S100A11-RAGE通過(guò)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝

趙曉，黃飛麒，姚乃婕，陳揚(yáng)聲

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 正骨科，廣東 廣州 510080）

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S100A11-RAGE通過(guò)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝

趙曉，黃飛麒，姚乃婕，陳揚(yáng)聲

（廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 正骨科，廣東 廣州 510080）

目的探討S100A11-RAGE通過(guò)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)控。方法不同濃度的外源性S100A11（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml）與小鼠軟骨細(xì)胞孵育48 h，檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)，以篩選作用最顯著的S100A11濃度。加入不同濃度Anti-P38（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml）與小鼠軟骨細(xì)胞預(yù)孵育12 h后，再加入作用最強(qiáng)的外源性S100A11孵育（10μg/ml）48 h，檢測(cè)MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)。結(jié)果小鼠軟骨細(xì)胞MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)隨外源性S100A11濃度的增加而增加，且明顯高于對(duì)照組；而Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)隨外源性S100A11濃度的增加而減少，且明顯低于對(duì)照組。加入Anti-P38預(yù)處理后，MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)均明顯低于S100A11單獨(dú)處理組，而Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯高于S100A11單獨(dú)處理組。結(jié)論外源性S100A11通過(guò)與RAGE結(jié)合，并經(jīng)P38MARK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，其機(jī)制可能與通過(guò)P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)，并降低Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。

S100A11-RAGE；P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；軟骨細(xì)胞肥大；細(xì)胞外基質(zhì)代謝

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種慢性進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而顯著增加，流行病學(xué)研究顯示，55歲以上中老年人OA發(fā)病率為44%～70%，而65歲以上人群中男性發(fā)病率為60%，而女性達(dá)70%［1］。OA的病因機(jī)制較為復(fù)雜，受年齡、遺傳、創(chuàng)傷及代謝等多種因素的影響，而年齡是引起OA發(fā)病和進(jìn)展的最重要的危險(xiǎn)因素之一［2］。隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，OA的發(fā)病呈日益增高的趨勢(shì)，所以對(duì)于OA的防治具有十分重要的意義。有研究認(rèn)為，OA是由于多種炎癥介質(zhì)和基質(zhì)成分等生物性因素，通過(guò)與其受體特異性地結(jié)合將信號(hào)傳遞進(jìn)細(xì)胞核，啟動(dòng)炎癥基因和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝失調(diào)［3］。

已有研究證實(shí)，晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）及其受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）能通過(guò)直接或經(jīng)由不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病腎病、骨質(zhì)疏松、阿爾茨海默病以及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展［4］。但RAGE在OA的發(fā)生、發(fā)展中起到何種作用，尚不十分清楚，有研究認(rèn)為這可能與AGEs/RAGE觸發(fā)活化促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)［5］。P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是MAPK途徑的一種，研究顯示，P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與軟骨細(xì)胞表型維持和細(xì)胞分化，軟骨細(xì)胞的肥大、鈣化和凋亡，軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的合成以及炎癥因子的產(chǎn)生等密切相關(guān)。S100蛋白被認(rèn)為是一組鈣離子傳感器，通過(guò)鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在細(xì)胞增殖、分化、黏附、運(yùn)動(dòng)、基因表達(dá)及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其家族成員S100A4、S100A6和S100A13等已被證實(shí)可促進(jìn)骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移［6-8］。S100蛋白的另一家族成員S100A11則參與多種細(xì)胞內(nèi)的活性調(diào)節(jié)［9］，在胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用已有較多研究［9-11］。研究顯示，當(dāng)軟骨細(xì)胞受到白細(xì)胞介素1等促炎癥因子刺激時(shí)S100A11會(huì)釋放到軟骨細(xì)胞外與RAGE結(jié)合，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大。本研究旨在通過(guò)外源性S100A11及P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)抑制劑，作用于小鼠軟骨細(xì)胞后對(duì)MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)的影響，以探明S100A11-RAGE和P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)控，旨在揭示OA的發(fā)病機(jī)制，為研發(fā)有效的防治藥物開辟新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

RMIP 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Hyclone公司，美國(guó)），Ⅱ型膠原蛋白酶（Gibico公司，美國(guó)），S100A11、anti-RAGE、anti-P38（Santa Cruz公司，美國(guó)），MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型膠原蛋白單克隆抗體、非免疫性山羊血清、熒光二抗（Santa Cruz公司，美國(guó)），TRIzol（Invitro-gen公司，美國(guó)），PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（ABI Applied Biosystems公司，美國(guó)）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1小鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)無(wú)菌條件下，麻醉后取小鼠髖關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)處軟骨，剪成1 mm3小塊，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入0.25%的胰蛋白酶，5%二氧化碳CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育1h，棄去胰蛋白酶，加入0.2%的Ⅱ型膠原蛋白酶，繼續(xù)孵育消化。2 h后，收集消化液，1 000 r/min離心5 min，所得細(xì)胞接種于含10% FBS的RMIP 1640P培養(yǎng)基，5%二氧化碳CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為1～3代。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)在小鼠軟骨細(xì)胞中加入不同濃度的外源性 S100A11（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml），孵育48h后，檢測(cè)MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)，以篩選作用最顯著的S100A11濃度。

在小鼠軟骨細(xì)胞中加入Anti-P38（0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml），孵育12 h后，再加入前面篩選出的作用最顯著的SA00A11濃度（10μg/ml）。孵育48 h后，檢測(cè)MMP-13和ADAMTS-5以及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)，以觀察阻斷P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的影響。

1.2.3PCR檢測(cè)MMP-13和ADAMTS-5 mRNA表達(dá)提取總細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照文獻(xiàn)［4］，設(shè)計(jì)MMP-13、ADAMTS-5以及G3PDH的引物，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。MMP-13正向引物：5'-CTTGATGCCATTACCAGTC-3'，反向引物：5'-GGTTGGGAAGTTCTGGCCA-3'。ADAMTS-5正向引物：5'-TATGACAAGTGCGGAGTATG-3'，反向引物：5'-TTCAGGGCTAAATAGGCAGT-3'。GAPDH正向引物：5'-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3'，反向引物：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGG-3'。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s、共32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

1.2.4蛋白免疫印跡法（Western b l ot） 檢測(cè)MMP-13和ADAMTS-5蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，PBS淋洗后加入放射免疫沉淀法（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液裂解30 min，刮離細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管，20 000 r/min離心30 min，取上清液置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩７謩e以50μg等量總蛋白上樣，經(jīng)8%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，TBST淋洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗，4℃孵育過(guò)夜；TBST淋洗，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的熒光二抗，37℃孵育1 h；TBST淋洗，DAB顯色。

1.2.5免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的小鼠軟骨細(xì)胞按1×105的密度接種于6孔板中，將2%多聚賴氨酸包被處理的玻片置于孔中以進(jìn)行細(xì)胞爬片；培養(yǎng)24 h后，待細(xì)胞緊貼玻片，取出玻片，PBS淋洗，95%酒精固定；PBS淋洗，加過(guò)氧化酶阻斷劑，37℃孵育30 min；PBS淋洗，加非免疫性山羊血清，37℃封閉30 min；PBS淋洗，加一抗，4℃孵育過(guò)夜；PBS淋洗，加二抗，37℃孵育30 min；PBS淋洗，DAB染色，蘇木精復(fù)染，95%酒精脫水，透明，封片，每張切片任選5個(gè)視野，采用Image Pro plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，測(cè)量每張切片陽(yáng)性染色灰度值［5］。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，并行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度S100A11對(duì)MMP-13和ADAMTS-5表達(dá)的影響

不同濃度外源性S100A11孵育48 h后，小鼠軟骨細(xì)胞MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及其蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)（P=0.031，0.022和0.009），且其表達(dá)呈濃度依賴性增加，以S100A11為10μg/L時(shí)表達(dá)最強(qiáng)。見圖1。

2.2不同濃度S100A11對(duì)Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)的影響

Ⅱ型膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色灰度值隨S100A11濃度增大而增大，且明顯低于對(duì)照組（P= 0.000）（見圖2A）；Ⅹ型膠原蛋白灰度值隨S100A11濃度增大而減小，且明顯高于對(duì)照組（P=0.026）（見圖2B）。提示隨S100A11濃度增大，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)逐漸減少，明顯低于對(duì)照組（P=0.007）；而Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)逐漸增加，明顯高于對(duì)照組（P=0.018）。

圖1　PCR和Western blot檢測(cè)不同濃度S100A11處理后小鼠軟骨細(xì)胞MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)，條帶圖下面對(duì)應(yīng)的是條帶灰度值的柱狀圖

圖2　免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析不同濃度S100A11處理對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ和Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)的影響，右圖為對(duì)應(yīng)灰度值的柱狀圖

2.3Anti-P38對(duì)MMP-13和ADAMTS-5表達(dá)的影響

不同濃度 Anti-P38孵育 12 h后，再加入SA00A11（10.00μg/ml）孵育48 h，檢測(cè)MMP-13和ADAMTS-5的表達(dá)。結(jié)果顯示，MMP-13和ADAMTS-5的mRNA及蛋白的表達(dá)隨Anti-P38濃度的增加而減少，且明顯低于S100A11單獨(dú)處理組（P=0.004）。見圖3。

2.4Anti-P38對(duì)Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)的影響

不同濃度 Anti-P38孵育 12 h后，再加入SA00A11（10.00μg/ml）孵育48 h，檢測(cè)Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)隨Anti-P38濃度的增加而減少，且明顯低于S100A11單獨(dú)處理組（P=0.001）；Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)隨Anti-P38濃度的增加而增加，且明顯高于S100A11單獨(dú)處理組（P=0.002）。見圖4。

圖3　Anti-P38對(duì)MMP-13和ADAMTS-5 mRNA及相應(yīng)蛋白表達(dá)的影響

圖4　Anti-p38對(duì)Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)的影響

3　討論

OA的病理生理過(guò)程主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分解代謝明顯大于合成代謝，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)進(jìn)行性丟失。OA發(fā)病時(shí)，各種基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)和含量明顯增高，加劇細(xì)胞軟骨基質(zhì)的分解，其中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-13對(duì)于Ⅱ型膠原蛋白具有強(qiáng)烈的裂解作用，在OA的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用［12］。ADAMTS-5是細(xì)胞軟骨基質(zhì)蛋白聚集蛋白聚糖Aggrccan的降解酶，研究發(fā)現(xiàn)，OA患者骨關(guān)節(jié)中存在Aggrccan被大量降解破壞的現(xiàn)象［13］。Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖Aggrccan是軟骨基質(zhì)中的主要成分，Ⅱ型膠原蛋白是構(gòu)成纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)的主體，具有很強(qiáng)的抗張性，而聚集蛋白聚糖Aggrccan對(duì)于關(guān)節(jié)的抗壓力和分散負(fù)荷等具有重要作用，兩者的表達(dá)和凋亡情況是反應(yīng)軟骨退變程度的最好指標(biāo)［14］。當(dāng)軟骨細(xì)胞分化到增生末期時(shí)，Ⅹ型膠原蛋白的合成達(dá)到頂峰，提示Ⅹ型膠原與軟骨骨化相關(guān)；而在OA中，觀察到軟骨基質(zhì)退化后期Ⅹ型膠原蛋白表達(dá)的增加［15］。所以本研究選擇MMP-13、ADAMTS-5及Ⅱ型和Ⅹ型膠原蛋白作為反映OA病變的主要檢測(cè)指標(biāo)。

年齡是引起OA發(fā)病和進(jìn)展的最重要的危險(xiǎn)因素之一。有研究認(rèn)為，隨著年齡的增加體內(nèi)大量AGEs的產(chǎn)生和堆積是導(dǎo)致和加速年齡相關(guān)性O(shè)A病變的主要原因之一［16］。其機(jī)制可能與AGEs與RAGE特異性結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)。

RAGE配體除了AGEs外還包括β淀粉樣蛋白、高遷移率族蛋白1等等，而S100A11也是RAGE的配體。為探明S100A11-RAGE和P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)小鼠軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝的調(diào)控，本研究首先采用不同濃度的外源性S100A11作用于體外培養(yǎng)的小鼠軟骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著S100A11濃度的增加，小鼠軟骨細(xì)胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)，而Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)卻逐漸減少。研究證實(shí)，外源性S100A11能通過(guò)與RAGE結(jié)合調(diào)控小鼠軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)代謝。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠軟骨細(xì)胞MMP-13、ADAMTS-5和Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)隨Anti-P38濃度的增加而顯著減少，而Ⅹ型膠原蛋白的表達(dá)卻隨Anti-P38濃度的增加而增加。提示P38 MARK抑制劑Anti-P38可以顯著抑制由外源性S100A11誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞肥大和基質(zhì)代謝增加。

綜上所述，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠軟骨細(xì)胞，初步論證外源性S100A11通過(guò)與RAGE結(jié)合，并經(jīng)P38MARK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞功能障礙，研究旨在揭示OA的發(fā)病機(jī)制，為研發(fā)有效的防治藥物開辟新的思路。

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（張蕾編輯）

Regulation ofS100A11-RAGEon hypertrophy and extracellular matrix metabolism of chondrocytes byp38MAPK signal pathway in mice

Xiao Zhao，F(xiàn)ei-qi Huang，Nai-jie Yao，Yang-sheng Chen
（Department of Bone Orthopedics，the First Affiliated Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong 510080，China）

Objective To investigate the regulation ofS100A11-RAGEon the hypertrophy and extracellular matrix metabolism of chondrocytes byP38MAPKsignal pathway in mice.Methods Different concentrations of exogenousS100A11and cartilage cells were incubated for 48 h.Expressions ofMMP-13，ADAMTS-5，type II and type X collagen were detected by PCR，Western Blot and immunohistochemistry，respectively.Anti-P38 and cartilage cells were incubated for 12 h，and then incubated 48 h after exogenous S100A11 was added.Expressions of MMP-13，ADAMTS-5，type II and type X collagen were detected.Results The expression ofMMP-13，ADAMTS-5 and type X collagen of cartilage cells increased with the increase of the concentration of exogenous S100A11，and was significantly higher than that of the control group.The expression of typeⅡ collagen decreased with the increase of the concentration of exogenousS100A11，and was significantly lower than that of the control group.After the addition of Anti-P38，the expressions ofMMP-13，ADAMTS-5and type X collagen were significantly lower than that of S100A11 alone treatment group，and the expression of typeⅡcollagen was significantly higher than that of S100A11alone treatment group.ConclusionsS100A11-RAGEcan regulate the hypertrophy and extracellular matrixdegradation of chondrocytes in mice，and the mechanism may be related to the inducedMMP-13，ADAMTS-5and type X collagen expression and reduce typeⅡcollagen expression through the P38 MAPK signal pathway.

S100A11-RAGE；P38MAPK signaling pathway；chondrocyte hypertrophy；extracellular matrix metabolism

R684

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.002

1005-8982（2016）16-0006-06

2016-01-11