，開腹取腸系膜動(dòng)脈，分離血管周圍的結(jié)締組織及脂肪，然后放入RNA保存液，-80℃冰箱保存。

1.2.3免疫印跡法測(cè)定α和β1亞基蛋白表達(dá)量取大鼠腸系膜動(dòng)脈，RIPA法冰上勻漿、消化，12 000 r/min離心1 min，收集上清液，BCA法蛋白定量。等量的蛋白（15 L）經(jīng)SDSPAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的三乙醇胺緩沖鹽水溶液室溫封閉1 h。然后分別用兔抗大鼠Kca1.1抗體、兔抗大鼠 sol-1抗體、兔抗大鼠β-actin抗體4℃孵育過夜。過氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗，室溫孵育1 h。ECL試劑盒化學(xué)熒光顯像。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定α和β1亞單位mRNA的表達(dá)取出冷凍保存于-80℃冰箱中大鼠腸系膜動(dòng)脈，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用SYB Rgreen法進(jìn)行PCR反應(yīng)，GAPDH為內(nèi)參照。實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀檢測(cè)。擴(kuò)增參數(shù)：95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s、60℃退火15 s、72℃拉伸15 s，進(jìn)45個(gè)循環(huán)。以GAPDH為參照基因，計(jì)算模型組與對(duì)照組的相對(duì)基因拷貝數(shù)。相對(duì)基因拷貝數(shù)用2-△△ct表達(dá)。采用軟件Beacon Designer 7.0設(shè)計(jì)α和β1亞單位的PCR引物，保證相關(guān)引物的GC含量40%～60%，Tm值在55～65℃，且引物自身不存在連續(xù)4個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列以及正反向引物間盡量避免出現(xiàn)互補(bǔ)序列。見表1。

表1 α和β1亞單位的mRNA引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS l9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1T2DM大鼠空腹血糖、餐后2 h血糖、空腹血胰島素測(cè)定結(jié)果

圖1　8周、12周腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa ɑ蛋白的圖像表達(dá)

腹腔注射STZ8周、12周測(cè)定空腹血糖、餐后2 h血糖、血胰島素，與對(duì)照組比較明顯升高，血胰島素敏感指數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　T2DM大鼠血糖和血胰島素敏感指數(shù)（ISI）的變化（n=10±s）

表2　T2DM大鼠血糖和血胰島素敏感指數(shù)（ISI）的變化（n=10±s）

注：覮與對(duì)照組比較，P＜0.05

2.2T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa α、β1亞基蛋白的表達(dá)

免疫印跡結(jié)果，在8周和12周模型組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa α蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（1.093±0.251）和（0.921±0.153），分別與對(duì)照組作兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，t值分別為1.172和1.633，查t界值表P＞0.1，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β1亞基蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.334±0.200）和（0.193±0.310），分別與對(duì)照組作兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，t值分別為10.530和8.232，查t界值表P＜0.01，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1～4。

2.3T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa α、β1亞基mRNA在血管中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，在8、12周模型組大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCaα亞基mRNA的表達(dá)分別為（1.15±0.13）和（0.92±0.14），分別與對(duì)照組作兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，t值分別為1.9464和1.807，查t界值表P＞0.05，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；β1亞單位mRNA的表達(dá)分別為（0.47± 0.10）和（0.37±0.12），分別與對(duì)照組作兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，t值分別為16.772，16.623，查t界值表P＜0.01，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖5～6。

圖2　8周、12周腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa ɑ蛋白的直方圖表達(dá)

圖3　8周、12周腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa β1蛋白的圖像表達(dá)

圖4　8周、12周腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCaβ1蛋白的直方圖表達(dá)

圖5　8周、12周腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa αmRNA的表達(dá)變化

圖6　8周和12周腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa β1 mRNA的表達(dá)變化

3　討論

糖尿病是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其血管病變主要累及心、腦和外周血管，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病，糖尿病患者發(fā)生相關(guān)血管意外事件的風(fēng)險(xiǎn)是非糖尿病人群的2～4倍［5］，可見2型糖尿病是一種以血管病變?yōu)橹饕滤乐職埐∫虻募膊　?/p>

血管平滑肌BKCa由孔道形成蛋白α亞基和輔助蛋白β亞基組成，現(xiàn)已鑒別的β亞基有β1-β4個(gè)家族成員，其中β1亞基主要分布于動(dòng)脈平滑肌中。生理?xiàng)l件下，BKCa持續(xù)激活可以使細(xì)胞膜超極化，抑制電壓依賴性鈣離子通道的活性，從而導(dǎo)致鈣內(nèi)流減少，對(duì)抗平滑肌收縮，阻斷BKCa可以使平滑肌收縮。所以BKCa通道是調(diào)控血管緊張度的主要離子通道，其通道活性的改變將影響血管的舒縮功能，血管的舒縮異常與通道功能缺陷有關(guān)。近年來有關(guān)糖尿病與BKCa通道的相關(guān)性研究已受到關(guān)注［6］。

WANG等［7］發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠腦血管平滑肌BKCa活性降低，與其β1亞基的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。本研究主要運(yùn)用免疫印跡法和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)力圖從分子水平闡明T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上BKCa通道是否存在異常，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明β1亞基mRNA在T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，而α亞基mRNA表達(dá)無明顯變化；免疫印跡結(jié)果顯示，在T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上BKCa通道的β1亞基蛋白表這兩種實(shí)驗(yàn)技術(shù)所得到的結(jié)果是一致，即在T2DM大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上BKCa通道β1亞基發(fā)生基因和蛋白水平的明顯下調(diào)（P＜0.05），而α亞基在基因和蛋白水平無明顯變化（P＞0.05）。這提示作為血管平滑肌細(xì)胞舒縮功能的重要調(diào)節(jié)因素，BKCa通道的功能與β1亞基密切相關(guān)，β1亞基的低表達(dá)可能是導(dǎo)致T2DM血管并發(fā)癥的一個(gè)重要基礎(chǔ)。

總之，隨著對(duì)糖尿病及其離子通道功能異常認(rèn)識(shí)的深入，人們可能對(duì)糖尿病血管病變的機(jī)制有更新的認(rèn)識(shí)，這將為預(yù)防糖尿病的心血管并發(fā)癥提供新的策略和方法，為糖尿病的綜合治療提供新的靶點(diǎn)，為特異性針對(duì)此環(huán)節(jié)的藥物研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］葉春玲，袁振宇，沈兵.糖尿病小鼠胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)血管收縮劑和內(nèi)皮依賴性舒張劑反應(yīng)的變化［J］.中國病理生理雜志，2005，21（4）: 788-792.

［2］李尚儉，艾文婷，梁磊，等.胰島素抵抗對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞BKCa功能的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2011，32（2）:145-150.

［3］張敏敏.2型糖尿病大鼠血管反應(yīng)性與血管平滑肌上BKCa的相關(guān)性研究［D］.四川:瀘州醫(yī)學(xué)院，2011.

［4］陳嘉，張永斌，桑傳蘭，等.SD大鼠2型糖尿病模型的建立及相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，6:91-95.

［5］中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國2型糖尿病防治指南（2013年版）［J］.中國醫(yī)學(xué)前沿雜志:電子版，2015，3:26-89.

［6］吳賓，陶凌，易甫.糖尿病對(duì)冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的影響［J］.國際心血管病雜志，2015，4:245-247.

［7］WANG Y，ZHANG H T，SU X L，et al，Experimental diabetes mellitusdown-regulateslarge-conductanceCa2+activatedK+channels in cerebral artery smooth muscle and alters functional conductance［J］.Curr Neurovasc Res，2010，7（2）:75-84.

（張蕾編輯）

Expression changes of α，β1 subunit protein and mRNA of largeconductance calcium-activated potassium channels in mesenteric arterial smooth muscle cells of type 2 diabetes mellitus rats*

Hong-xia Duan，Li Ge，Chuan-bao Cui，Zhi-gui Wu，Mei-juan Chen
（College of Pharmacy，Sichuan Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

Objective To explore the expression changes of α and β1 subunit protein and mRNA of the largeconductance calcium-activated potassium channels（BK Ca）in mesenteric arterial smooth muscle cells of type 2 diabetes mellitus（T2DM）rats，and to elucidate the specific mechanism of BK Ca channel activity in T2DM mesenteric arterial smooth muscle cells from the molecular level，and to provide new targets for the comprehensive treatment of T2DM and the experimental basis for the specific needle to the drug research and development.Methods After one-month high glucose and high fat diet，SD rats were treated with intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ 25 mg/kg）to establish a rat model of type 2 diabetes mellitus.Western blot and real-time PCR were used to detect α and β1 subunit protein and mRNA expression levels.Results Western blot showed that α subunit protein expressions of mesenteric artery BK Ca channel in model group at 8 and 12 weeks were（1.093±0.251）and（0.921±0.153）respectively，and had no statistical significance compared with the control group（P＞0.05）.Expressions of β1 subunit protein in model group at 8 and 12 weeks were（0.334±0.200）and（0.193±0.310）respectively.There was statistical significance compared with the control group（P＜0.05）.Real-time quantitative PCR results showed that α subunit mRNA expressions of mesenteric artery BK Ca channel in model group at 8 and 12 weeks were（1.15±0.03）and（0.92±0.04），and had no statistical significance compared with the control group（P＞0.05）.Expressions of β1 subunit mRNA were（0.47±0.10）and（0.37±0.12），which were significantly reduced comparing with the control group（P＜0.05）.Conclusions Expressions of β1 subunit protein and mRNA of BK Ca channel in mesenteric artery are decreased significantly in T2DM rats at 8 and 12 weeks.

type 2 diabetes mellitus；large-conductance calcium-activated potassium channels；mesenteric artery；α，β1 subunit

R-332；R587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.001

1005-8982（2016）16-0001-05

2016-03-25

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目基金（No：11ZA242）［通信作者］陳美娟，E-mail：chenmeijuan1969@sina.com