RNAi沉默c-Met基因對人腦膠質瘤U251細胞增殖及侵襲能力的影響

段韜，顧應江，張彪

（1.四川省宜賓市第一人民醫院 神經外科，四川 宜賓 644000；2.西南醫科大學附屬中醫院 神經外科，四川 瀘州646000；3.重慶醫科大學附屬第一大足醫院 神經外科，重慶 402360）

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RNAi沉默c-Met基因對人腦膠質瘤U251細胞增殖及侵襲能力的影響

段韜1，顧應江2，張彪3

（1.四川省宜賓市第一人民醫院 神經外科，四川 宜賓 644000；2.西南醫科大學附屬中醫院 神經外科，四川 瀘州646000；3.重慶醫科大學附屬第一大足醫院 神經外科，重慶 402360）

目的探討RNAi沉默c-Met基因對人腦膠質瘤U251細胞增殖及侵襲能力的影響。方法分別構建3種靶向c-Met基因的短發卡RNA（shRNA）序列，以脂質體轉染的方式導入人腦膠質瘤U251細胞，并篩選出穩定表達的細胞株。采用PCR和Western blot檢測c-Met-shRNA轉染后U251細胞c-Met的表達情況，以篩選出可有效沉默c-Met基因的shRNA。c-Met基因沉默后，采用MTT法和流式細胞術檢測U521細胞增殖情況，采用Transwell法和細胞劃痕實驗檢測U251細胞侵襲和遷移情況，采用裸鼠荷瘤實驗研究U251細胞體內成瘤性。結果成功構建可有效沉默c-Met基因的c-Met-shRNA1。沉默c-Met后，c-Met mRNA以及蛋白的表達均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；而且可明顯抑制U251細胞的增殖、侵襲、遷移以及體內成瘤能力，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人腦膠質瘤U251細胞的增殖、侵襲、遷移以及體內成瘤能力。

RNAi沉默；c-Met；人腦膠質瘤U251細胞

人腦膠質細胞瘤是中樞神經系統原發性腫瘤，約占全部中樞神經系統原發性腫瘤的32%，約占中樞神經系統高度惡性腫瘤的81%［1-2］。腦膠質細胞瘤的預后極差，患者5年存活率僅為20%～30%，高度惡性膠質瘤患者的存活期僅為9～12個月［3］。高度惡性膠質瘤難以治療的主要原因是由于其所具有的過度增殖、抗凋亡以及較強的侵襲、遷移能力等惡性生物學行為［4］。研究發現，c-Met基因編碼的產物在人腦膠質細胞瘤中高表達，與腫瘤的增殖和侵襲等惡性生物學行為密切相關［5-6］。因此，本研究采用RNAi技術沉默人腦膠質瘤U251細胞c-Met基因的表達，以探討沉默c-Met基因對人腦膠質瘤U251細胞增殖及侵襲能力的影響，現報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人腦膠質瘤U251細胞（中國科學院上海細胞庫），RPMI 1640培養基、胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Invitrogen，美國），EcoRⅠ和XhoⅠ限制性內切酶、T4 DNA連接酶（New England Biolabs公司，英國），Opti-MEM培養基和Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國），Trizol（Invitrogen公司，美國），逆轉錄試劑盒（ABI Applied Biosystems公司，美國），PCR試劑盒（TaKaRa公司，日本）；BALB/C-nu/nu裸鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養傳代人腦膠質瘤U251細胞接種于含10%FBS、100 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基，37℃，5%二氧化碳培養箱中培養。細胞融合到85%左右時，用0.25%胰酶消化、傳代。

1.2.2靶向c-MetshRNA構建根據c-Met基因信息，由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成3條短發夾RNA（small hairpin RNA，shRNA），分別為c-Met-shRNA1、c-Met-shRNA2和 c-Met-shRNA3（內含限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點），Blast比對與人類其他基因編碼序列無同源性。退火形成雙鏈DNA，經T4 DNA連接酶與經過EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后的pGPU6/GFP/Neo載體連接，以構建干擾c-Met表達的重組質粒。c-Met-shRNA重組質粒轉化感受態DH5α大腸桿菌，并轉移至含氨芐霉素抗性的瓊脂培養基上培養，采用藍白斑法篩選陽性克隆并送呈上海吉瑪制藥技術有限公司測序。見表1。

1.2.3靶向c-Met-shRNA細胞轉染人腦膠質瘤U251細胞接種于6孔板，每孔細胞1×105，融合達到70%時，隨機分為5組開始轉染實驗。A液：1μg c-Met-shRNA用50μl OPTI-MEM稀釋，靜置10 min。B液：2μl Lipofectamine 2000用50μl OPTIMEM稀釋，靜置10 min。混合A、B液，靜置20 min。取出培養的U251細胞，棄去原培養液并用無血清培養液漂洗，再加入1 ml無血清培養液和A/B混合液，孵育6 h。6 h后棄去轉染液，更換為完全培養基。培養72 h后，觀察細胞轉染情況。

1.2.4PCR檢測c-Met表達轉染72 h后，Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA。采用Primer 5.0軟件，參照文獻［7］，設計c-Met和G3PDH引物，由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。c-Met正向：5'-ACAGTGGCATGTCAACATCGCT-3'，c-Met反向：5'-GCTCGGTAGTCTACAGATTC-3'，656 bp。G3PDH正向：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反向：5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，1 000 bp。PCR反應條件：首先，95℃預變性10 min；緊接著，95℃變性30 s，55℃退火1 min，68℃延伸1 min，共24個循環；最后，68℃延伸10 min。產品經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，Gene Tools軟件分析。

1.2.5Western blot檢測c-Met蛋白表達轉染72h后，收集細胞，PBS淋洗，置于冰浴，加入RIPA裂解液裂解30 min，刮離細胞轉移至離心管，4℃，12 000 r/min離心5 min，取上清置入-20℃冰箱保存備用。樣品蛋白經二喹啉甲酸蛋白分析試劑盒定量，置入-20℃冰箱冷凍保存備用。50μg總蛋白上樣，經10%SDS-PAGE電泳分離，轉至硝酸纖維膜；TBST淋洗3×10 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入c-Met一抗，4℃孵育過夜；TBST淋洗3×10 min，加入HRP標記的兔抗鼠二抗，37℃孵育1 h；TBST淋洗3×10 min，DAB顯色。

1.2.6MTT檢測U251細胞增殖能力人腦膠質瘤U251細胞，以1×104孔的密度接種于24孔板培養。24 h后，每孔加入200μl的5 mg/μl的MTT的PBS溶液，37℃，5%二氧化碳孵育。4 h后，每孔加入100μl的二甲基亞砜，室溫慢速振搖15 min，以充分溶解結晶。酶標儀560 nm測定各組的光密度值（optical density，OD）并繪制曲線。

表1　c-Met-shRNA序列

1.2.7Transwell檢測U251細胞侵襲能力以1× 109/L的密度將細胞接種于自帶基質膠的Transwell小室上室，每室200μl；Transwell小室下室加入600μl含10%FBS、100 IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基；37℃，5%二氧化碳孵育12 h，棉簽擦去靠近基底膜內室的細胞，另一面的細胞經10%甲醇固定30 min，PBS洗滌1次，結晶紫染色20 min，PBS洗滌1次，顯微鏡下觀察細胞并記數。

1.2.8細胞劃痕實驗檢測U251細胞遷移能力采用單層細胞劃痕實驗檢測U251細胞遷移能力。以2×105的密度將細胞接種于6孔板，融合達90%時，在培養板內側底部沿直線劃痕，繼續孵育24 h。24 h后觀察細胞劃痕愈合情況。遷移能力=0 h劃痕距離-24 h劃痕距離。

1.2.9裸鼠體內荷瘤實驗收集培養的U251細胞，經生理鹽水重懸；裸鼠腹部常規消毒后，皮下注射0.5ml重懸的U251細胞；每5 d觀察移植瘤的生長情況，并測量瘤體大小。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較先用One-Way ANOVO方差分析，再用SNK檢驗進行組內兩兩比較；計數資料用率（%）表示，采用χ2檢驗。取雙側a=0.05為檢測水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1靶向c-Met-shRNA構建

構建的重組質粒c-Met-shRNA1，c-Met-shRNA 2和c-Met-shRNA3經上海吉瑪制藥技術有限公司測試證實構建成功。

2.2靶向c-Met-shRNA轉染篩選

各組轉染效率分別為：未轉染組0.0%，空質粒組75.3%，c-Met-shRNA1組85.8%；c-Met-shRNA2組71.2%，c-Met-shRNA3組67.4%，提示c-MetshRNA3的轉染效率最高，可用于后續實驗。PCR檢測顯示，各轉染組細胞c-MetmRNA表達均顯著低于未轉染組和空質粒組，c-Met-shRNA1組（0.11± 0.02）較c-Met-shRNA2組（0.26±0.05）和c-MetshRNA3組（0.20±0.03）明顯降低，差異有統計學意義（F=13.500，P＜0.05；q=7.300，P＜0.05；q=4.380，P＜0.05）。Western blot檢測顯示，各轉染組細胞c-Met蛋白表達均顯著低于未轉染組和空質粒組，且c-Met-shRNA1組（0.21±0.05）較c-Met-shRNA2組（0.44±0.07）和c-Met-shRNA3組（0.34±0.06）明顯降低，差異有統計學意義（F=10.882，P＜0.05；q= 6.579，P＜0.05；q=3.719，P＜0.05）。提示c-Met-shRNA可沉默人腦膠質瘤U251細胞c-Met基因和蛋白的表達，且以c-Met-shRNA1的沉默效果最好。見圖1。

圖1　PCR和Western blot檢測C-Met基因mRNA和蛋白質的相對表達

2.3U251細胞增殖能力的影響

MTT檢測結果顯示，從第24 h開始，c-MetshRNA1組OD值（0.21±0.02）明顯低于未轉染組（0.33±0.03）和空質粒組（0.32±0.03），差異有統計學意義（F=18.136，P＜0.05；q=7.675，P＜0.05；q=7.036，P＜0.05）。c-Met-shRNA1組第36 h（F=46.610，P＜0.05；q=10.776，P＜0.05；q=12.650，P＜0.05），48 h（F= 169.463，P＜0.05；q=23.426，P＜0.05；q=21.552，P＜0.05）和72 h（F=229.188，P＜0.05；q=25.548，P＜0.05；q=26.847，P＜0.05）的OD值均顯著低于未轉染組和空質粒組。見圖2和表2。

流式細胞術測定細胞周期顯示，c-Met-shRNA1組G1期細胞比例（68.33%）顯著高于未轉染組（55.15%）和空質粒組（56.71%），差異有統計學意義（χ2=40.833，P＜0.05）；而c-Met-shRNA1組S期細胞比例（10.85%）顯著高于未轉染組（30.62%）和空質粒組（31.53%），差異有統計學意義（χ2=16.764，P＜0.05），見圖3。提示RNAi沉默c-Met基因可顯著抑制人腦膠質瘤U251細胞的增殖。

2.4U251細胞侵襲遷移能力的影響

Transwell檢測顯示，c-Met-shRNA1組穿膜細胞數目（10.98±3.21）顯著低于未轉染組（34.53± 4.31）和空質粒組（33.79±4.27），差異有統計學意義（F=34.240，P＜0.05；q=10.293，P＜0.05；q=9.970，P＜ 0.05），見圖4。提示RNAi沉默c-Met基因導致人腦膠質瘤U251細胞的侵襲能力下降

細胞劃痕實驗顯示，c-Met-shRNA1組細胞遷移距離顯著低于未轉染組和空白質粒組，差異有統計學意義（F=27.131，P＜0.05；q=9.312，P＜0.05；q=8.903，P＜0.05），見圖5。提示RNAi沉默c-Met基因導致人腦膠質瘤U251細胞的遷移能力下降。

2.5對裸鼠體內成瘤的影響

裸鼠體內荷瘤實驗顯示，接種轉染組和空質粒組細胞的裸鼠，10 d左右即形成明顯可見的腫瘤結節；而接種c-Met-shRNA1轉染細胞的裸鼠在15 d左右才形成腫瘤結節。腫瘤生長曲線顯示，c-MetshRNA1組裸鼠腫瘤體積接種后的10 d（F=7.010，P＜0.05；q=4.511，P＜0.05；q=4.657，P＜0.05）、15 d（F=7.749，P＜0.05；q=4.767，P＜0.05；q=4.874，P＜0.05）、20 d（F=6.343，P＜0.05；q=4.361，P＜0.05；q=4.364，P＜0.05）、25 d（F=6.268，P＜0.05；q=4.316，P＜0.05；q=4.356，P＜0.05）和30 d（F=6.987，P＜0.05；q= 4.739，P＜0.05；q=4.398，P＜0.05），明顯小于同一時段的未轉染組和空質粒組。見圖6。

圖2　MTT檢測c-Met-shRNA1對U251細胞增殖的影響

表2　各組不同時間點OD值 （±s）

表2　各組不同時間點OD值 （±s）

注與同一時期的未轉染組和空質粒組比較，P＜0.05

圖3　流式細胞術檢測c-Met-shRNA1對U251細胞周期的影響

圖4　Transwell檢測c-Met-shRNA1對U251細胞侵襲能力的影響 （×400）

圖5　細胞劃痕實驗檢測c-Met-shRNA1對U251細胞遷移能力的影響 （×100）

圖6　裸鼠體內成瘤生長情況

3　討論

由于人腦膠質瘤的惡性度高、預后差和死亡率高，因此，有效的診斷和治療對于延緩患者生命具有重要意義。大量研究證實，c-Met基因編碼的蛋白在人腦膠質細胞瘤中高表達，與腦膠質瘤的惡性生物學行為密切相關，也是影響臨床治療效果的主要因素［8］。c-Met基因位于人類第七號染色體7q31，其編碼的產物蛋白是酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTKs）家族成員之一，可以特異性識別并結合肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）［9］。HGF是由間質細胞分泌的，研究發現它有促進多種上皮細胞（包括腎小管細胞、腸道上皮細胞、乳腺上皮細胞和支氣管上皮細胞等）以及間質細胞增殖和形態發生的功能，故而在胚胎發育、組織分化和促進傷口愈合方面發揮重要作用［10-11］。然而在惡性腫瘤中，HGF與c-Met基因編碼的酪氨酸激酶受體特異性結合后，會引起c-Met酪氨酸自身磷酸化，激活c-Met受體酪氨酸激酶活性，并且為下游信號分子提供磷酸化區域，包括生長因子受體結合蛋白2（growth factor receptor bound protein-2，Grb-2），信號傳導和轉錄激活子3（signal transducer and activator of transcription-3，STAT-3），以及P85-磷脂酰肌醇-3激酶（P85-PI3 kinase，P85-PI3K）等，該信號分子進一步誘發一系列信號傳導通路，最終傳至細胞核內，介導c-Met基因激活導致的腦膠質瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等生物學行為［12-13］。有研究證實，HGF/c-Met信號通路，通過上調腫瘤細胞中的纖溶酶原激活因子抑制因子1和尿激酶型纖溶酶原激活物等促進腫瘤細胞的侵襲和遷移［14］。CHU等［15-16］通過構建shRNA干擾腦膠質瘤U251細胞，下調c-Met蛋白表達，可減慢甚至停止細胞的增殖周期，增加細胞凋亡，抑制機體對HGF刺激的反應，提示或可通過特異性抑制HGF/c-Met信號通路達到治療腦膠質細胞瘤的目的。為了探討c-Met基因對腦膠質瘤U251細胞生物學行為的影響，本實驗首先構建了靶向c-Met基因的shRNA，并轉染U251細胞，繼而以PCR和Western blot法篩選出可有效沉默c-Met基因的shRNA進行后續實驗。實驗中shRNA干擾下調U251細胞中c-Met的表達，進一步研究觀察U251細胞增殖、侵襲和遷移能力以及體內成瘤能力的變化。MTT和流式細胞術結果顯示，下調c-Met后U251細胞的增殖受到明顯抑制；Transwell和細胞劃痕實驗顯示下調c-Met明顯抑制U251細胞侵襲和遷移能力；裸鼠體內荷瘤實驗顯示，下調c-Met后，U251細胞體內成瘤能力受到抑制。綜上所述，RNAi沉默c-Met基因可有效抑制人腦膠質瘤U251細胞的增殖、侵襲、遷移以及體內成瘤能力。

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（張蕾編輯）

Effect of RNAi silencingc-Metgene on proliferation and invasion ability of human gliomaU251cell

Tao Duan1，Ying-jiang Gu2，Biao Zhang3
（1.Department of Neurosurgery，the First People's Hospital of Yibin，Yibin，Sichuan 644000，China；2.Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China；3.Department of Neurosurgery，the First Affiliated Dazu Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 402360，China）

Objective To investigate the effect of RNAi silencingc-Metgene on the proliferation and invasion ability of human gliomaU251cell.Methods Three kinds of short hairpin RNA（shRNA）targetingc-Metgene were constructed.All of theshRNAswere transfected intoU251cell by liposome transfection，in order to screen out the stable expression cell line.The expression of c-Met inU251cell was detected by PCR and Western Blot，in order to screen out the effective shRNA.The proliferation ofU251cell was detected by MTT assay and flow cytometry.The invasion and migration ofU251cell was detected by transwell assay and cell scratch.Results The shRNA targeting c-Metgene was successful constructed.The expression ofc-Metwas significantly decreased after c-Met gene was silenced，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The proliferation，invasion，migration and tumorigenicity ofU251cell was inhibited after silencingc-Metgene，the difference was statistically significant（P＜0.05）. Conclusions RNAi silencingc-Metgene can effectively inhibit the proliferation，invasion，migration and tumorigenicity of human glioma U251 cell.

RNAi silencing；c-Met；human glioma cell U251

R-332；R739.41

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.003

1005-8982（2016）16-0012-06

2015-11-12

顧應江，E-mail：asdd1688@126.com；Tel：15883048550