五味子甲素衍生物聯苯雙酯的紫外防護作用及機制研究*

曹波，王娟娟，陳詩雅，路婷婷，陳虹，齊莉

（1.武警后勤學院，天津 300309；2.天津醫科大學，天津 300070）

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五味子甲素衍生物聯苯雙酯的紫外防護作用及機制研究*

曹波1，王娟娟2，陳詩雅1，路婷婷1，陳虹1，齊莉1

（1.武警后勤學院，天津 300309；2.天津醫科大學，天津 300070）

目的探討聯苯雙酯（DDB）對中波紫外線（UVB）的防護作用及其相關機制研究，為臨床應用提供理論依據。方法DDB和維生素C對照檢測五味子甲素衍生物DDB對超氧陰離子（O2-）的清除率。MTT法測定DDB、UVB對人永生化角質形成細胞（HaCaT）、人真皮成纖維細胞（FB）生長的影響及DDB對UVB的防護作用。通過Giemsa染色，從形態學上觀察DDB對UVB損傷的防護作用。激光共聚焦觀察活性氧簇（ROS）及檢測其熒光強度。結果實驗結果表明，相同濃度DDB具有強的清除O2-的能力；DDB對HaCaT、Fb細胞無毒性且可防護UVB損傷。Giemsa染色后，形態學上發現DDB可以明顯抑制細胞的凋亡。DDB可抑制HaCaT細胞外ROS的生成。結論五味子甲素衍生物DDB對UVB有明顯的防護作用，DDB作用機制是通過其抗氧化活性抑制UVB輻射引起的氧化應激及細胞凋亡等，起到紫外線防護作用，有望開發成為有效的抗氧化劑和紫外防護產品。

五味子甲素衍生物聯苯雙酯；機制研究；UVB

聯苯雙酯（dimethyl dicarboxylate biphenyl，DDB）是研究五味子過程中發現的一種重要的醫藥中間體［1］，它是一種單一木脂素化合物，可治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉氨酶升高，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、保肝及抑制血小板活化因子等生理功能［2］。

隨著環境污染日漸加重，進而臭氧層破壞導致的紫外線損傷越來越嚴重，皮膚長期暴露在紫外線下可以引起皮膚損傷，出現皮膚光老化甚至出現皮膚癌變和其他皮膚病變［3］。皮膚接受過多的紫外線輻射，皮膚組織細胞會產生氧化應激，產生過量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），破壞細胞膜的完整性和細胞內的抗氧化系統，進一步引起細胞炎癥、細胞凋亡及腫瘤的形成［4-5］。紫外線分為3個波段：長波紫外線（ultraviolet radiation A，UVA）320～400 nm；中波紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）275～320 nm；短波紫外線（ultraviolet radiation C，UVC）230～275 nm。其中UVB又稱作曬斑紫外線，其對皮膚的損傷最大［6-7］。預防紫外線光老化及有紫外線引起的皮膚病是重要措施，因此本實驗對DDB的抗UVB作用進行了體外實驗研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株人永生化角質形成細胞（HaCaT human keratinocyte cell line，HaCaT）和人黑色素細胞為四軍醫大學贈與，人真皮成纖維細胞（Human dermal fibroblasts，Fb）購自北京協和細胞庫。

1.1.2主要試劑DDB由中國人民武裝警察部隊后勤學院生藥學教研室提供，體外實驗用DMSO配制。DMEM、RPMI1640購自天潤善達公司，胎牛血清（FBS）為中國醫學科學院血研所科技公司產品，二甲基亞砜（DMSO）、牛血清白蛋白（BSA）、溴化四氮唑藍（MTT）均購自Sigma公司，胰酶（Trypsin）、Tris、Tris Base購自GIBECO公司，Triton X-100由香港FARCO公司提供，Giemsa染液為Serva公司產品。HE染液、一抗稀釋液購自碧云天生物技術研究所，其他常規試劑及溶劑均由北京化學試劑研究所、北京化工廠及北京雙環化學試劑廠提供。

1.1.3主要儀器MCO-AC型二氧化碳細胞培養箱購買于SANYO公司，JJT-900/1300超凈工作臺購買于北京半導體設備一廠，TS100型倒置顯微鏡購買于NiKon公司，CHK型光學顯微鏡和C-4040ZOOM型Olympus數碼相機購買于Olympus公司，SZ-93自動雙重純水蒸餾器購買于上海亞榮生化儀器廠，HU-6150T型超聲波清洗器購買于上海愛朗儀器有限公司，Adventurer萬分之一電子天平購買于OHAUS公司，BIO-RAD MODEL680型酶標儀購買于BIO-RAD公司，LD5-2A常溫離心機購買于北京醫用離心機廠，UV-260型紫外-可見分光光度計購買于Shimadza公司，LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器購買于上海申安醫療器械廠，TL-2000MM-1型微量振蕩儀購買于江蘇天力醫療器械有限公司，SS01-01型紫外線治療儀購買于上海西格瑪技術有限公司，紫外輻照計購買于北京師范大學光電儀器廠。

1.2方法

1.2.1DDB對超氧陰離子（O2-）的體外清除作用試驗原理：領苯三酚自氧化速率測定法即鄰苯三酚本身無色，其在堿性條件下，可以自氧化成桔酚（桔色），加入抗氧化劑后可抑制其自氧化。在320 nm處檢測鄰苯三酚的吸光度值，從而得到DDB對鄰苯三酚自氧化的抑制率［8］。

本實驗采用維生素C（VC）作為陽性對照。DDB和VC用70%乙醇分別配成濃度0.4 mg/ml、0.8 mg/ml、1.2 mg/ml、1.6 mg/ml、2.0 mg/ml和2.4 mg/ml。

以70%乙醇校正零點，在320nm處測定吸光度值，每個樣品測3次，按公式①計算超氧陰離子的清除率。Q（%）=［Ao-（As-Ai）］/Ao×100%①。

1.2.2MTT法測定DDB、UVB對HaCaT、FB細胞生長的影響及DDB對UVB的防護作用取對數生長期細胞接種于96孔培養板內，每孔100μl（含1×104個細胞），置于37℃，5%二氧化碳溫箱中培養。24 h后，移除培養液，加入50μl MTT溶液（1 mg/ml，PBS配置），37℃孵育4 h，移除上清，每孔加入150μl DMSO溶解甲簪顆粒，震蕩溶解后，用酶標儀檢測550 nm條件處測其光密度值（OD值），分別以不同濃度的的DDB或者不同輻射劑量的UVB為實驗組，以溶劑對照組的細胞為對照組，用公式②計算藥物對細胞的抑制率，并計算細胞存活率：細胞存活率=100-（對照組OD值-加藥組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%②，每次實驗重復3次。

取對數生長期的細胞同以上操作，后用中波紫外線（UVB）段紫外光療儀輻射96孔板中細胞，輻射劑量132 mJ/cm2（輻射密度5.5 mW/cm2，輻射時間240 s），輻射完成后，模型組每孔加入100 ml DDB，對照組加入等量無血清DMEM，培養24 h，然后測量其OD值，同以上操作。

1.2.3Giemsa染色①收集及固定細胞，按上述方法處理好模型組和對照組后，用0.25%的胰酶消化HaCaT細胞，收集細胞，短時低速離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，用pH7.4的PBS洗2次，離心（1 000 r/min，5 min）棄上清，以除去細胞懸液中的細胞碎片，每管加冷70%乙醇1 ml固定，將細胞輕吹成單個細胞，-20℃過夜。②然后離心收集HaCaT細胞，用PBS沖洗HaCaT細胞3次，室溫避光，Giemsa染色應用液染色10 min。通過CHK型光學顯微鏡觀察，Olympus數碼相機照相。

1.2.4激光共聚焦觀察活性氧簇（ROS）及檢測其熒光強度取對數生長期HaCaT細胞，接種于直徑60 mm平皿中（每孔放入1張圓形蓋玻片），每孔加入1 ml（10 000個細胞）HaCaT細胞懸液。24 h后，給藥組加入DDB，對照組加入含0.1%DMSO的空白培養基。2 h后，用PBS洗2遍，加入少許冷PBS（500μl），置于UVB輻射（132 mJ/cm2），輻射完成后，立即加入DCFH-DA（10μmol/L，二氯二氫熒光素雙醋酸鹽，免疫熒光染色劑）PBS溶液。放入37℃，二氧化碳培養箱中培養30min，通過激光共聚焦顯微鏡照相，通過熒光分光光度計檢測其熒光強度。

1.3統計學方法

采用EXCEL軟件和SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。實驗數據均用均數±標準差（x±s）表示，各組之間均數的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1五味子甲素衍生物DDB對O2-的清除能力

圖1為 DDB（0.4～2.4 mg/ml）和 VC（0.4～2.4 mg/ml）對O2-的清除率。結果表明相同濃度DDB具有清除O2-的能力，其清除能力弱于VC。經統計學分析可得出兩者比較標準差為11.005，t=-6.566，查表P＜0.05，因此VC和DDB清除能力不同。

2.2UVB對HaCaT、Fb細胞的影響

UVB對細胞增殖的影響比較明顯。如圖2A所示，和無UVB輻射對照比較，UVB輻射量115.5 mJ/cm2、132 mJ/cm2和148.5 mJ/cm2分別降低HaCaT細胞存活率到（93±1.460）%、（45±4.526）%和（32±2.673）%（P＜0.05），呈劑量依賴性。如圖2B所示降低Fb細胞存活率到（80±2.680）%、（72± 4.020）%和（66±3.550）%（P＜0.05），呈劑量依賴性。由于本實驗細胞凋亡情況不可以太大，以輻射劑量132 mJ/cm2作為UVB細胞損傷模型輻射劑量。

2.3五味子甲素衍生物DDB對HaCaT、FB細胞生長的影響及其對UVB的防護作用

圖1　DDB對?的清除率

圖2　UVB對細胞增殖的影響

圖3　DDB對細胞生長的影響及其對UVB的防護作用

MTT法結果顯示，DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）HaCaT細胞存活率分別為（99±8.219）%，（103± 3.550）%，（111±7.496）%和（108±4.020）%，與正常對照組（79±1.770）%比較均有明顯地增加，如圖3A示；DDB濃度為1×10-4mol/L時，Fb細胞存活率為（98±4.640），存活率有所降低但不明顯，DDB在（1×10-7～1×10-5mol/L）濃度范圍時，Fb細胞存活率為（110±9.319）%、（104±2.615）%、（104± 7.810）%，與正常對照組比較有所增加，結果如圖3B所示。實驗結果表明DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）對HaCaT、Fb細胞無毒性，本次研究選擇這個范圍進行實驗。DDB對UVB的防護作用如圖3C所示，UVB輻射組（77±1.638）%與正常對照組比較，UVB輻射組顯著性抑制了HaCaT細胞的活性；給藥組DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）給藥后，細胞存活率分別為 （90±3.740）%、（102±1.990）%、（104± 9.750）%和（118±3.090）%，與UVB輻射組比較顯著提高。圖3D所示，UVB輻射組（80±2.100）%與正常對照組比較，UVB輻射顯著地抑制了Fb細胞的活性；給藥組DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）給藥后，細胞存活率分別為（100±10.220）%、（102± 6.715）%、（110±5.437）%和（101±5.771）%，與UVB輻射組比較顯著提高。

2.4五味子甲素衍生物DDB對人黑色素細胞黑色素生產的影響

采用酶標儀在405 nm測定其吸光度值，間接反應出人黑色素細胞中黑色素生成量。從圖4可以觀察到DDB（1×10-6～1×10-4mol/L）給藥組黑色素生成量分別為（62±1.870）、（77±0.981）和（39±1.090），與正常人黑色素細胞組比較明顯降低。

2.5形態學觀察五味子甲素衍生物DDB對Ha-CaT細胞的UVB防護作用

Giemsa染色如圖5所示UVB輻射后，細胞產生凋亡，如箭頭所指凋亡細胞。DDB（10-7mol/L）給藥后，凋亡明顯被抑制。

圖4　DDB（1×10-6～1×10-4mol/L）對人黑色素細胞產生黑色素的影響

2.6五味子甲素衍生物DDB抑制HaCaT細胞外ROS的生成

圖5　Giemsa染色法觀察DDB對HaCaT細胞的UVB輻射的防護作用

圖6　DDB對UVB輻射HaCaT細胞產生的ROS清除作用

圖7　熒光法觀察DDB對UVB輻射HaCaT細胞產生的ROS清除作用

本實驗通過檢測HaCaT細胞外總ROS水平，評價DDB的抗氧化作用。如圖6結果表明，UVB輻射組（7.8±0.940）與正常對照組（14±0.790）比較，UVB輻射顯著性升高了HaCaT細胞外總ROS水平；給藥組與UVB對照組比較，DDB（1×10-4）給藥（14±0.540）后，HaCaT細胞外總ROS水平沒有顯著降低，DDB（1×10-7～1×10-5mol/L）給藥后，HaCaT細胞外總ROS水平分別為（12.1±0.380）、（11.4± 0.840）和（10.8±2.570），與UVB對照組比較均顯著性降低。如圖7所示，熒光法顯示ROS產生量，UVB輻射組（圖7B）較正常對照組（圖7A）明顯增多，而給藥組（圖7C、D、E、F）較UVB輻射組減少。

3　討論

經研究表明，不同波段的紫外線，只有中波紫外線到達地面的量最大，而且它對人體的危害也最大。因此，針對中波紫外線對人體造成的危害的機制及該如何預防和治療的研究是目前重點。聯苯雙酯是五味子甲素的一種衍生物，也是一種新型的藥物，是治療病毒性肝炎和藥物性肝損傷引起轉氨酶升高的常用藥物，具有保護肝細胞，增加肝臟的解毒功能的藥理作用。文獻研究表明五味子甲素、乙素及丙素對H2O2對造成細胞的氧化損傷均具有一定的保護作用［9］。因此，在本次試驗研究中，本實驗對五味子甲素衍生物聯苯雙酯的抗氧化損傷進行了探索，實驗結果發現，聯苯雙酯可以清除O2-，具有一定的抗氧化作用，從而起到防護UVB的作用。

波長短能量較高的UVB主要作用于表皮，Ha-CaT細胞占表皮細胞的90%以上，是構成表皮的主要細胞，可吸收輻射到皮膚的UVB的絕大部分；Fb細胞是皮膚真皮中的主體細胞；黑色素細胞是皮膚里的一種特殊細胞，它產生黑色素，傳遞給周圍的HaCaT細胞，皮膚顏色的深淺根本取決于黑色素的含量［10］。因此本實驗以HaCaT、Fb細胞為研究對象，同時對DDB抑制黑色素細胞的作用進行了研究，探討DDB的抗UVB損傷的作用和DDB的美白效果。當 UVB輻射劑量為 30 mJ/cm2、60mJ/cm2及 90 mJ/cm2時，HaCaT細胞的抑制率分別為 3.86%、7.47%及11.67%［11］。本文通過MTT法得到細胞UVB損傷模型最佳UVB輻射劑量為132 mJ/cm2，HaCaT、Fb細胞細胞抑制率分別為55%和45%。在DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）濃度范圍內，UVB輻射對HaCaT、Fb細胞的損傷可以得到明顯的抑制，并且DDB可以抑制黑色素的產生。通過Giemsa染色形態學實驗，觀察對HaCaT細胞的UVB防護作用，直觀的觀察到DDB的UVB防護作用。

氧化應激是指活性氧簇（ROS）產生的細胞毒性反應。生命中ROS的有害影響和積累，一直被認為是導致機體衰老的重要原因之一，研究表明，ROS生成增加和脂質過氧化損傷使線粒體衰老，從而引起生命的衰老［12］。本文通過激光共聚焦觀察HaCaT細胞外總活性氧簇（ROS）的水平及檢測其熒光強度，可以觀察到，DDB（1×10-7～1×10-4mol/L）可以顯著抑制UVB輻射引起的細胞凋亡。

綜上所述，聯苯雙酯對UVB的防護作用的機制可能是通過抑制由UVB輻射引起皮膚氧化應激產生的ROS所產生的細胞毒性反應，并且可抑制UVB輻射引起的細胞損傷，因此聯苯雙酯可用于紫外線防護劑或者化妝品的開發應用。而聯苯雙酯對UVB的防護作用其他有可能的機制以及其應用于臨床的效果還需進一步的研究。

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（張蕾編輯）

Protective effect of SchA derivant Dimethyl dicarboxylate biphenyl against damage of UVB irradiation and its mechanism*

Bo Cao1，Juan-juan Wang2，Shi-ya Chen1，Ting-ting Lu1，Hong Chen1，Li-Qi1
（1.Logistics University of People's Armed Police Force，TianJin 300309，China；2.Medical University Of Tianjin，Tianjin 300070，China）

Objective To evaluate the protective activity of SchA derivant DDB on the UVB-induced skin damage and explore its mechanism.Methods The Anti-oxidation activity against reactive oxygen species（ROS）including superoxide anion radical（O2-）was investigated.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was used to examine the effect of DDB or UVB on HaCaT and Fb cells'viability and its protective effect from UVB's damage.UVB-induced cells apoptosis was visualized with Giemsa stain.Anti-oxidative capacity of the drugs was evaluated by dichlorodihydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）assay.Results In this study，the topical application of DDB after UVB irradiation was found to decrease UVB-induced oxidation damage，the drug had a highly activity of superoxide anion radical（O2-）.Through MTT assay，we found that DDB was found had no damage to cells.Meanwhile，we also find that DDB can decrease human melanoma cell's production.Through Giemsa stain，we visualized that the drug can inhibite UVB induced HaCaT cell death.Conclusions In a word，DDB may be useful in antiphotoaging agents in the treatment of UVB irradiation.

SchA derivant dimethyl dicarboxylate biphenyl；mechanism；UVB

R932

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.005

1005-8982（2016）16-0023-06

2015-12-20

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（青年項目）（No：14JCQNFC10300）；武警后勤學院院級科學基金（No：WHM201308）；國家自然基金資助項目（No：81072964）

齊莉，E-mail：qili3017@sina.com，Tel：13920146924