MicroRNA-134通過下調叉頭框蛋白M1/人基質金屬蛋白酶2表達抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲

丁云，陸肖瑋

（江蘇省無錫市婦幼保健院 乳腺科，江蘇 無錫 214002）

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MicroRNA-134通過下調叉頭框蛋白M1/人基質金屬蛋白酶2表達抑制乳腺癌細胞遷移及侵襲

丁云，陸肖瑋

（江蘇省無錫市婦幼保健院 乳腺科，江蘇 無錫 214002）

目的探討microRNA-134（miR-134）在乳腺癌中的表達及其影響乳腺癌遷移、侵襲能力的分子機制。方法選取2013年1月-2015年2月于本院乳腺病科行手術切除并經病理檢查證實的乳腺導管內原位癌組織30例、乳腺浸潤性導管癌組織35例及正常乳腺組織15例。通過實時定量聚合酶鏈式反應法分別檢測miR-134在腫瘤和正常乳腺組織中的表達，統計分析miR-134表達與患者臨床特征間的相關性；通過miR-134模擬物轉染人乳腺癌MDA-MB-231細胞，采用細胞劃痕愈合試驗評價過表達miR-134對細胞遷移能力的影響，采用Transwell侵襲小室試驗評價過表達miR-134后MDA-MB-231細胞侵襲能力的變化。通過免疫組織化學染色檢測miR-134與下游潛在靶點叉頭框蛋白M1蛋白表達關系，實時定量聚合酶鏈式反應、蛋白免疫印跡檢測轉染miR-134模擬物后其下游潛在靶點叉頭框蛋白M1及下游效應分子人基質金屬蛋白酶2的表達變化。結果miR-134在正常乳腺組織、乳腺導管內原位癌組織及乳腺浸潤性導管癌組織中的表達量依次降低（P＜0.05）。乳腺癌組織中低水平的miR-134與腫瘤淋巴結轉移及高TNM分期顯著相關（P＜0.05）；在體外試驗中，過表達miR-134能夠顯著降低MDA-MB-231細胞的遷移及侵襲能力（P＜0.05）；免疫組織化學染色結果證實miR-134與叉頭框蛋白M1蛋白的表達呈負相關關系（P＜0.05）；實時定量聚合酶鏈式反應及蛋白免疫印記結果顯示，過表達miR-134后可顯著抑制乳腺癌細胞中叉頭框蛋白M1及人基質金屬蛋白酶2的表達水平（P＜0.05）。結論miR-134在乳腺癌組織中表達下調，miR-134可能通過下調叉頭框蛋白M1/人基質金屬蛋白酶2的表達來抑制乳腺癌細胞的遷移及侵襲。

MicroRNA-134；乳腺癌；叉頭框蛋白M1；人基質金屬蛋白酶2；遷移；侵襲

在我國，乳腺癌是嚴重危害女性身體健康的公共衛生問題［1］。乳腺癌病理分型復雜，部分侵襲性較高的病理類型患者治療難度大，易發生淋巴結及遠處器官轉移，預后較差［2］。因此，尋找能夠抑制乳腺癌細胞侵襲能力的分子治療靶點對提高乳腺癌治療效果，延長乳腺癌患者生存時間具有重要意義。

微小RNA（microRNA，以下簡稱：miR）是一類長約19～24個核苷酸的非編碼單鏈短RNA［3］。腫瘤生物學研究成果表明，miR-134能通過抑制包括PAK2［4］、KRAS［5］及WWOX［6］在內多的多個癌基因的表達而實現抗腫瘤效應。目前，miR-134在乳腺癌中的臨床意義及生物學功能尚不清楚。

本研究通過檢測miR-134在不同病理類型的乳腺癌組織中的表達及對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲能力的調控作用，研究miR-134在乳腺癌轉移中的臨床意義及作用機制，為乳腺癌特別是轉移性乳腺癌的分子診斷與靶向治療提供一定的理論依據。

1　資料與方法

1.1臨床標本及主要試劑

選取2013年1月-2015年2月于江蘇省無錫市婦幼保健院乳腺科行手術切除并經病理檢查證實的乳腺導管內原位癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）組織30例、乳腺浸潤性導管癌（invasive breast ductal carcinoma，IBDC）組織35例及正常乳腺組織15例。所有入組患者平均年齡（49.7±3.1）歲。標本切除后行多點取材，分別保存于4%多聚甲醛溶液及液氮當中。Trizol試劑及LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒購自北京天根生物科技有限公司，miR-134qRT-PCR引物試劑盒、miR-134模擬物及陰性對照模擬物均購自廣州銳博生物科技有限公司；叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）引物（正向引物5'-GGGCGCAC GGCGGAAGATGAA-3'；反向引物5'-CCACTCTTCCAAGGGAGGGCTC-3'），人基質金屬蛋白酶2（human matrix metalloproteinase 2，MMP-2）引物（正向引物5'-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3'；反向引物 5'-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3'）及β-actin引物（正向引物 5'-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3'；反向引物5'-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3'）由上海升工生物科技有限公司合成。基質膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國康寧公司。兔抗人FOXM1多克隆抗體（ab83097）、兔抗人MMP-2多克隆抗體（ab37150）及鼠抗人β-actin單克隆抗體（ab6276）購自美國Abcam公司。乳腺癌MDA-MB-231由本實驗室自存。RIPA裂解液、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量試劑盒及增強化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑盒均購自美國密理博公司。

1.2RNA提取及qRT-PCR

采用Trizol試劑通過苯酚-氯仿抽提法提取組織及MDA-MB-231細胞中總RNA。按RT-PCR試劑盒說明書配制逆轉錄反應體系，每反應管內加入500 ng RNA，通過miR-134特異性RT-PCR引物反轉錄miR-134，采用Oligo-dT引物法逆轉錄FOXM1、MMP-2及β-actin mRNA。反轉錄結束后以2μl cDNA進行實時定量熒光聚合酶鏈式反應，按2-ΔΔCT法計算miR-134及FOXM1、MMP-2及β-actin相對表達量。

1.3細胞轉染

MDA-MB-231細胞培養于含10%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的 1×改良 Eagle培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培養基中，穩定傳代2～3代后通過胰酶消化細胞并接種于六孔板中，接種密度以貼壁后融合度在50%左右為準。按LipofectamineTM2000及銳博模擬物轉染說明書，按終濃度100 nmol/孔，分別向MDA-MB-231細胞中轉染miR-134模擬物及空白對照組模擬物。轉染4 h后更換為含10%FBS的完全培養基。

1.4細胞劃痕愈合試驗

取轉染24 h后的MDA-MB-231細胞培養于6孔板中過夜培養至融合度90%以上。吸除原有培養基，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）溶液洗滌細胞兩遍，使用100μl槍頭制作細胞劃痕后使用PBS溶液洗去殘余細胞，使用含5%血清的1×DMEM培養基培養細胞48 h，使用倒置顯微鏡觀察細胞劃痕愈合情況。

1.5Transwell侵襲小室

用1×DMEM培養基稀釋基質膠，按100μl每孔包被Transwell小室底膜上室面。收集轉染48 h后的MDA-MB-231細胞，以無血清DMEM培養基重懸后調整細胞密度為1×105/ml，按250μl每孔接種于 Transwell小室上室中，24孔板內每孔加入750μl含10%血清的DMEM培養基。培養箱內培養24 h后棄去上室內培養基，PBS洗滌2遍后采用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色，棉棒擦去上室面殘余細胞，在顯微鏡下計數下室面細胞數量。

1.6免疫組織化學染色

將組織標本經脫水、石蠟包埋處理，自動切片機制作4μm組織切片，再經二甲苯及梯度酒精脫蠟、水化，于pH 6.0枸櫞酸緩沖液進行抗原熱修復；3%過氧化氫H2O2水溶液阻斷內源性過氧化物酶活性；10%山羊血清封閉滴加兔抗人FOXM1抗體（1∶100），4℃孵育過夜；洗去多余一抗后，加生物素標記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min；洗去殘余未結合二抗，滴加辣根過氧化物酶-鏈酶卵白素復合物進行反應，二氨基聯苯胺顯色、蘇木素復染，常規脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片在高倍鏡（×400）下隨機選取10個視野，按以下標準單獨閱片、評分：染色強度評分：0分：陰性；1分：弱陽性；2分：中度陽性；3分：強陽性。陽性腫瘤細胞百分比評分：陽性細胞≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；75%為4分。每視野評分=染色強度評分×陽性腫瘤細胞百分比評分，切片的最終評分為10個視野的平均得分。

1.7蛋白免疫印跡法（Western blot）

收集轉染72 h的MDA-MB-231細胞，使用RIPA裂解液裂解細胞，BCA法測定總蛋白濃度。每樣本取50μg總蛋白進行垂直電泳分離，采用濕轉法進行轉膜后以1∶1 000稀釋的FOXM1、MMP-2及β-actin一抗結合相應目的蛋白，以1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗兔或羊抗鼠二抗結合一抗，ECL法發光檢測蛋白相對表達量。

1.8統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1乳腺癌組織中miR-134的表達變化

通過qRT-PCR檢測發現，與正常乳腺組織比較，DCIS組織中miR-134的相對表達量為（0.475± 0.031），而IBDC組織中表達則更低僅為（0.281± 0.147）。對兩組結果進行統計學分析證實，miR-134在正常乳腺組織、DCIS組織及IBDC組織中的表達水平依次降低（F=3.841，P=0.037）。提示miR-134的表達量與乳腺癌侵襲能力相關。見圖1。

2.2乳腺癌組織中miR-134表達與患者臨床病理特點間的相關性

筆者將65例患者的臨床數據和病理診斷資料進行二分類后，分別計算miR-134在不同特征分類下的相對表達量。存在腫瘤淋巴結轉移及高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ期）的患者乳腺癌組織中miR-134的表達量更低。提示miR-134在調控乳腺癌侵襲過程中可能具有一定作用。見附表。

圖1　miR-134在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達

附表　miR-134表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系（n=65±s）

附表　miR-134表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系（n=65±s）

注：1）與存在淋巴結轉移組比較，P＜0.05；2）與III+IV期比較，P＜0.01

2.3miR-134對MDA-MB-231細胞遷移及侵襲能力的影響

通過在MDA-MB-231細胞中轉染miR-134模擬物過表達miR-134后，采用劃痕愈合試驗證明過表達miR-134能夠顯著抑制乳腺癌細胞的遷移（42.93±4.81）vs（70.96±4.33）（t=9.203，P=0.007）。進一步的Transwell侵襲小室檢測結果表明過表達miR-134也能夠抑制MDA-MB-231細胞的侵襲能力（19.16±1.78）vs（33.41±2.15）（t=8.727，P=0.009）。見圖2。

2.4miR-134靶向下調MDA-MB-231細胞中FOXM1表達

FOXM1是近年來新發現的一種腫瘤轉錄激活因子。通過生物信息學數據庫檢索發現，FOXM1是miR-134的潛在靶點，進一步的體外研究結果表明在MDA-MB-231細胞內過表達miR-134能夠顯著下調 FOXM1 mRNA（1.000±0.000）vs（0.371± 0.018）（t=34.487，P＜0.001）的表達。除此之外，筆者在乳腺癌組織標本中也證實miR-134和FOXM1蛋白表達呈顯著負相關 ［DCIS組：（8.785±1.032）vs（4.371±1.214）（t=2.401，P=0.031）；IBDC組：（12.026±3.741）vs（6.128±1.306）（t=2.583，P= 0.028）］，提示miR-134對FOXM1的表達具有負向調控作用。MMP-2是基質金屬蛋白酶家族重要成員之一，對多種腫瘤細胞的侵襲、轉移具有促進作用，既往研究表明，FOXM1能夠促進MMP2的轉錄以提高細胞中MMP-2的表達水平，筆者的研究證實過表達miR-134可以下調MMP-2的表達（1.000± 0.000）vs（0.412±0.033）（t=30.024，P＜0.001）。見圖3、4。

圖2　過表達miR-134對MDA-MB-231細胞遷移及侵襲能力的影響

圖3　miR-134與FOXM1表達相關性

圖4　過表達miR-134對MDA-MB-231細胞FOXM1及MMP-2表達的影響

3　討論

乳腺癌是我國女性發病率最高的惡性腫瘤。乳腺癌病理類型復雜，腫瘤異質性高［7］，乳腺癌的淋巴結及遠處器官轉移是限制患者治療效果及預后的主要因素之一。近年來，microRNA在乳腺癌侵襲轉移過程中發揮了重要的調控作用。例如，miR-99家族能通過抑制TGF-β/SMAD3通路的活化來抑制乳腺癌細胞的遷移及侵襲能力［8］。

miR-134是近年來新發現的一種具有多種生物學功能的microRNA。神經生物學研究表明，在腦神經組織缺血再灌注過程中，高水平的miR-134能夠通過下調Bcl-2的表達促進神經細胞凋亡［9］。而在包括腎癌、骨肉瘤在內的多種人類惡性腫瘤中miR-134都呈現低表達趨勢并與腫瘤惡性生物學行為相關，提示miR-134可能是一種具有抑癌作用的microRNA［10-11］。

在本研究中，筆者通過檢測證實，乳腺癌中miR-134表達水平顯著降低。更重要的是，與乳腺導管內原位癌組織比較，侵襲性較高的IBDC組中的miR-134表達量更低。同時，筆者通過分析不同臨床病理特征分類下miR-134的表達量發現，miR-134低表達與乳腺癌患者淋巴結轉移及高TNM分期密切相關。上述結果提示，miR-134對腫瘤侵襲、轉移可能具有一定的抑制作用。在體外，筆者通過基因轉染過表達miR-134后采用細胞劃痕愈合試驗和Transwell侵襲小室試驗證實過表達miR-134能夠抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，在微觀上闡明了miR-134對乳腺癌侵襲轉移的抑制作用。

FOXM1是一種重要的轉錄因子，由于其在多種人類惡性腫瘤中都高表達，因而其具有重要的腫瘤靶向治療價值［12］。包括miR-204［13］、miR-370［14］及miR-877［15］在內多個microRNA都能通過下調FOXM1的表達抑制腫瘤進展。本課題中，筆者通過生物信息學檢索發現，FOXM1也是miR-134的下游靶點之一。在體外試驗中，筆者在MDA-MB-231細胞中的研究發現，過表達miR-134能夠顯著降低FOXM1的表達水平，提示FOXM1是miR-134在乳腺癌細胞中的有效靶點。基質金屬蛋白酶是腫瘤細胞發生侵襲轉移的直接效應分子，筆者通過文獻檢索［16］發現，FOXM1能夠結合在MMP-2的啟動子區域并促進其轉錄激活。筆者通過qRT-PCR及Western blot檢測證實，轉染miR-134在下調FOXM1的同時也能夠降低MMP-2的表達。因而，筆者初步推斷miR-134抑制乳腺癌細胞侵襲時通過抑制FOXM1/MMP-2表達實現的。

綜上所述，miR-134在乳腺導管癌組織中表達顯著降低。miR-134可能通過下FOXM1/MMP-2的表達來抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲。

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（張蕾編輯）

MicroRNA-134inhibits cell migration and invasion by targeting forkhead box protein M1/human matrix metalloproteinase 2 in breast carcinoma

Yun Ding，Xiao-wei Lu
（Department of Breast Surgery，Wuxi Hospital for Maternal and Child Health Care，Wuxi，Jiangsu 214002，China）

Objective To investigate the expression ofmicroRNA-134（miR-134）in female breast carcinoma and its role for tumor cell migration and invasion.Methods Between January 2013 and February 2015，30 ductal carcinomain situ（DCIS）tissues，35 invasive breast ductal carcinoma（IBDC）tissues and 15 normal breast tissues were collected and investigated.The expressions ofmiR-134were detected by qRT-PCR.The relationship between miR-134and clinical features was analyzed by student-t test.miR-134mimics was transfected intoMDA-MB-231 cells.Wound healing assay and transwell assay were used to measure cell migration and invasion，respectively.The correlation betweenmiR-134and forkhead box protein M1，a potential target ofmiR-134，was analyzed by IHC staining.The expression changes of M1 and downstream effector molecules of humanMMP2in the potential target ofthe downstream potential target aftermicroRNA-134mimics infection were detected by qRT-PCR and western blotting.Results The expression ofMiR-134was significantly gradually decreased from normal breast tissue，in situ breast ductal carcinoma and invasive ductal carcinoma of the breast.The low expression ofMiR-134in breast cancer was significantly correlated with tumor lymph node metastasis and TNM stage（P＜0.05）.The migration and invasion of MDA-MB-231 cells capability were significantly reduced by over expression ofMiR-134in vitro.The expression ofmiR-134and the fork head boxM1was negative correlation confirmed by IHC（P＜0.05）.The results of qRT-PCR and western blotting showed over expression ofMiR-134could suppress breast cancer cells forkhead box proteinM1andMMP2expression level（P＜0.05）.ConclusionsMiR-134expression is down regulated in breast cancer tissues.miR-134may inhibit the migration and invasion of breast cancer cells by down regulating the expression ofM1/MMP2 2.

microRNA-134；breast cancer；fork head box protein M1；human matrix metalloproteinase 2；migration；invasion

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.16.009

1005-8982（2016）16-0043-06

2016-01-06

陸肖瑋，E-mail：13815100097@126.com